東北林蛙LEPR基因的克隆及其在感染中的表達(dá)分析

許冬梅,劉婷婷,劉依銘,劉玉芬,劉 鵬,趙文閣

(哈爾濱師范大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150025)

瘦素(Leptin,LEP)是一種由脂肪組織分泌的16 ku蛋白激素,屬于Ⅰ類α螺旋細(xì)胞因子,目前已在哺乳類、魚類和鳥類等多種脊椎動(dòng)物中廣泛開展研究[1-3]。LEP與瘦素受體(Leptin receptor,LEPR)結(jié)合后,發(fā)揮脂質(zhì)代謝和能量平衡[4]、生殖[5]、造血[6]、骨形成[7]和參與免疫反應(yīng)[8]。近年來研究[9-10]顯示,在動(dòng)物體LEP和LEPR可作為一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì),起到調(diào)節(jié)炎癥和免疫應(yīng)答作用。LEPR基因最早在小鼠脈絡(luò)膜叢克隆出來,歸入Ⅰ類細(xì)胞因子受體超家族[11],具有一次跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞膜蛋白。LEPR基因具有多態(tài)性,在哺乳動(dòng)物中主要分為長型、短型、分泌型3類6種亞型,即LEPR-a、LEPR-b、 LEPR-c、LEPR-d、LEPR-e、LEPR-f 6種,其中長型LEPR-b具有完整功能結(jié)構(gòu)域,是具有完整細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)功能的受體。LEPR-e沒有跨膜結(jié)構(gòu)域,所以是一種分泌型受體,其他短型受體可能在血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用[12]。人類的長型LEPR-b在胞內(nèi)具有完備的功能結(jié)構(gòu)域,包括Box1、Box2和3個(gè)保守的酪氨酸殘基,這些特征已經(jīng)在多種脊椎動(dòng)物中被鑒定[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)[16],LEPR能夠激活Janus 激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)和絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)2個(gè)信號通路,發(fā)揮多種生物學(xué)功能。研究也證明,LEPR在多種免疫細(xì)胞上廣泛表達(dá),如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等,表明LEPR與免疫應(yīng)答具有相關(guān)性[17-18]。目前已知非洲爪蟾的LEPR與人類LEPR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相對應(yīng),推測生物學(xué)功能相似[19];峨眉樹蛙LEPR基因與繁殖功能的相關(guān)性也進(jìn)行了確認(rèn)研究[20];也有研究證實(shí),溫度對蟾蜍體內(nèi)LEP信號通路和LEPR基因表達(dá)也存在影響[21],而LEPR基因與兩棲類免疫應(yīng)答的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。

東北林蛙具有抵抗寒冷環(huán)境和適應(yīng)能力強(qiáng)的特性,其輸卵管干制品可入藥,具有藥用價(jià)值[22-23]。近年來因東北林蛙經(jīng)濟(jì)價(jià)值大,被大肆捕撈,加上森林的砍伐、污水的排放、農(nóng)藥的施用和病原體的侵染,使野生東北林蛙數(shù)量銳減。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila,Ah)是東北林蛙患紅腿病的元兇,該病傳染能力強(qiáng)、致死率高,是野生和人工養(yǎng)殖蛙群數(shù)量減少的原因之一[24-25]。本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆東北林蛙LEPR基因,以Ah作為感染菌種,構(gòu)建東北林蛙人工感染模型,利用qRT-PCR技術(shù)檢測LEPR基因在不同組織的轉(zhuǎn)錄水平的變化;再利用免疫組化染色驗(yàn)證LEPR蛋白表達(dá)量變化,本試驗(yàn)旨在為進(jìn)一步探究LEPR基因在炎癥反應(yīng)中的免疫功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品采集 東北林蛙成體(25±5)g,嗜水氣單胞菌株DW1701-1909(Ah)由哈爾濱師范大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定[26]。對照組和試驗(yàn)組嚴(yán)格遵照相關(guān)試驗(yàn)動(dòng)物福利規(guī)定(批準(zhǔn)號HNUARTA202102),安樂死后分別在8,16,24,36,48,72 h采集東北林蛙心臟、肝臟、脾臟、腎臟、皮膚、肌肉和胃等部分組織樣品。用任氏液清洗干凈后用滅菌剪刀剪小塊,先放入液氮速凍后再放入EP管內(nèi),放置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?另取肝臟、腎臟、皮膚和肌肉作為固定樣品,用于制作石蠟切片。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 TRIzol 試劑盒、dNTP Mix、10×Taq Buffer、TaqDNA Polymerase、DNA Marker(DL2000)、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、HiScript Ⅱ Q RT Super Mix for qPCR(+gDNA wiper)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix,均購于南京諾唯贊(Vazyme)生物科技有限公司;膠回收試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司;pMDTM18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司;感受態(tài)細(xì)胞 DH5α購于上海唯地生物技術(shù)有限公司; LEPR兔源多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體 IgG(H+L)、10%封閉山羊血清、中性樹膠封片劑均購于博奧森(北京)生物技術(shù)有限公司;DAB顯色試劑盒(20×)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;福爾馬林溶液、蘇木精染色液等均為常規(guī)國產(chǎn)化學(xué)試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 活化菌種及感染東北林蛙 依據(jù)參考文獻(xiàn)[26]活化菌種并確定感染濃度為1.5×107cfu/mL。東北林蛙隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組,每組21只,對照組每只注射1 mL的液體LB培養(yǎng)基,試驗(yàn)組每只腹腔注射1 mL 嗜水氣單胞菌液,取樣后放置-80 ℃冰箱儲(chǔ)存,為后續(xù)試驗(yàn)準(zhǔn)備。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的歐洲林蛙預(yù)測LEPRmRNA序列(登錄號:XM_040360759.1),利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),共設(shè)計(jì)4對引物(LEPR-A、LEPR-B、LEPR-C、LEPR-D),測序后進(jìn)行拼接得到完整ORF區(qū)。再依據(jù)該序列設(shè)計(jì)熒光定量引物(LEPR-q),內(nèi)參引物選用β-actin[27],以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物詳細(xì)信息見表1。

