香蕉枯萎病菌1號和4號生理小種在‘巴西蕉’植株及根際土壤中的時(shí)空分布

饒雪琴，唐 瑞，李華平

(廣東省微生物信號與病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

香蕉Musaspp.是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumf.sp.cubense,Foc) 引起的香蕉枯萎病不斷擴(kuò)散蔓延，使我國香蕉產(chǎn)業(yè)發(fā)展嚴(yán)重受阻。根據(jù)Foc 在不同香蕉品種上的致病性差異，將其分為Foc1、Foc2和Foc4 等3 個(gè)不同生理小種[1]。按照病害發(fā)生的地理區(qū)域等因素，進(jìn)一步將Foc4 分為熱帶4 號小種(Tropical race 4，TR4) 和亞熱帶4 號小種(Subtropical race 4，STR4)[2]；Foc1 分布于世界各地，侵染范圍較廣[3]，而TR4 為目前世界各地香蕉中蔓延最廣、危害最重的香蕉枯萎病菌[2]。我國自1996年在廣東番禺大面積發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病以來，隨后在海南、福建、廣西和云南等地相繼發(fā)現(xiàn)Foc4 引起的香蕉枯萎病[4]。目前為害我國香蕉的枯萎病菌主要是Foc1 和Foc4 生理小種[5-6]，其中，F(xiàn)oc4 多數(shù)為TR4[7]，該菌在熱帶亞熱帶地區(qū)均有較強(qiáng)致病力，嚴(yán)重威脅我國香蕉產(chǎn)業(yè)[5]。研究Foc 侵染香蕉最常用的方法是利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察熒光蛋白標(biāo)記的Foc[8-9]。Li 等[8]采用綠色熒光蛋白標(biāo)記Foc TR4 和Foc1，然后分別接種巴西蕉，發(fā)現(xiàn)兩者侵入方式不同，F(xiàn)oc TR4 從表皮細(xì)胞間或者傷口侵入，而Foc1 只能通過傷口侵染。Xiao 等[10]發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白標(biāo)記的Foc4 先侵入巴西蕉幼根表皮，隨后侵入球莖和假莖，F(xiàn)oc 菌絲在假莖中最多、球莖中最少。Dong 等[11]發(fā)現(xiàn)接種Foc 后 7 d，在巴西蕉假莖和葉鞘中均能檢測到標(biāo)記的Foc4，但檢測不到標(biāo)記的Foc1；接種后15～30 d，在葉片中能檢測到Foc4；在巴西蕉根和球莖中Foc4 菌量高于Foc1。劉磊等[12]通過平板菌落計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc 在香蕉植株內(nèi)的分布因樣地發(fā)病程度和植株部位不同差異顯著，球莖中的Foc 明顯高于其他部位。這些學(xué)者利用不同的方法研究香蕉枯萎病菌侵染過程，為香蕉枯萎病菌致病和病害流行提供了參考。香蕉枯萎病萎蔫癥狀主要是由于維管束堵塞造成營養(yǎng)和水分運(yùn)輸受阻[8]。Foc 侵染過程反映了香蕉體內(nèi)Foc 的變化，而Foc 分布與其侵染和致病性直接相關(guān)。由于香蕉枯萎病是一種菌量依賴性病害[13]，土壤中病菌含量是決定香蕉植株能否發(fā)病以及病害嚴(yán)重程度的影響因素。目前鮮見枯萎病菌在病株土壤中空間分布的相關(guān)報(bào)道，探究香蕉枯萎病菌在寄主體內(nèi)和根際土壤中的分布是研究香蕉枯萎病菌致病機(jī)制和病害流行的重要基礎(chǔ)。本研究對香蕉植株內(nèi)及根際土壤中Foc 含量及分布進(jìn)行分析，旨在為香蕉枯萎病菌的侵染和致病機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為對Foc1 抗病、對Foc4 感病的‘巴西蕉’MusaacuminateL.AAA group,cv.Brazilian。Foc 均為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病毒實(shí)驗(yàn)室保存，F(xiàn)oc4菌株為TR4 XJZ2(VCG 01216)，F(xiàn)oc1 菌株為Foc1 FJZ3(VCG 01221)。溫室試驗(yàn)取“五葉期”盆栽幼苗置于防蟲網(wǎng)室中，大田種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地。

