馬纓杜鵑炭疽病病原菌生物學(xué)特性及防治藥劑篩選

胡 珊，莫維弟，周志成，丁海霞,3，彭麗娟

(1 貴州大學(xué) 煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室,貴州 貴陽 550025；2 貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,貴州 貴陽 550025；3 貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州 貴陽 550006)

貴州百里杜鵑自然保護區(qū)位于貴州大方縣與黔西市交界處(E 105°45＇30″～106° 04＇ 45″，N 27°08＇ 30″～27° 20＇ 00″)，保存有地球同緯度范圍內(nèi)中低海拔區(qū)面積最大的天然杜鵑林[1]。馬纓杜鵑RhododendrondelavayiFranch 是該保護區(qū)的建群種和優(yōu)勢種，面積約25.16 km2，占百里杜鵑林區(qū)總面積的20%。馬纓杜鵑又名馬纓花，是杜鵑花科Ericaceae 杜鵑屬Rhododendron的一種常綠灌木或小喬木[2]。因花大、顏色鮮艷，且形似馬頭飾上的瓔珞而得名。其分布廣泛，花色艷紅，觀賞價值高，是杜鵑屬重要的育種親本，具有較高研究利用價值[3]。但隨著旅游業(yè)發(fā)展，頻繁的人為活動使杜鵑花病害發(fā)生日益嚴重，不僅對觀賞性產(chǎn)生影響，對物種的生存也產(chǎn)生了威脅。因此，開展馬纓杜鵑病原菌生物學(xué)特性研究以及室內(nèi)藥劑的篩選，對該病害防治具有重要意義。

楊秀梅等[4-5]調(diào)查發(fā)現(xiàn)云南省昆明市晉寧區(qū)高山杜鵑盆花種植基地炭疽病Colletotrichum boninense、枯梢病Neofusicoccumparvum發(fā)生嚴重，田間發(fā)病率達20%以上。Wang 等[6]對臺灣地區(qū)杜鵑花調(diào)查發(fā)現(xiàn)春秋季節(jié)杜鵑葉腫病Exobasidiumjaponicum發(fā)生嚴重，該病原菌導(dǎo)致杜鵑幼嫩組織發(fā)育受損，對杜鵑花產(chǎn)業(yè)具有極大破壞性。童俊等[7]對武漢周邊以龜峰山景區(qū)為代表的杜鵑自然群落的主要病蟲害進行了系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)杜鵑葉腫病、黑斑病Cercosporarhododendri發(fā)生嚴重。劉浩凱等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)浙江省景寧縣上山頭云錦杜鵑葉斑病Phomopsisasparagi頻繁發(fā)生，嚴重影響了杜鵑林的健康生長和景觀效果。胡芳菲[9]對吉安市苗圃幾種常見樹木病害進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，西洋杜鵑褐斑病Ce.rhododendri發(fā)生相對較嚴重，苗期發(fā)病會造成植株整株死亡。陳明珠等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州省貴陽市鳳凰山錦繡杜鵑葉腫病發(fā)生嚴重，發(fā)病率高達80%，嚴重影響其觀賞性。研究大多聚焦于不同種類杜鵑花病害調(diào)查和病原菌鑒定，關(guān)于杜鵑病害的生物學(xué)特性及防治藥劑篩選研究較少。任緯恒[11]對百里杜鵑花腐病Alternariaalternata進行了室內(nèi)藥劑防治篩選，認為咪鮮胺、異菌脲、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇4 種藥劑是可進行花腐病防治的候選藥劑。

筆者于2021年7月在貴州百里杜鵑自然保護區(qū)進行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)了1 種杜鵑真菌病害，經(jīng)多基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并結(jié)合形態(tài)特征，確定該病害是由松針炭疽菌Colletotrichumfioriniae引起[12]。為明確該真菌的生物學(xué)特性及適宜防治藥劑，采用菌絲生長速率法對松針炭疽菌生物學(xué)特性進行研究，同時測定10 種殺菌劑對該病原菌室內(nèi)毒力及2 種藥劑混配對病原菌的聯(lián)合毒力，了解松針炭疽菌生物學(xué)特性，篩選出有效抑制該病原菌菌絲生長的藥劑，以期為貴州百里杜鵑自然保護區(qū)馬纓杜鵑炭疽病的科學(xué)防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

