快速冷馴化條件下稻水象甲內(nèi)參基因的篩選及LoTPS基因表達

祁立中,王 曉,王慶泰,王 尚,張炬紅

(吉林大學 植物科學學院,吉林 長春 130062)

稻水象甲(LissorhoptrusoryzophilusKuschel)是一種對水稻危害極強的世界性檢疫害蟲[1],也是我國農(nóng)業(yè)上重要的植物檢疫性害蟲之一。稻水象甲首次被發(fā)現(xiàn)是在1800年的密西西比河流域,1988年5月在我國河北省唐山市唐?？h發(fā)現(xiàn),目前,在我國大部分水稻種植區(qū)域均有報道[2]。在稻水象甲生長發(fā)育過程中溫度發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,影響其越冬蟲源基數(shù)、成蟲出土時間、遷飛規(guī)律、種群消長規(guī)律及危害[3-5]。稻水象甲耐寒能力較強,在我國黑龍江省局部地區(qū)已成功入侵[2],表現(xiàn)了對低溫的強大適應(yīng)能力。有研究表明,稻水象甲滯育期成蟲體內(nèi)海藻糖含量高于生長發(fā)育期,稻水象甲可通過提高海藻糖含量提升自身對低溫的適應(yīng)能力[6],稻水象甲滯育期的海藻糖合成酶基因上調(diào)表達[7-8]。目前,海藻糖合成酶作為害蟲控制的重要靶標已經(jīng)引起了許多生物學家的廣泛關(guān)注,基于對海藻糖合成酶的影響,RNAi技術(shù)和海藻糖合成酶抑制劑的開發(fā)可以為稻水象甲的綠色防控提供新思路。

實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qPCR)作為基因表達水平分析的一種重要方法[9],因其具有準確、快速、特異性強等特點,在分子生物學研究中被廣泛應(yīng)用[10]。但是qPCR的實際應(yīng)用過程中會受模板質(zhì)量、聚合酶活性和引物擴增效率等因素影響對結(jié)果造成誤差[11]。為了消除此類誤差,需要一類可以穩(wěn)定表達的基因作為內(nèi)參基因?qū)PCR結(jié)果進行校正,進而保證結(jié)果的準確性[12]。因管家基因如肌動蛋白基因(ACT)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)等是一類參與細胞生命活動維持的基因,并且通常假定它們在不同的測試條件下表達一致,在對目的基因進行標準化時長被用作內(nèi)參基因。目前,針對昆蟲利用qPCR 技術(shù)進行內(nèi)參基因篩選報道很多,但多數(shù)研究結(jié)果表明,內(nèi)參基因可能在不同的環(huán)境條件下會出現(xiàn)表達水平的變化[13-14]。因此,在進行基因表達水平分析前,有必要在特定條件下分析和評估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。

為了進一步研究稻水象甲體內(nèi)海藻糖代謝通路相關(guān)基因的表達和功能,本研究基于前期測得的稻水象甲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出10條候內(nèi)參選基因,在評價和分析其qPCR表達穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上選擇適合不同快速冷馴化條件下的內(nèi)參基因,進一步分析海藻糖合成酶基因LoTPS在快速冷馴化條件下的表達模式,旨在為LoTPS基因在稻水象甲低溫適應(yīng)性中的作用機制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試昆蟲

稻水象甲成蟲:2020年6月采集自吉林省長春市鄭家屯水稻田,飼養(yǎng)于實驗室盆栽水稻內(nèi)備用。飼養(yǎng)溫度為(25±2)℃,光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑RNAiso Plus(TaKaRa,日本)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScripTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(諾唯贊,中國)、2×SGExcel Fast SYBR Mixture(With ROX)(生工,中國);熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,美國);冰箱(海爾,中國);超微量分光光度計(Bio-RedTM,美國);-80 ℃超低溫冰箱(Panasonic,日本)。