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.3 東北林蛙的組織RNA提取及cDNA的合成 將8種組織各0.1 g加入液氮充分研磨后置于EP管內(nèi),利用TRIzol 法提取組織中總RNA,1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整度,有清晰的3條帶。依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,置于-20 ℃冰箱凍存,為后續(xù)試驗(yàn)準(zhǔn)備。

1.2.4 東北林蛙LEPR基因的克隆與測序 取東北林蛙脾臟cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系配置依照Taq plus DNA 聚合酶說明書,1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物是否與預(yù)期相符,利用膠回收試劑盒進(jìn)行DNA的回收與純化,將得到DNA片段與pMD18-T在16 ℃ 低溫恒溫槽中連接6 h,隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),挑取單一菌落接入LB 液體培養(yǎng)基(有AMP+)中培養(yǎng)12 h,進(jìn)行菌液PCR反應(yīng),經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,將得到陽性菌株送至哈爾濱睿博科興公司進(jìn)行測序。

1.2.5 東北林蛙LEPR生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN、MEGA7 和 SMART(http://smart.embl.de)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、I-TASSER(http://zhanggroup.org /I-TASSER/)、 SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpredsopma.pl)等軟件進(jìn)行東北林蛙LEPR核苷酸和氨基酸序列分析;采用PROSITE(https://www.expasy.org/resources/prosite)、 ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)以及ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)、NetPhos3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)NetNGlyc-1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)等程序預(yù)測蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域及理化性質(zhì),用Clustal Omega軟件對LEPR氨基酸序列進(jìn)行同源性比對。

1.2.6 蘇木精-伊紅染色分析(Hematoxylin-eosin staining,HE染色) 取東北林蛙對照組和試驗(yàn)組肝臟和皮膚組織,經(jīng)10%福爾馬林溶液固定后用石蠟包埋,制作病理組織切片。HE染色方法參考文獻(xiàn)[26],常規(guī)脫蠟復(fù)水后蘇木精染色,1%的鹽酸乙醇溶液進(jìn)行分化,1%的氨水返藍(lán),蒸餾水沖洗,后進(jìn)行0.5%伊紅染液染色。染色完成后進(jìn)行不同濃度酒精脫水和二甲苯透明,最后用中性樹膠封片。

1.2.7 東北林蛙LEPR組織表達(dá)分析 依據(jù)獲得的序列結(jié)果,設(shè)計(jì)LEPR的特異性引物,采用qRT-PCR技術(shù)檢測LEPR基因在對照組與試驗(yàn)組感染后的不同時(shí)間點(diǎn)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉和胃等組織中的表達(dá)量。qRT-PCR的反應(yīng)體系為20 μL,具體為2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL,Primer 1(10 μmol/L)0.4 μL,Primer 2(10 μmol/L)0.4 μL,ddH2O 8.2 μL,cDNA 模板1 μL。反應(yīng)程序設(shè)置:94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。以β-actin作為內(nèi)參基因,每組試驗(yàn)處理3次重復(fù)。