1.2 樣品總DNA 抽提和引物合成

香蕉枯萎病菌總DNA、土壤總DNA 以及香蕉總DNA 提取分別采用MAGEN 生物公司的真菌DNA、土壤總DNA 以及廣譜性植物DNA 抽提試劑盒，具體方法參考說明書。利用核酸蛋白分析儀測定DNA 濃度及D260 nm/D280 nm比值。

根據(jù)GenBank 中香蕉枯萎病病菌序列，利用Primer 3 分別設(shè)計(jì)Foc PCR 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物由上海生物工程有限公司合成，具體見表1。本研究中引用的引物以及設(shè)計(jì)的引物經(jīng)試驗(yàn)證明，對相應(yīng)Foc 生理小種都有特異性[4,14-15]。

表1 本研究引物信息Table 1 The primers used in this study

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法

提取Foc 侵染的‘巴西蕉’根部DNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳后，將目的片段切膠回收，連接至pMD18-T 載體上。經(jīng)PCR 和酶切，鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送生工測序，選取相似性大于90%的作為陽性重組質(zhì)粒，分析其濃度，計(jì)算拷貝數(shù)。以10 倍梯度稀釋的質(zhì)粒DNA 作為絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)曲線由系列稀釋的量化目標(biāo) DNA 和Ct值生成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行3 次生物學(xué)和技術(shù)重復(fù)。

1.4 香蕉枯萎病菌接種液的制備和接種

將-80 ℃保存的Foc1 和Foc4 菌種接種在PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 周。將無菌水洗脫的孢子添加至YPD 液體培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)，F(xiàn)oc1 和Foc4 培養(yǎng)溫度分別為28 和26 ℃。培養(yǎng)3 d 后，將培養(yǎng)液離心，孢子沉淀用無菌水洗2 次，調(diào)整孢子濃度備用。

香蕉枯萎病菌溫室接種采用傷根接種法[11]，接種后的香蕉置于25～32 ℃溫室內(nèi)培養(yǎng)。Foc 孢子濃度為1×105mL-1，無菌水作空白對照，每個(gè)處理15 株幼苗。大田種植的健康‘巴西蕉’株高1 m左右接種，在每株植株半徑為0.5 m 內(nèi)用取土器傷根后，澆灌1.5×106mL-1的Foc 接種液1 L。Foc1 和Foc4 各接種5 株。

1.5 香蕉枯萎病調(diào)查和樣品收集

對接種后香蕉發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)，枯萎病分級標(biāo)準(zhǔn)參考Brake 等[16]。對接種Foc1 和Foc4 的盆栽幼苗分別于接種后2、4、6、8、10、14、21 d 采集根、球莖、球莖以上3～4 cm 處假莖和剛展開的第1 葉進(jìn)行Foc 檢測。接種后30 d，對大田種植的‘巴西蕉’植株不同部位進(jìn)行PCR 檢測，采集病株不同方位(東、南、西、北)、離植株不同地面半徑(r分別為5、15、30 cm)處不同深度(h分別為0～5、10～15、25～30 cm)的土樣進(jìn)行混合，共獲得9 組土壤樣品，-20 ℃保存，試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 ‘巴西蕉’植株和根際土壤中Foc1 和Foc4菌量及統(tǒng)計(jì)分析

分別提取接種Foc1 和Foc4 的‘巴西蕉’植株不同部位和不同土壤DNA 作為定量模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增。通過計(jì)算確定不同樣品中Foc1 和Foc4 菌量。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件(IBM company,Armonk,America)進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s 法檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法的建立

分別以制備的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，建立Foc1 和Foc4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR。結(jié)果(圖1) 表明，F(xiàn)oc1 和Foc4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)分別為1.05×108～1.05×102和7.09×108～7.09×102μL-1；所建立的2 種標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)(R2)均為0.999，Ct值與拷貝數(shù)線性關(guān)系良好，擴(kuò)增效率(E)分別為107.1%和94.1%，達(dá)到了實(shí)時(shí)熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求(R2> 0.98，90%