1.3 快速冷馴化處理

選取個體大小一致,發(fā)育狀況良好的稻水象甲成蟲,分別于0 ℃(誘導溫度)低溫下冷馴化處理4,6,8,10 h。冷馴化結(jié)束后,將存活成蟲立即轉(zhuǎn)移至-8 ℃(檢測溫度)處理2 h[8],調(diào)查成蟲死亡情況。分別以室溫飼養(yǎng)和未經(jīng)快速冷馴化從室溫直接轉(zhuǎn)移到-8 ℃處理2 h的成蟲為對照,分析快速冷馴化對稻水象甲成蟲低溫適應(yīng)性的影響。每處理18頭成蟲,重復5次。將各處理存活的成蟲經(jīng)液氮快速冷凍后,放-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取及cDNA合成

參照RNAiso Plus試劑使用說明書提取稻水象甲成蟲總RNA,并通過超微量分光光度計檢測其純度和濃度。取500 ng檢測合格的RNA后,cDNA的合成按照PrimeScripTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作說明進行。

1.5 內(nèi)參基因的篩選和克隆

通過查閱實驗室前期測定的稻水象甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,并參考常用昆蟲內(nèi)參基因[15-18],選擇15個具有完整開放閱讀框的基因作為候選基因,經(jīng)NCBI Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對與其他昆蟲同源基因序列的相似性驗證分析之后,確定其中11個序列為候選基因。

PCR擴增時以常溫條件下飼養(yǎng)的稻水象甲成蟲為試驗材料提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA為模板,通過Primer Primer 5.0軟件設(shè)計的引物(表1),進行PCR克隆。PCR反應(yīng)體系(25 μL):cDNA模板1 μL,正反引物(10 μmol/L)各1 μL,2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,dNTP 0.5 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL,最后補加9.5 μL的ddH2O。擴增條件:95 ℃ 3 min預(yù)變性;95 ℃ 15 s變性,55 ℃ 15 s退火,72 ℃ 30 s延伸,共35個循環(huán);徹底延伸5 min。最后經(jīng)1%凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

表1 PCR和實時熒光定量PCR引物Tab.1 Primers for PCR and qPCR

1.6 熒光定量PCR

以稻水象甲成蟲合成的cDNA 為模板,表1設(shè)計的引物進行熒光定量PCR試驗。總反應(yīng)體系為10 μL:包括5 μL的2×SGExcel Fast SYBR Mixture,1 μL的cDNA模板,各0.4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)和3.2 μL的 ddH2O。按照以下程序進行擴增:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性 10 s,55 ℃ 退火30 s,進行40個循環(huán);溶解曲線:65～95 ℃,每個循環(huán)上升0.5 ℃。每個樣品均進行3次生物學重復和3個技術(shù)重復。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)繪制的溶解曲線分析引物的特異性。

1.7 內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性分析

采用ΔCt、geNorm[19]、BestKeeper[12]和NormFinder[20]4種方法綜合分析待選內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性。ΔCt法通過候選基因在每個處理中的相對表達豐度來確定最適內(nèi)參基因,通常Ct值為15～30。geNorm通過計算平均變異度(Mean variability,M)來確定最適內(nèi)參基因,要求M<1.50,且M值越小說明候選基因越穩(wěn)定。Norm Finder根據(jù)各基因表達穩(wěn)定值(Stability value,SV),篩選出最適的內(nèi)參基因,SV越小表明基因表達越穩(wěn)定。BestKeeper軟件首先比較每個基因之間Ct值產(chǎn)生變異系數(shù)(CV)和標準偏差(s)來判斷內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性,然后依據(jù)s和CV值的大小進行排序分析,s和CV值越大,表明內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定性越差;反之,穩(wěn)定性越好。上述方法中,geNorm和NormFinder輸入數(shù)據(jù)時需要將Ct值進行 2ΔCt的轉(zhuǎn)化,ΔCt和BestKeeper輸入原始數(shù)據(jù)即可。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,用單因素方差分析(Anova)對數(shù)據(jù)進行處理,用鄧肯新復極差法進行多重比較,分析不同快速冷馴化條件下LoTPS基因的表達差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參基因的篩選