1.2.8 東北林蛙LEPR蛋白的免疫組織化學(xué)檢測 取對照組和試驗(yàn)組感染后8,16,24,36,48,72 h腎臟、皮膚和肌肉組織,用10%福爾馬林溶液進(jìn)行固定,在乙醇中脫水,用于常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片厚度5 μm;二甲苯脫蠟后 3% H2O2阻斷過氧化物酶;10%山羊血清37 ℃封閉 30 min,滴加1∶250倍稀釋兔抗LEPR多克隆抗體,4 ℃過夜孵育;復(fù)溫45 min,加1∶2 000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗后37 ℃孵育30 min;DAB避光染色8 min,蘇木精復(fù)染15 min后脫水透明并中性樹膠封片。拍照保存圖像,利用 Image J 軟件將彩色圖像轉(zhuǎn)變?yōu)閱紊ǖ阑叶葓D像,將陽性染色和背景色進(jìn)行分離,調(diào)節(jié)參數(shù)至所有陽性染色區(qū)域均被選中,將測量得到的陽性染色區(qū)域的光密度值與陽性面積之比,計(jì)算平均光密度值,對免疫組化陽性染色進(jìn)行定量分析。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 利用 2-ΔΔCt法對LEPR基因在東北林蛙對照組和試驗(yàn)組的表達(dá)量進(jìn)行分析,利用SPSS 20軟件單因素方差分析法進(jìn)行差異顯著性分析,用 GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行作圖,Image J軟件用來統(tǒng)計(jì)免疫組化光密度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 東北林蛙LEPR基因克隆

采用分段克隆的方式,測序后獲得LEPR-A、LEPR-B、LEPR-C、LEPR-D4段序列,將這4段基因序列進(jìn)行拼接,獲得LEPR基因序列長度共3 604 bp,完整ORF區(qū)長度為3 405 bp,共編碼1 134個(gè)氨基酸(圖1),將編碼區(qū)序列提交至GenBank 獲得登錄號為:ON652850.1。

M.DL2000 DNA Marker。

2.2 東北林蛙LEPR基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 氨基酸同源性分析 使用DNAMAN進(jìn)行序列比對,東北林蛙LEPR的氨基酸序列與歐洲林蛙(XP_040216693.1)序列相似性達(dá)到95.35%,其次是高山倭蛙氨基酸相似性為75.19%,與大蟾蜍、非洲爪蟾、熱帶爪蟾相似性分別為51.97%,44.27%和45.40%,與人和大鼠的相似性分別為35.27%和34.62%,表明LEPR蛋白在不同物種保守程度相對較低。

2.2.2 東北林蛙 LEPR 蛋白理化性質(zhì) LEPR蛋白由1 134個(gè)氨基酸組成,其蛋白質(zhì)分子式為C5742H8861N1519O1733S58,分子量為128 ku,理論等電點(diǎn)為5.95,帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)數(shù)為110個(gè),帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)數(shù)為123,推測LEPR蛋白可能帶負(fù)電荷。SignalIP 4.1預(yù)測信號肽顯示,東北林蛙LEPR屬于非分泌蛋白,不具有信號肽,利用TMHMM Server v.2.0 軟件對蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)LEPR是具有一次跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)(圖2-A)。NetPhos 3.1 Server在線軟件預(yù)測,東北林蛙LEPR共有140個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn),其中絲氨酸79個(gè),蘇氨酸38個(gè),酪氨酸23個(gè)(圖2-B)。NetNGlyc 1.0 Server進(jìn)行 N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測顯示,LEPR存在多個(gè)糖基化位點(diǎn),由于LEPR是一種跨膜蛋白,跨膜蛋白只有細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生N-糖基化,因而推測東北林蛙 LEPR蛋白在胞外共有12個(gè)糖基化位點(diǎn)。不穩(wěn)定指數(shù)計(jì)算為47.09,親水性總平均值為-0.330,同時(shí)利用Hphob./Kyte&Doolittle算法預(yù)測蛋白質(zhì)的親疏水性,得出LEPR蛋白是親水不穩(wěn)定蛋白(圖2-C)。使用 NCBI 數(shù)據(jù)庫 Conserved Domain Search Service結(jié)果顯示,東北林蛙LEPR蛋白在123—215和417—519存在2個(gè)ObR_Ig 超家族結(jié)構(gòu)域;在315—399存在Lep_receptor_Ig超家族結(jié)構(gòu)域(圖2-D)。