于2021年7月從貴州省百里杜鵑自然保護區(qū)采集馬纓杜鵑具有典型炭疽病癥狀的葉片，帶回實驗室進行分離培養(yǎng)，經(jīng)貴州大學(xué)煙草品質(zhì)研究重點實驗室分離、鑒定并保存。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖(P S A) 培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂(OMA)培養(yǎng)基、查氏(Czapek)培養(yǎng)基和高氏1 號(GSA)培養(yǎng)基[13]。PDA 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)病原真菌、生物學(xué)測定及室內(nèi)藥劑篩選等試驗。PSA、OMA、Czapek、GSA 培養(yǎng)基用于病原菌生物學(xué)特性測定。

供試藥劑：22.7% (w) 二氰蒽醌SC(江西禾益化工股份有限公司)、25.0% (w) 吡唑醚菌酯SC(江蘇托球農(nóng)化股份有限公司)、25.0% (w) 溴菌腈EC(江蘇托球農(nóng)化股份有限公司)、50.0% (w) 丙環(huán)唑ME(青島格力斯藥業(yè)有限公司)、10.0% (w) 苯醚甲環(huán)唑WDG(先正達南通作物保護有限公司)、75.0%(w) 肟菌·戊唑醇 WDG(拜耳作物科學(xué)有限公司)、0.3% (w) 四霉素AS(遼寧微科生物工程股份有限公司)、80.0% (w) 乙蒜素EC(南陽新臥龍生物化工有限公司)、1.0% (w) 蛇床子素ME(云南南寶生物科技有限責(zé)任公司)及8.0% (w) 寧南霉素AS(德強生物股份有限公司)。

1.2 病原菌生物學(xué)特性

采用菌絲生長速率法[13]測定不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響，將直徑為6 mm 的菌餅分別轉(zhuǎn)接于PDA、Czapek、OMA、PSA 和GSA 培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d 后，測量各培養(yǎng)基上的菌落直徑。每處理4 皿，重復(fù)3 次。

取直徑為6 mm 菌餅置于PDA 培養(yǎng)基中央，分別放入5、10、15、20、25、30、35、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d 后，十字交叉法測量菌落直徑[13]，得到菌絲生長適宜溫度，每處理4 皿，重復(fù)3 次。

將直徑為6 mm 菌餅分別接種到pH 為5、6、7、8、9、10、11 的PDA 培養(yǎng)基(用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH 進行調(diào)節(jié))，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7 d 后，測量菌落直徑，得出菌絲生長適宜pH，每處理4 皿，重復(fù)3 次。

以Czapek 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[13]，分別以等質(zhì)量的果糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖替代Czapek 培養(yǎng)基中的蔗糖作為碳源，以等質(zhì)量的硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、硝酸鉀、磷酸二氫銨替換Czapek 中的硝酸鈉作為氮源，以不添加碳源和氮源的Czapek 為對照，25 ℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)7 d 后測量菌落直徑，篩選最適碳、氮源。每處理4 皿，重復(fù)3 次。

1.3 室內(nèi)藥劑毒力

1.3.1 單劑毒力測定 采用菌絲生長速率法測定10 種殺菌劑(6 種常用化學(xué)藥劑和4 種生物農(nóng)藥)對馬纓杜鵑炭疽病菌的抑菌活性。供試藥劑母液用無菌水溶解稀釋，分別設(shè)置 5 個質(zhì)量濃度梯度。二氰蒽醌為1 271.00、635.60、317.80、158.90、79.45 mg/mL；吡唑醚菌酯為0.300 0、0.150 0、0.075 0、0.037 5、0.018 8 mg/mL；溴菌腈為500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/mL；丙環(huán)唑為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 mg/mL；苯醚甲環(huán)唑為4.8、2.4、1.2、0.6、0.3 mg/mL；肟菌·戊唑醇為1.200、0.600、0.300、0.150、0.075 mg/mL；四霉素為3.000 0、1.500 0、0.750 0、0.375 0、0.187 5 mg/mL；乙蒜素為400、200、100、50、25 mg/mL；蛇床子素為20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 mg/mL；寧南霉素為80、40、20、10、5 mg/mL。