根據(jù)稻水象甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)注釋結(jié)果,篩選出15個包含完整開放閱讀框(ORF)的管家基因作為候選基因,使用DNAMAN 5.0將核苷酸序列翻譯為蛋白序列,通過NCBI Blast進一步比對后,選擇11個一致性較高,E值較小的序列為候選內(nèi)參基因。根據(jù)Blast最佳匹配項命名,分別為核糖體蛋白L18、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、核糖體蛋白S27、11S核糖體蛋白、TATA盒結(jié)合蛋白、核糖體蛋白L13、18S核糖體蛋白、3S核糖體蛋白、α-微管蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和精氨酸激酶(表2)。除RPS3和α-tubulin基因外,其余基因均與象甲科昆蟲基因序列一致性較高。

表2 候選內(nèi)參基因的Blast篩選Tab.2 Blast screening of candidate reference genes

2.2 引物特異性評價

以常溫條件下飼養(yǎng)的稻水象甲成蟲cDNA為模板,對11條候選基因進行qPCR擴增,電泳檢測結(jié)果表明,除RPS3外,其余10對基因均獲得單一且明亮的條帶,產(chǎn)物長度與軟件預(yù)測長度相似(圖1),確定了克隆基因的正確性與特異性。進一步驗證10條基因在不同處理下的qPCR表達結(jié)果表明,10條內(nèi)參基因引物的溶解曲線均有明顯單一峰值,即無非特異性擴增,表明所設(shè)計引物具有較好的特異性。

M.2000 DNA 標準分子量;1.RPL13基因;2.G6DPH基因;3.RPS11基因;4.α-tubulin基因;5.RPL18基因;6.RPL27基因;7.GADPH基因;8.TBP基因;9.AK基因;10.RPS18基因。M.2000 DNA Marker;1.RPL13 gene;2.G6DPH gene;3.RPS11 gene;4.α-tubulin gene;5.RPL18 gene;6.RPL27 gene;7.GADPH gene;8.TBP gene;9.AK gene;10.RPS18 gene.

2.3 候選內(nèi)參基因的表達水平分析

內(nèi)參基因的表達豐度是篩選內(nèi)參基因的首要條件,由Ct值變化可知,在不同快速冷馴化條件下,各候選基因均具有較高表達,但表達量不同(圖2)。通常Ct值應(yīng)為15～30,除TBP(22.48～33.61)、RPS11(29.36～37.41)表達略低以外,其他候選基因的Ct值均在此范圍以內(nèi),其中RPS18Ct值最低,表達量最高,其次為RPS27。

稻水象甲候選內(nèi)參基因表達水平由不同處理的原始Ct 值表示。箱型上下線分別為上四分位數(shù)和下四分位數(shù),中線為中位數(shù),中垂線的上下限分別為最大值和最小值。The expression level was shown in terms of the raw cycle threshold number(Ct value)of the candidate reference genes of L.oryzophilus under different treatment conditions.The box represents the values between the 25 th and 75th percentiles,the line in the box indicates the median value,and the whisker caps denote the minimal to maximal value．

2.4 基于geNorm軟件對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

經(jīng)geNorm軟件對候選基因表達穩(wěn)定度M值的比較分析表明,除RPS11外,其他內(nèi)參基因的M值均小于0.7,表明這9個基因可以作為不同快速冷馴化條件下基因表達分析的內(nèi)參基因使用,各候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性順序依次為G6DPH>RPS18>RPL18>RPS27>GADPH>α-tubulin>AK>RPL13>TBP>RPS11(圖3)。

圖3 利用geNorm軟件對各候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性的分析Fig.3 Expression stability anlysis of candidate reference genes by the geNorm software