A.LEPR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;B.LEPR蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測;C.LEPR蛋白親水性/疏水性分析;D.LEPR蛋白功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測。A.The transmembrane domain of LEPR protein;B.Prediction of LEPR protein phosphorylation sites;C.Hydrophilic/hydrophobic analysis of LEPR protein;D.Prediction of LEPR protein functional domain.

2.2.3 東北林蛙LEPR蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測及互作網(wǎng)絡(luò) 使用SOPMA 軟件預(yù)測東北林蛙LEPR二級結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)由α 螺旋(占15.26%,173個(gè)氨基酸)、延伸鏈(占25.57%,290個(gè)氨基酸)、β 轉(zhuǎn)角(占2.12%,24個(gè)氨基酸)和無規(guī)卷曲(占57.05%,647個(gè)氨基酸)等幾種結(jié)構(gòu)組成(圖3)。利用I-TASSER在線預(yù)測軟件獲得東北林蛙LEPR蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)(圖3),三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)分析相符合。利用 STRING 軟件分析東北林蛙LEPR與其他蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖,分析顯示LEPR蛋白可能與LEP(瘦素)、JAK2(JANUS激酶2)、STAT3(信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3)、SOCS3(細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3)、PTPN1(非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1)等蛋白發(fā)生相互作用。

A.LEPR蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu);B.LEPR蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu);C.LEPR蛋白質(zhì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。A.LEPR protein secondary structure;B.LEPR protein tertiary structure;C.LEPR protein interaction network.

2.2.4LEPR基因同源性分析及氨基酸進(jìn)化樹的構(gòu)建 經(jīng)MegAlign分析軟件比對分析,東北林蛙LEPR與歐洲林蛙的核苷酸同源性最高為96.5%,與高山倭蛙、大蟾蜍、非洲爪蟾、熱帶爪蟾和加蓬蚓螈分別為84.4%,66.4%,57.1%,57.2%和52.6%(圖4)。使用Mega 7.0軟件中NJ 法構(gòu)建的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)東北林蛙與兩棲動(dòng)物中的蛙、蟾蜍屬于同一分支,與兩棲類中的加蓬蚓螈在不同分支,與哺乳類、禽類等遺傳距離較遠(yuǎn),與魚類遺傳距離更遠(yuǎn),這也進(jìn)一步驗(yàn)證LEPR基因的保守程度不高這一結(jié)論。

A.LEPR基因同源性;B.LEPR系統(tǒng)進(jìn)化樹。A.LEPR gene homology;B.LEPR phylogenetic tree.

2.2.5 嗜水氣單胞菌感染東北林蛙病理組織學(xué)鑒定 取東北林蛙試驗(yàn)組與對照組肝臟和皮膚組織,制備組織切片,進(jìn)行HE染色。肝臟組織病理學(xué)觀察所見(圖5-A1—A3),與對照組相比,隨著感染時(shí)間增加,肝臟細(xì)胞間隙逐漸變大,黑色素沉積增加,肝細(xì)胞邊界模糊并且淋巴細(xì)胞浸潤,最后呈明顯炎癥感染狀態(tài);在皮膚組織可見(圖5-B1—B3),與對照組相比,感染36 h皮膚組織的表皮層與真皮層發(fā)生分離,炎癥后期表皮層發(fā)生崩解,真皮層膠原纖維發(fā)生溶解,大量色素細(xì)胞增加,以上結(jié)果都表明,嗜水氣單胞菌感染東北林蛙的炎癥模型成功建立。

HE染色觀察嗜水氣單胞菌感染的東北林蛙的不同組織。A.肝臟;B.皮膚;1,2,3.0,36,72 h。Observation by HE staining in different tissues of Rana dybowskii infected by Ah.A.Liver;B.Skin;1,2,3.0,36,72 h.