在無菌操作條件下，將不同質(zhì)量濃度的殺菌劑溶液分別加入到滅菌的PDA 培養(yǎng)基中，充分搖勻后等量倒入培養(yǎng)皿(直徑為85 mm)中，制成含有相應(yīng)質(zhì)量濃度藥劑的平板，以加入等量無菌水的PDA培養(yǎng)基為對照。將供試病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，取直徑為6 mm 菌餅分別置于含不同質(zhì)量濃度藥劑平板和對照PDA 平板中央，待對照菌絲長滿平板時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

1.3.2 混劑毒力測定 根據(jù)單劑毒力測定結(jié)果，采用菌絲生長速率法，選擇作用機制不同、防治效果較好且EC50差異較小的2 種藥劑進行混配，測定混劑對馬纓杜鵑炭疽病菌的聯(lián)合毒力。分別設(shè)置體積比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 和1∶9 共9 種配比為母液。按照上述方法測定混劑對松針炭疽菌的抑制率,求出毒力回歸方程和EC50，參考Sun 等[14]的毒力評判法計算復(fù)配農(nóng)藥的共毒系數(shù) (Co-toxicity coefficient，CTC)，評價藥劑混用的增效作用。CTC 小于80 為拮抗作用，大于120 為增效作用，80 ～ 120 為相加作用。相關(guān)計算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理；使用SPSS 17.0 和DPS 7.05 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基、溫度、pH、氮源、碳源對菌絲生長的影響

試驗結(jié)果表明，菌絲在5 種培養(yǎng)基上均能生長(圖1A)，且5 種培養(yǎng)基對菌絲的生長影響差異顯著。在PSA 培養(yǎng)基上生長最快，平均菌落直徑為7.60 cm，顯著高于其他處理；其次是PDA 培養(yǎng)基，平均菌落直徑為7.05 cm。病原菌在OMA、Czapek、GSA 培養(yǎng)基上均能生長，但生長較為緩慢且菌絲極其稀疏，不適宜該菌的培養(yǎng)。

圖1 不同培養(yǎng)基(A)、溫度(B)和pH(C)對馬纓杜鵑炭疽病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of different culture medium,temperature and pH on mycelial growth of Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

由圖1B 可知，病原菌在10～35 ℃均可生長，在15～25 ℃生長較好，且最適生長溫度為25 ℃，與其他溫度處理有明顯差異(P< 0.05)，平均菌落直徑為7.05 cm。溫度為10 或35 ℃時生長較緩慢，3 d后才開始生長，平均菌落直徑分別為4.21 和2.69 cm。在5、40 ℃溫度條件下，病原菌菌絲未生長。

由圖1C 可知，該菌在pH 為5～11 的范圍內(nèi)均可正常生長，且隨著pH 的增大，菌絲生長愈發(fā)致密。pH 7～9 長勢較好，其中最適pH 為8，平均菌落直徑達到8.04 cm，顯著高于其他處理。

如表1所示，病原菌在不同的碳、氮源培養(yǎng)基上均可生長。在葡萄糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上長勢最好，平均菌落直徑分別為(5.72±0.15)和(5.59±0.02) cm，顯著高于對照的(3.49±0.16) cm以及其他3 種不同碳源的。在乳糖為碳源的培養(yǎng)基上長勢最差，平均菌落直徑為(3.05±0.24) cm，顯著低于其他處理的。氮源以蛋白胨最好，平均菌落直徑為(7.63±0.12) cm，顯著高于其他氮源培養(yǎng)基的，其次是硝酸鉀，平均菌落直徑為(6.08±0.26) cm。在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上長勢最差，平均菌落直徑為(1.75±0.39) cm，顯著低于其他處理及對照的。由此表明，供試的5 種碳源和氮源中，最適宜病原菌菌絲生長的碳源為葡萄糖和可溶性淀粉，最適宜的氮源為蛋白胨。