2.5 基于NormFinder軟件對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價

通過NormFinder軟件對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析,發(fā)現(xiàn)各內(nèi)參基因穩(wěn)定性有一定的差異,排序依次為:G6DPH>RPS18>RPS27>RPL18>GADPH>α-tubulin>AK>RPL13>TBP>RPS11,與geNorm 分析結(jié)果基本一致,其中G6DPH穩(wěn)定性最好,其次為RPS18,RPS11最差(圖4)。

圖4 NormFinder軟件分析各候選內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值Fig.4 Expression stability values of candidate reference genes by the NormFinder software

2.6 基于BestKeeper軟件對候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

根據(jù)BestKeeper軟件對10個候選內(nèi)參基因標準差(s)大小比較分析結(jié)果,其表達穩(wěn)定性排列順序依次是:RPL13>α-tubulin>GADPH>RPS27>G6DPH>RPS18>RPL18>RPS11>AK>TBP;根據(jù)變異系數(shù)(CV)表達穩(wěn)定性排序為α-tubulin>RPL13>RPS11>G6DPH>GADPH>RPS27>TBP>RPL18>AK>RPS18(表3)。

表3 BestKeeper軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性Tab.3 The expression stability analysis of candidate genes by BestKeeper software

2.7 綜合分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性

本研究通過內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價的常用軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper以及ΔCt法,對10條候選內(nèi)參基因進行分析,綜合分析結(jié)果表明,除BestKeeper軟件外,ΔCt法及geNorm和NormFinder 2種軟件分析結(jié)果基本一致。表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因為RPS18、G6DPH、RPS27和RPL18,有3類編碼核糖體蛋白的基因,RPS3和RPS11在低溫處理過后Ct值波動范圍較小,但表達豐度最低,不適合做內(nèi)參基因(表4)。根據(jù)表4進行綜合評價后發(fā)現(xiàn),在快速冷馴化條件下,稻水象甲體內(nèi)表達相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因是RPS18和G6DPH,但G6DPH基因表達豐度較低,故選擇RPS18為本研究所用內(nèi)參基因。

2.8 LoTPS基因在不同快速冷馴化條件下的表達模式

通過對候選內(nèi)參基因在快速冷馴化條件下穩(wěn)定性的綜合評價和分析后,以RPS18為內(nèi)參基因測定了稻水象甲海藻糖合成酶基因LoTPS在快速冷馴化條件下的表達模式。由圖5可見,經(jīng)過快速冷馴化后稻水象甲成蟲體內(nèi)LoTPS基因表達量有所增加,隨著冷馴化時間的延長,LoTPS基因表達量顯著升高。與CK和Non-RCH相比,快速冷馴化4 h(RCH-4)后,其表達量分別提高了1.84,1.80倍,但與馴化6 h的成蟲之間無顯著差異,馴化8,10 h后,其表達量顯著增加。Non-RCH的成蟲與CK間LoTPS基因表達量無顯著差異。

CK.常溫飼養(yǎng);Non-RCH.不經(jīng)歷快速冷馴化直接-8 ℃暴露2 h;RCH-4.快速冷馴化處理4 h;RCH-6.快速冷馴化處理6 h;RCH-8.快速冷馴化處理8 h;RCH-10.快速冷馴化處理10 h。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。CK.Normal feed;Non-RCH.Explosion 2 h under-8 ℃ without RCH;RCH-4.RCH treatment for 4 h; RCH-6.RCH treatment for 6 h;RCH-8.RCH treatment for 8 h;RCH-10.RCH treatment for 10 h.Different letters above bars mean significant differences(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