2.2.6 東北林蛙LEPR基因的組織表達(dá) 應(yīng)用qRT-qPCR技術(shù)檢測LEPR基因在東北林蛙的組織分布,以β-actin為內(nèi)參基因,選擇心臟表達(dá)量作為對照。結(jié)果表明(圖6),LEPR基因廣泛表達(dá)在東北林蛙的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮膚、肌肉和胃,其中LEPR基因在皮膚的表達(dá)量最高(P<0.05),在肝臟和胃組織中表達(dá)量也具有較高水平,二者之間差異不顯著,脾臟與腎臟表達(dá)量差異不顯著,肺臟和肌肉表達(dá)量差異不顯著,心臟的表達(dá)量最低。

不同小寫字母表示在不同組織中的相對表達(dá)量差異性顯著(P<0.05)。 Different lowercase letters indicate significant differences in relative expression among tissues(P<0.05)．

2.2.7 嗜水氣單胞菌感染后東北林蛙LEPR基因的時(shí)序表達(dá) 利用qRT-PCR檢測東北林蛙在嗜水氣單胞菌感染后不同器官和組織中LEPR基因表達(dá)達(dá)量變化趨勢。結(jié)果表明,嗜水氣單胞菌感染后東北林蛙的各器官和組織中LEPRmRNA表達(dá)量出現(xiàn)明顯變化。心臟中LEPRmRNA表達(dá)量在感染初期8～16 h發(fā)生下調(diào),在24 h表達(dá)量達(dá)到峰值,與對照組相同,隨后表達(dá)量呈波動(dòng)變化(圖7-A);肝臟LEPRmRNA表達(dá)量在感染初期8 h達(dá)到峰值為對照組2.96倍,16～72 h表達(dá)量變化趨勢為先下調(diào)后上調(diào)(圖7-B);脾臟中LEPRmRNA表達(dá)量在8～36 h變化趨勢為先與對照組持平后下調(diào),表達(dá)量在48 h重新上調(diào),在72 h達(dá)到表達(dá)量峰值,為對照組的2.61倍(圖7-C);肺臟LEPRmRNA表達(dá)量在感染16 h達(dá)到峰值,為對照組8.51倍,隨后表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào),72 h表達(dá)量又重新上調(diào)至本底水平的6.8倍(圖7-D);腎臟在感染初期8 h時(shí)LEPRmRNA表達(dá)量開始急劇上調(diào),16 h達(dá)到峰值為對照組的2.57倍,24～72 h表達(dá)量變化趨勢為先下調(diào)后上調(diào)(圖7-E);皮膚中LEPRmRNA表達(dá)量在8～48 h均低于對照組,感染72 h表達(dá)量上調(diào)達(dá)到峰值,為對照組的2.07倍(圖7-F);肌肉組織中LEPRmRNA表達(dá)量在感染16 h達(dá)到峰值,為對照組的4.44倍,感染36 h與48 h表達(dá)量之間差異不顯著,在72 h表達(dá)量下調(diào)至最低(圖7-G);胃組織中LEPRmRNA表達(dá)量在感染16 h表達(dá)量達(dá)到峰值為對照組的3.12倍,隨后表達(dá)量下調(diào)低于對照組,72 h表達(dá)量再次上調(diào)為對照組2倍左右(圖7-H)。

A.心臟;B.肝臟;C.脾臟;D.肺臟;E.腎臟;F.皮膚;G.肌肉;H.胃。不同小寫字母表示 5%水平差異顯著(P<0.05)。A.Heart;B.Liver;C.Spleen;D.Lung;E.Kidney;F.Skin;G.Muscle;H.Stomach.Different lowercase letters indicate significantly different at 5% level(P<0.05).

綜上所述,在嗜水氣單胞菌感染下,東北林蛙的肺臟、腎臟、肌肉和胃LEPRmRNA表達(dá)量在感染前期16 h達(dá)到峰值,而脾臟和皮膚在72 h達(dá)到峰值,心臟和肝臟分別在24,8 h達(dá)到峰值,表明LEPR基因?qū)?xì)菌感染引發(fā)的應(yīng)答存在時(shí)間和水平差異。