表1 碳、氮源對馬纓杜鵑炭疽病菌菌絲生長的影響1)Table 1 Effects of carbon and nitrogen sources on mycelial growth of Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

2.2 殺菌劑室內(nèi)毒力測定

供試的10 種殺菌劑對病原菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，EC50如表2所示?；瘜W(xué)藥劑中，肟菌·戊唑醇、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑和丙環(huán)唑抑制效果最好，EC50分別為0.102、0.118、1.202 和2.101mg/L。二氰蒽醌和溴菌腈的抑菌活性最低，EC50分別為196.501 和95.402 mg/L。生物農(nóng)藥中，四霉素抑菌效果最好，EC50為1.107 mg/L，其次是蛇床子素，EC50為6.803 mg/L。乙蒜素和寧南霉素抑菌效果相對較差，EC50分別為82.711 和64.712 mg/L。

表2 10 種殺菌劑對馬纓杜鵑炭疽病菌的抑菌活性Table 2 Antibiotic activities of 10 fungicides to Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

根據(jù)單劑毒力測定結(jié)果，選擇抑菌效果較好、作用機制不同且EC50相近的10.0%(w) 苯醚甲環(huán)唑和0.3% (w)四霉素按照體積比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8 和1∶9 進行混配后測定其EC50、CTC 及聯(lián)合毒力，結(jié)果(表3)表明，9 種配比組合的EC50均較小，且小于2 種單劑的EC50，說明以這9 種配比組合進行混配均對馬纓杜鵑炭疽病菌菌絲生長具有較強的抑制作用；9 種配比組合的CTC 分別為302.51、511.49、584.56、549.23、423.58、339.93、314.25、326.69 和279.91，均大于120。其中，配比為8∶2、7∶3、6∶4 時CTC 均大于500，表現(xiàn)為顯著增效作用，且9 種比例中7∶3 配比EC50最小，為0.193 0 mg/L，CTC 最大(584.56)，為室內(nèi)毒力測定最佳混劑配比。

表3 四霉素與苯醚甲環(huán)唑不同配比混劑對馬纓杜鵑炭疽病菌的毒力Table 3 Bioactivities of mixtures containing different ratios of tetramycin and difenoconazole against Colletotrichum fioriniae on Rhododendron delavayi

3 結(jié)論與討論

明確病原菌生物學(xué)特性是了解病害發(fā)生規(guī)律的前提，本研究通過測定馬纓杜鵑炭疽病菌生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，該菌在pH 5～11 均可生長，最適pH 為8；菌絲對溫度適應(yīng)范圍較廣，10～35 ℃均可生長，最適溫度為25 ℃。這與Baroncelli 等[15]報道的紅花炭疽病菌C.chrysanthemi和張琳等[16]報道的南瓜炭疽病菌C.brevisporum生物學(xué)特性研究結(jié)果相似。供試的5 種碳源中，以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基最適宜該菌的生長，而以乳糖為碳源的培養(yǎng)基明顯不利于該菌生長，這與黃蔚等[17]報道的西瓜新炭疽病菌C.gloesporioides研究結(jié)果相同。供試的5 種氮源中，菌株在以蛋白胨作氮源的培養(yǎng)基上的生長顯著優(yōu)于其他氮源，而以硫酸銨作為氮源時菌株菌絲生長速率顯著低于其他氮源，說明蛋白胨為該菌生長最佳氮源，硫酸銨則不適合作為培養(yǎng)該菌的氮源。此研究結(jié)果與曹尚等[18]對高粱炭疽病菌C.sublineola生物學(xué)特性測定結(jié)果一致。