qPCR技術(shù)是一種高效、簡便的基因表達分析方法,選擇合適的內(nèi)參基因是實現(xiàn) qPCR 可靠性的基本要求。內(nèi)參基因作為一類可以在不同物種、不同組織、不同發(fā)育時期和不同處理中均能穩(wěn)定表達的基因,是直接影響實時熒光定量PCR結(jié)果的一個主要因素。但隨著越來越多的研究發(fā)現(xiàn),沒有一種“萬能的”內(nèi)參基因可以在任何條件下均穩(wěn)定表達。因此,使用計算程序如BestKeeper、NormFinder和 geNorm等來評估內(nèi)參基因的性能,并確定特定物種或生物樣品在測定條件下的最佳內(nèi)參基因是十分必要的。李曉等[11]在鞘翅目大灰象甲(Sympiezomiasvelatus)成蟲體內(nèi),篩選出TUB、TUA、RPS20和RPL20可以作為其成蟲不同組織中基因表達水平的內(nèi)參基因;Xie等[21-22]卻發(fā)現(xiàn)在華北大黑鰓金龜(Holotrichiaoblita)中RPL13a和RPL18能在不同發(fā)育時期,不同組織和不同溫度處理下可穩(wěn)定表達,Xie等和Xu等[21-22]發(fā)現(xiàn)RPS18和RPL18在華北大黑鰓金龜?shù)牟煌詣e和苜蓿切葉蜜蜂(Megachilerotundata)的不同生育階段及不同環(huán)境條件下均可穩(wěn)定表達。在馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)的不同發(fā)育階段和不同組織中能穩(wěn)定表達的是RP4和RP8內(nèi)參基因[23]。家蠅在不同發(fā)育時期、不同組織的RNA干擾和饑餓脅迫下,RPS26和RPL23的組合適用于所有供試樣品[18];賈冰等[24]發(fā)現(xiàn)溫度、殺蟲劑和幼蟲發(fā)育歷期等條件的變化能夠影響牧草盲蝽內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。以上研究均表明,曾很長時間認為穩(wěn)定的管家基因表達可隨測試條件而發(fā)生變化。

稻水象甲在我國是一種危害性極強的外來入侵害蟲,對我國水稻生產(chǎn)安全有極大的威脅。本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,篩選出10個候選內(nèi)參基因,對其在不同快速冷馴化條件下的穩(wěn)定性進行篩選,選擇合適的內(nèi)參基因后分析海藻糖合成酶基因在快速冷馴化條件下的表達模式,以期為相關(guān)基因在稻水象甲入侵和擴散過程中的作用和功能研究奠定基礎(chǔ)。分別采用ΔCt法和geNorm、NormFinder和BestKeeper 3種軟件對篩選的10個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行評估,結(jié)果表明:在不同快速冷馴化條件下,不同重復間內(nèi)參基因表達較穩(wěn)定,不同處理間表達穩(wěn)定性不同,說明常用的內(nèi)參基因在快速冷馴化條件下,表達并不穩(wěn)定。geNorm和NormFinder分析結(jié)果趨勢基本相同,但均與BestKeeper分析結(jié)果有所差異,在geNorm軟件中穩(wěn)定性排名前四的內(nèi)參基因為G6DPH、RPS18、RPL18和RPS27,根據(jù)NormFinder軟件分析排名前四的基因與前者相同,只是次序有所不同,而BestKeeper分析的結(jié)果與前兩者均不相同,有較大差異,主要原因可能是3種軟件的計算原理不同。在其他昆蟲的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象,如瓜實蠅(Bactroceracucurbitae)、大灰象甲和松墨天牛(Monochamusalternatus)等。為了消除不同軟件分析的差異,可以通過將所有軟件的分析結(jié)果進行綜合排序來評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,得到最終排名結(jié)果,本試驗篩選出在快速冷馴化條件下表達穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因為RPS18。

本研究對快速冷馴化條件下稻水象甲的內(nèi)參基因進行了篩選,發(fā)現(xiàn)在稻水象甲體內(nèi)可以穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因是RPS18,以其為內(nèi)參基因進一步對LoTPS基因在快速冷馴化條件下的表達模式進行了分析,結(jié)果表明,稻水象甲成蟲經(jīng)歷快速冷馴化后LoTPS基因表達量顯著增加,這可能有助于提高其成蟲在低溫下的適應(yīng)能力,使其順利度過早春及初冬氣溫不穩(wěn)定的冷熱交替季節(jié)。