2.2.8 嗜水氣單胞菌感染后LEPR蛋白在不同組織的表達(dá) 對東北林蛙嗜水氣單胞菌感染后不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟、皮膚和肌肉組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(圖8—10),在對照組與試驗(yàn)組均有LEPR蛋白的陽性染色,觀察到不同時(shí)間點(diǎn)蛋白表達(dá)水平有差異,再利用軟件Image J計(jì)算各組織染色圖像進(jìn)行平均光密度值分析(圖11)。結(jié)果顯示,腎臟中LEPR蛋白在感染初期16 h達(dá)到表達(dá)量峰值,為對照組1.46倍,24～72 h LEPR表達(dá)量呈現(xiàn)波動(dòng)變化;皮膚組織中,感染8～48 h LEPR蛋白表達(dá)量均低于對照組,表達(dá)量在72 h上調(diào)達(dá)到峰值,為對照組的1.53倍;肌肉組織中,LEPR表達(dá)量在16 h達(dá)到峰值,為對照組1.65倍(P<0.01),24 h表達(dá)量開始下調(diào),36～48 h表達(dá)量重新上調(diào)與對照組持平,隨后表達(dá)量又重新下調(diào)。以上結(jié)果與qRT-PCR檢測LEPRmRNA水平變化趨勢基本一致,進(jìn)一步驗(yàn)證LEPR蛋白表達(dá)量在嗜水氣單胞菌感染后發(fā)生顯著上調(diào),推測LEPR在兩棲動(dòng)物中能夠參與細(xì)菌感染引起的免疫應(yīng)答。

A—G分別表示對照組、感染后8,16,24,36,48,72 h腎臟組織。A—G respectively represent the kidney tissue in the control group,8,16,24,36,48,72 h after infection.

A—G分別表示對照組、感染后8,16,24,36,48,72 h皮膚組織。A—G respectively represent the skin tissue in the control group,8,16,24,36,48,72 h after infection.

A—G分別表示對照組、感染后8,16,24,36,48,72 h肌肉組織。A—G respectively represent the muscle tissue in the control group,8,16,24,36,48,72 h after infection.

不同大寫字母表示1%水平差異顯著(P<0.01)。Different capital letters are significantly at 1% level(P<0.01).

3 結(jié)論與討論

LEPR作為一種跨膜受體,屬于Ⅰ類細(xì)胞因子受體家族成員,其基因具有多態(tài)性,由于蛋白酶水解或mRNA可變剪切可導(dǎo)致產(chǎn)生多種亞型。在哺乳動(dòng)物中,LEPR具有6種亞型,其中只有長型受體具有完整功能結(jié)構(gòu)域;在斑馬魚[28]、點(diǎn)帶石斑魚[29]等多數(shù)魚類中只有長型受體這種亞型,但在大西洋鮭魚[30]、羅非魚[31]、虹鱒魚[32]中存在多種受體。本研究中東北林蛙LEPR的克隆是以歐洲林蛙LEPR轉(zhuǎn)錄突變X1基因序列設(shè)計(jì)引物,經(jīng)比對后發(fā)現(xiàn)得到的東北林蛙LEPR為長型受體,東北林蛙中是否還存在其他亞型還需進(jìn)一步研究。根據(jù)東北林蛙與其他物種LEPR氨基酸序列比對,東北林蛙與歐洲林蛙的同源性較高,與其他兩棲類LEPR同源性有所降低,與禽類、哺乳動(dòng)物氨基酸序列相似性更低,這表明東北林蛙LEPR與其他物種LEPR保守性較低,同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹也表明,哺乳動(dòng)物、禽類、蚓螈類LEPR聚為一支,鯉形目中斑馬魚與其他物種類別親緣較遠(yuǎn),聚為另一大分支,東北林蛙與兩棲綱無尾目的LEPR聚為一支,表明親緣關(guān)系最近。

在哺乳動(dòng)物中,LEP作為一種重要的脂肪組織分泌的蛋白,與LEPR結(jié)合后,可發(fā)揮脂質(zhì)代謝、能量平衡、神經(jīng)內(nèi)分泌、繁殖、造血和免疫等多種生理作用[4-8],所以LEPR在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布廣泛,以脂肪組織表達(dá)為主,在下丘腦、垂體、肝臟、肺臟、腎臟等組織也均有表達(dá)[33];與哺乳動(dòng)物類似,在鳥類中,垂體、脾臟和脂肪組織中也檢測到LEPR基因的高表達(dá)[13];同樣在魚類中,黃顙魚、黃鱔LEPR基因表達(dá)水平在在下丘腦和垂體中最高,更說明了通過瘦素與LEPR的結(jié)合激發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)通路,增強(qiáng)脂質(zhì)代謝[34-35],然而大西洋鮭魚[30]、石斑魚[36]、歐洲鱸魚[37]在卵巢中表達(dá)豐富,也驗(yàn)證其與繁殖功能具有相關(guān)性;在兩棲類中,非洲爪蟾中LEPR基因在腦垂體和腦的表達(dá)量最高,在皮膚、肌肉和睪丸組織也有高水平表達(dá),在心臟、肺臟、卵巢和血液中較低但可檢測到表達(dá)水平;本研究顯示,在東北林蛙心臟和肺臟表達(dá)水平較低,在皮膚組織中觀察到了高表達(dá)水平,這可能是由于兩棲動(dòng)物皮膚直接接觸外部生活環(huán)境,在受到病原體感染后,皮膚首先做出對抗原提呈的反應(yīng)。這些相關(guān)研究也證明LEPR基因在不同物種間的表達(dá)存在種屬差異性。