目前，化學(xué)防治仍是田間病害防治的主要手段，對化學(xué)藥劑進行篩選是植物病害防治的重要內(nèi)容。宋慧云等[19]對宮粉羊蹄甲炭疽病菌C.gloeosporioides進行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明98% (w)溴菌腈和97% (w) 吡唑醚菌酯對宮粉羊蹄甲炭疽病菌菌絲生長具有較強的抑制作用。冉飛等[20]對百香果炭疽病菌C.karstii進行室內(nèi)殺菌試驗發(fā)現(xiàn)75% (w) 肟菌·戊唑醇和25% (w) 吡唑醚菌酯抑菌效果最好，EC50分別為0.067 和0.463 mg/L。孟珂等[21]對9 種薄殼山核桃炭疽病病原菌的毒力測定結(jié)果表明，戊唑醇對C.fioriniae、C.liaoningense和C.tamarilloi等炭疽菌生長具有較強抑制作用，平均EC50為0.49 mg/L。本研究也表明，75% (w) 肟菌 · 戊唑醇和25.0% (w) 吡唑醚菌酯對馬纓杜鵑炭疽病菌抑制效果較好，EC50分別為0.102 和0.118 mg/L。試驗還發(fā)現(xiàn)10.0% (w) 苯醚甲環(huán)唑和50.0% (w) 丙環(huán)唑ME 對該病原菌也具有較好抑制效果，EC50分別為1.202 和2.101mg/L。另外，生物農(nóng)藥0.3% (w)四霉素和1.0% (w) 蛇床子素對該菌也有較好抑制作用，EC50分別為1.107和6.803 mg/L，以上藥劑均可作為田間防治馬纓杜鵑炭疽病的候選藥劑。

苯醚甲環(huán)唑是三唑類廣譜殺菌劑，通過抑制麥角甾醇的生物合成、破壞細胞膜結(jié)構(gòu)功能，從而達到殺菌效果[22]。四霉素為不吸水鏈霉菌梧州亞種的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，其有效成分可通過抑制菌絲體生長、誘導(dǎo)植物抗性并促進作物生長而達到防治病害的目的[23]。王曉琳等[24]測定了0.3% (w) 四霉素與30%丙硫菌唑?qū)Σ葺烤也【鶦.gloeosporioides的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明四霉素與丙硫菌唑質(zhì)量比為1∶15 時抑菌效果最佳，EC50僅為0.022 4 mg/L，增效系數(shù)為1.73。韋薇等[25]測定95% (w) 苯醚甲環(huán)唑和90% (w) 代森錳鋅不同比例復(fù)配對柑桔炭疽病菌C.gloeosporioides的影響，結(jié)果表明前者與后者1∶7 體積配比時CTC 達到最大(150.25)，是防治該病原菌的最佳配比。賢小勇等[26]測定98% (w)吡唑醚菌酯和96% (w) 苯醚甲環(huán)唑不同配比混劑對核桃炭疽病菌C.gloeosporioides菌絲生長的影響，發(fā)現(xiàn)2 種藥劑按質(zhì)量比3∶2 和1∶1 進行復(fù)配時，毒力均表現(xiàn)增效作用。本研究前期單劑毒力測定結(jié)果表明10.0% (w) 苯醚甲環(huán)唑和0.3% (w) 四霉素對馬纓杜鵑炭疽病菌均有較好抑制作用，為延緩病原菌抗藥性、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，故選擇這2 種不同作用機理的藥劑進行復(fù)配以增強防治效果。結(jié)果表明，較單劑而言，試驗所設(shè)置的9 種復(fù)配比例均有增效作用，以7∶3 為最佳混劑體積比，EC50最小，CTC 最大。

綜合分析認為，75.0% (w) 肟菌·戊唑醇、25.0%(w) 吡唑醚菌酯、50.0% (w) 丙環(huán)唑、0.3% (w) 四霉素和10.0% (w) 苯醚甲環(huán)唑可作為馬纓杜鵑炭疽病的候選防治單劑；將0.3% (w) 四霉素與10.0% (w)苯醚甲環(huán)唑進行復(fù)配能顯著增效。本研究可為百里杜鵑自然保護區(qū)馬纓杜鵑炭疽病田間藥劑篩選及合適的施用濃度提供理論依據(jù)，為延緩該地區(qū)馬纓杜鵑炭疽病病菌抗藥性，選擇適宜復(fù)配藥劑提供一定參考。