圖1 Foc1 和Foc4 質(zhì)粒DNA 標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCRFig.1 Real-time quantitative PCR of Foc1 and Foc4 plasmid DNA standards

2.2 ‘巴西蕉’接種Foc1 和Foc4 的癥狀

Foc1 傷根接種‘巴西蕉’8 d 后，球莖開始變褐，且隨時(shí)間增加褐變逐漸加重；在接種后21 d，‘巴西蕉’葉片保持綠色，說明Foc1 侵染前期只影響根部和球莖，不影響地上部。而接種Foc4 后6 d，球莖變褐，并且隨著時(shí)間的增加褐變越來越嚴(yán)重。在接種后21 d，地上部葉片開始變黃。說明Foc4 對‘巴西蕉’致病性比Foc1 強(qiáng)。

2.3 Foc1 和Foc4 在‘巴西蕉’根部及球莖中的菌量變化

分別提取Foc1 和Foc4 接種的‘巴西蕉’根、球莖、假莖、葉組織總DNA 進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果表明，接種后21 d，只在根和球莖中檢測到Foc，而假莖和葉片中未檢測到。接種Foc 后2 d，在‘巴西蕉’根部采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可以檢測到Foc1 和Foc4，拷貝數(shù)分別為(1.62×103±2.97×102)和(9.65×103±4.68×102) μL-1；接種后21 d，根部Foc1 和Foc4 拷貝數(shù)分別為(5.26×104±8.37×102) 和(1.48×107±9.78×105) μL-1(圖2A)，F(xiàn)oc 值達(dá)到最大。表明在接種后2～21 d，F(xiàn)oc1 和Foc4 在‘巴西蕉’根部不斷增加，且Foc4 菌量明顯高于Foc1。

圖2 Foc1 和 Foc4 侵染‘巴西蕉’后根部和球莖的菌量變化Fig.2 The Foc quantity in roots and rhizomes of Musa acuminate cv.Brazilian seedlings infected by Foc1 and Foc4

接種后2 d，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測‘巴西蕉’球莖中Foc，結(jié)果顯示，球莖中能檢測到Foc4，幾乎檢測不到Foc1；Foc1 的Ct值為35.01±0.15，超出了 PCR 的檢測范圍(15～35)；Foc4 的Ct值為30.54±0.14、拷貝數(shù)為(41.10±4.00)×102μL-1。接種后6 d，F(xiàn)oc 在球莖中迅速增加，F(xiàn)oc1 和Foc4 的Ct值分別為26.27±0.08 和24.43±0.07，拷貝數(shù)分別為(211.0±6.21)×102和(234.00±1.31)×103μL-1。接種后21 d，F(xiàn)oc1 和Foc4 的Ct值分別為23.74±0.16 和20.38±0.20，拷貝數(shù)分別為(168.00±3.90)×103和(350.00±9.79)×103μL-1(圖2B)。表明在接種Foc 后6～21 d 內(nèi)，F(xiàn)oc 積累減緩，21 d 時(shí)積累量達(dá)到最大，且Foc4 菌量均高于Foc1。

隨后，對‘巴西蕉’不同部位Foc 進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)接種后2 和4 d，球莖中Foc 菌量低于根部Foc。接種后6 d，球莖中Foc 菌量開始高于根部。

2.4 大田‘巴西蕉’及根際土壤中的Foc1 和Foc4分析

大田中‘巴西蕉’接種Foc1 和Foc4 后30 d，球莖變褐，接種Foc4 的球莖比接種Foc1 的球莖變褐更明顯。分別取接種Foc1 和Foc4 的‘巴西蕉’周圍土壤抽提總DNA，并以提取的土壤DNA(D260 nm/D280 nm約1.8，DNA 約為20 ng)為模板進(jìn)行PCR，結(jié)果(圖3)顯示，PCR 擴(kuò)增目的條帶清晰，與預(yù)期大小一致。