本研究中嗜水氣單胞菌感染東北林蛙后,LEPR基因的表達(dá)水平發(fā)生明顯變化,在肝臟、肺臟、腎臟、肌肉和胃組織中均在8～16 h表達(dá)量達(dá)到最高,表明LEPR基因在感染前期表達(dá)量急劇升高,隨后表達(dá)量開始不同程度下調(diào),脾臟和皮膚組織均在72 h表達(dá)量達(dá)到高水平,心臟在8～72 h表達(dá)量變化程度不大,這表明該基因在東北林蛙不同組織可能發(fā)揮不同功能。研究[38]發(fā)現(xiàn),草魚在感染嗜水氣單胞菌后腸道通過NF-κB信號通路參與炎癥反應(yīng),吳彤等[26]也發(fā)現(xiàn)東北林蛙中LepROT通過啟動(dòng)NF-κB 信號通路發(fā)揮抗感染作用,據(jù)此推測出LEPR也可能通過這一信號通路進(jìn)行免疫應(yīng)答。在以往研究中[39],LEPR基因出現(xiàn)突變(Q223R)或多態(tài)性(rs1137101),導(dǎo)致LEPR-STAT3信號通路受損,可能導(dǎo)致在感染傳播中易感性增加,比如LEPR基因突變會(huì)導(dǎo)致阿米巴結(jié)腸炎[40]、肝膿腫和細(xì)菌性腹膜炎[41]的易感性。Madan等[42]也證實(shí)在人類和小鼠中,LEPR-STAT3信號通路在艱難梭菌感染的炎癥反應(yīng)中具有調(diào)節(jié)作用,這與本研究中蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測結(jié)果相同,但具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。在動(dòng)物機(jī)體中如果免疫、代謝和神經(jīng)內(nèi)分泌等方面失調(diào),可能導(dǎo)致LEP-LEPR信號通路發(fā)生障礙,這也是導(dǎo)致免疫缺陷的原因之一。研究發(fā)現(xiàn)[43],肺部巨噬細(xì)胞能夠特異性表達(dá)LEPR,在LEPR信號作用下巨噬細(xì)胞減輕肺部炎癥,能夠抑制急性肺損傷,這也進(jìn)一步證明LEPR在感染中具有的免疫調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)[44],在小鼠急性感染犬新孢子蟲后,在脂肪組織中長型和短型LEPR表達(dá)水平下降,在肝臟中2種受體表達(dá)量升高,這與嗜水氣單胞菌感染后東北林蛙肝臟中LEPR基因表達(dá)量上調(diào)變化相同。在小鼠慢性腦灌注不足(CCH)炎癥模型研究[45]中驗(yàn)證了LEPR缺乏會(huì)抑制促炎反應(yīng)和其他抗炎因子的表達(dá)。嗜水氣單胞菌感染東北林蛙炎癥模型中,8種組織中LEPR基因均出現(xiàn)顯著變化趨勢,且達(dá)到表達(dá)量峰值的時(shí)間不同,表明不同組織中LEPR功能不同,結(jié)合免疫組織化學(xué)染色觀察和Image J軟件分析LEPR蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化,推測 LEPR在Ah感染過程中發(fā)揮免疫功能。

本研究成功克隆了東北林蛙LEPR基因的完整開放閱讀框,共編碼1 134個(gè)氨基酸。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)LEPR與其他物種之間保守度不高,是一種親水不穩(wěn)定跨膜蛋白。LEPR基因廣泛存在東北林蛙的多種組織,并且在Ah感染后不同組織LEPR基因開始應(yīng)答的時(shí)間不同,但均在感染過程中發(fā)生表達(dá)量上調(diào)現(xiàn)象。綜上可以推測,東北林蛙LEPR基因在炎癥反應(yīng)中具有參與抗感染的功能。