圖3 接種Foc4(A)和Foc1(B)后‘巴西蕉’根際土壤DNA 的 PCR 檢測Fig.3 PCR detection of DNA in rhizosphere soil of Musa acuminate cv.Brazilian after inoculation with Foc4 (A) and Foc1 (B)

為研究Foc 在根際土壤中分布，取接種Foc1 后 30 d 的‘巴西蕉’根際土壤樣品進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4A)顯示，在距離‘巴西蕉’植株地面半徑(r)5 cm、土壤深度25～30 cm 處Foc1 菌量最高，拷貝數(shù)為(2 115.91±54.47) μL-1；而r分別為15 和30 cm 時(shí)，在土壤深度10～15 cm 處Foc1 菌量最高，拷貝數(shù)分別為(604.31±174.86)和(471.23±24.31) μL-1。當(dāng)r分別為5、15 和30 cm 時(shí)，在土壤深度為0～5 cm處Foc1 菌量均最低，拷貝數(shù)分別為(670.23±44.83)、(377.33±32.98)和(328.23±17.83)μL-1，表明在‘巴西蕉’根際空間分布中，與‘巴西蕉’植株距離越近，土壤中Foc1 菌量越大；相同地面距離時(shí)，以土壤深度為10～15 或25～30 cm 的土壤中Foc1 菌量最大。

圖4 Foc1 和Foc4 接種‘巴西蕉’后在土壤中的分布Fig.4 Distribution of Foc1 and Foc4 in rhizosphere soil after inoculating on Musa acuminate cv.Brazilian

對接種后30 d 的‘巴西蕉’根際土壤中Foc4 分析結(jié)果(圖4B)表明，在r為5 cm 且土壤深度25～30 cm 處土壤中Foc4 菌量最大，拷貝數(shù)為(12 506.79±289.58) μL-1；在r為30 cm 且土壤深度25～30 cm 處土壤中Foc4 菌量最小，拷貝數(shù)為(220.39±41.11) μL-1。Foc4 在‘巴西蕉’根際空間分布規(guī)律與Foc1 基本相同，但是在相同r和土壤深度時(shí)，除r為30 cm 且土壤深度25～30 cm 外，其他土壤中Foc4 菌量均高于Foc1。

3 討論與結(jié)論

3.1 香蕉枯萎病菌侵染‘巴西蕉’過程中Foc 菌量變化

香蕉枯萎病菌生理小種Foc1 和Foc4 對不同香蕉致病性差異是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一，對致病性不同的Foc1 和Foc4 開展空間分布研究，可以為香蕉枯萎病的流行、預(yù)測預(yù)報(bào)以及病害防控提供科學(xué)依據(jù)。目前，利用激光共聚焦顯微鏡研究香蕉枯萎病菌侵染過程大多數(shù)在室內(nèi)進(jìn)行，該方法不能準(zhǔn)確計(jì)算病菌含量，且鮮見大田香蕉枯萎病菌含量的研究報(bào)道。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 不用標(biāo)記菌株，操作相對簡單，廣泛應(yīng)用于病毒[17]、細(xì)菌[18]等定量分析。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 定量分析了香蕉植株不同部位Foc1 和Foc4 菌量，與激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果相比[3,8-9]，能夠準(zhǔn)確地掌握Foc 侵染量，可以為香蕉枯萎病的預(yù)測提供科學(xué)依據(jù)。

在研究Foc 侵染過程中，不同的研究者結(jié)果不同。本研究結(jié)果表明，在接種Foc 后 2 d，‘巴西蕉’球莖中Foc 菌量遠(yuǎn)低于根部，這與Li 等[8]研究結(jié)果一致。Li 等[8]觀察到Foc4 可以侵入‘巴西蕉’球莖，而Foc1 在接種后2 個(gè)月都不能侵入‘巴西蕉’球莖。本研究中，接種后6 d 的‘巴西蕉’球莖中均能檢測到Foc1 和Foc4，說明接種后6 d，F(xiàn)oc1 和Foc4 已侵入‘巴西蕉’球莖。Xiao 等[10]發(fā)現(xiàn)接種后10 d 時(shí)Foc4 侵入‘巴西蕉’球莖，17 d 時(shí)已從球莖擴(kuò)展到假莖，且假莖、根部和球莖Foc4 菌量依次減少。本研究接種后21 d 發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc 在球莖中最多，根部次之，假莖和葉片幾乎沒有。這與Dong 等[11]研究結(jié)果一致，即在侵染前期，香蕉球莖Foc 菌量高于其他部位。Foc1 和Foc4 侵染‘巴西蕉’根部后，菌量不斷增加，在不同時(shí)間和空間內(nèi)Foc4 菌量均高于Foc1，說明在‘巴西蕉’中Foc1 和Foc4 在侵染速度、定殖后的繁殖能力以及擴(kuò)展能力方面差異明顯。在侵染前期，F(xiàn)oc4 能從‘巴西蕉’根部擴(kuò)展至球莖、假莖中，而Foc1 僅能從根部擴(kuò)展至球莖[11]；這可能與Foc1 和Foc4 對‘巴西蕉’的致病力不同有關(guān)，或者與‘巴西蕉’對Foc1 和Foc4 的抗病性差異有關(guān)。有研究表明，由于Foc1 和Foc4 的致病力不同，導(dǎo)致侵染過程中與‘巴西蕉’抗病性相關(guān)的多種酶活性不同[15]，并且Foc 致病相關(guān)基因的表達(dá)也不同[3]，這些差異最終決定了Foc1 和Foc4 能否從球莖向上擴(kuò)展至地上部從而引起香蕉系統(tǒng)性病害。

3.2 香蕉枯萎病菌在根際土壤中的分布

香蕉根系由初生根、二級和三級次生根組成，初生根可能有幾米長，二級和三級次生根只有幾厘米至1 m 長，且主要分布在土壤表層[19-20]，土壤中的少量病原菌可能使香蕉植株發(fā)生嚴(yán)重病害[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在r為5 cm、土壤深度25～30 cm 時(shí)，無論是致病性強(qiáng)的Foc4 還是致病性弱的Foc1 菌量均比其他土壤層高。Foc 在土壤中的這種分布可能與‘巴西蕉’根系生長特性有關(guān)，即在r為5 cm 且土壤深度25～30 cm 處是‘巴西蕉’二級和三級次生根最多的地方，F(xiàn)oc 菌量最多，此處Foc 菌量與香蕉枯萎病發(fā)生流行密切相關(guān)。在根際土壤中，F(xiàn)oc1 菌量一般低于Foc4，這可能與Foc4 強(qiáng)致病力有關(guān)。

土壤中Foc 分布影響香蕉枯萎病的發(fā)生，在一定范圍內(nèi)，隨土壤中菌量增加香蕉枯萎病發(fā)生加重，當(dāng)超過某一范圍，香蕉枯萎病發(fā)生達(dá)到飽和而不再加重[20]。本研究也發(fā)現(xiàn)香蕉植株根際土壤中Foc 菌量與香蕉枯萎病嚴(yán)重度呈正相關(guān)[21]，這符合香蕉枯萎病的發(fā)生規(guī)律，說明影響香蕉枯萎病發(fā)生的病菌主要是根際土壤中的Foc。

香蕉枯萎病菌的侵染過程包括Foc 接觸香蕉根部、侵入根表皮后建立寄生關(guān)系[3]，并不斷繁殖擴(kuò)展的過程；其侵染過程不但體現(xiàn)了Foc 與香蕉的相互作用，而且與香蕉枯萎病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22]。本研究表明，F(xiàn)oc1 比Foc4 在‘巴西蕉’植株中擴(kuò)張慢、定殖量低，F(xiàn)oc1 和Foc4 通常在香蕉根際土壤中含量高，同一空間中的Foc4 菌量明顯高于Foc1?！臀鹘丁俏覈F(xiàn)階段主要栽培品種之一，對不同香蕉枯萎病菌在‘巴西蕉’植株及根際土壤中的空間分布研究為Focl 和Foc4 致病機(jī)理的研究及科學(xué)制定綜合防控策略提供了理論依據(jù)。