新疆奇臺縣馬鈴薯瘡痂病病原的分離鑒定及生物學特性

劉曉祿　冶海林　劉易　艾尼江?爾斯?jié)M　徐李娟　郭瑞　包曉瑋　宋素琴

摘要：對新疆奇臺縣馬鈴薯瘡痂病病原菌進行分離、鑒定和生物學特性研究，從該地區(qū)采集馬鈴薯種植區(qū)病薯塊莖及根際土壤，利用植物組織分離法、稀釋涂布分離法分離菌株，并檢測致病基因txtAB、nec1、tomA，結(jié)合小蘿卜幼苗法和小薯片法測定菌株的致病性；通過形態(tài)學、生理生化特性及16S rDNA序列進行鑒定。結(jié)果表明，菌株5-51和B4K3-21具有txtAB致病基因；小蘿卜幼苗抑制率分別為73.55%、77.20%，能使小薯片表面變褐，壞死；菌株K1-4和T6同時具有txtAB、nec1、tomA等3種致病基因，小蘿卜幼苗抑制率分別為80.86%、77.42%，均能使小薯片和蘿卜片表面變褐、壞死且具有較強的致病性。生物學測定發(fā)現(xiàn)菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21能以D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、D-甘露醇為單一碳源，以L-賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸為單一氮源，經(jīng)16S rDNA 序列分析，菌株K1-4、T6、5-51與Streptomyces galilaeus（MK 424308.1）的親緣關(guān)系最近，相似率為99.86%，菌株B4K3-21與 Streptomyces europaeiscabiei（NR116533.1）的親緣關(guān)系最近，相似率為99.64%，表明新疆奇臺縣馬鈴薯瘡痂病的病原菌為Streptomyces galilaeus和Streptomyces europaeiscabie，均為新疆首次報道。

關(guān)鍵詞：新疆奇臺；馬鈴薯瘡痂病病原菌；分離鑒定；致病基因；生物學特性

中圖分類號：S435.32文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）05-0139-07

馬鈴薯（Solanum tuberosum）為茄科一年生草本植物，是全球第四大重要的糧食作物［1］。新疆馬鈴薯種植區(qū)面積達到2.44萬hm2，約占全國總種植面積的5%，南疆地區(qū)馬鈴薯種植面積約為 8 000 hm2，而北疆地區(qū)為1.64萬hm2，主產(chǎn)縣為昌吉州地區(qū)的奇臺縣和木壘縣。近年來，隨著馬鈴薯種植面積的擴大，馬鈴薯瘡痂?。╬otato scab）已成為新疆奇臺縣馬鈴薯主要病害之一。

馬鈴薯瘡痂病是由鏈霉菌（Streptomyces spp.）引起的土傳和種傳病害，病薯癥狀主要表現(xiàn)為在馬鈴薯表面形成褐色木栓化病斑，嚴重時呈瘡痂狀，這就嚴重影響了馬鈴薯外觀品質(zhì)以及市場價值［2-3］。引起馬鈴薯瘡痂病的病原菌有S. acidiscabies、S. europaeiscabiei、S.scabies、S. galilaeus，其中S.scabies和S. acidiscabies是引起馬鈴薯瘡痂病的主要病原菌［4-7］，自2000年以來不同國家報道有30多種致病菌種類［8-10］。致病菌種類通常以鏈霉菌的形態(tài)、生理生化和分子學特征為鑒定依據(jù)［11-13］。其中，引起馬鈴薯瘡痂病的主要因子是Thaxtomin A毒素分子，Thaxtomin A是一種二酮哌嗪類化合物，是一種纖維素合成抑制劑，納摩爾級別的Thaxtomin A就可引起植物根部受到抑制，瘡痂鏈霉菌相關(guān)致病基因均聚集在一個致病基因島（pathogenicity island，簡稱PAI）上，可水平轉(zhuǎn)移到其他非致病性鏈霉菌中，從而導致新致病菌的出現(xiàn)。PAI中含有致病基因txtAB（Thaxtomin A合成相關(guān)基因）以及nec1和tom A等與致病性相關(guān)的基因［14］。目前已有包括16S rDNA序列分析、MLSA多序列位點分析的多種分子生物學技術(shù)用于鏈霉菌的分類鑒定。張萌等對來自我國不同地區(qū)的馬鈴薯瘡痂病病原菌進行遺傳多樣性分析和區(qū)域分布特性研究，表明S. bobili和S. galilaeus主要分布于內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北、山西等地，S. europaeiscabiei和S. scabies主要分布于河北、黑龍江、新疆維吾爾自治區(qū)等地。新疆奇臺縣緊鄰天山，適宜馬鈴薯常年種植，近年來隨著新疆馬鈴薯病原種的調(diào)入，瘡痂病發(fā)生日益嚴重，逐年呈現(xiàn)惡化趨勢［15-17］。2010年僅在伊犁地區(qū)報道的病原菌為S.scabies和S.acidiscabies等2種［18］，由于地域條件和環(huán)境的差異，不同區(qū)域或同一地區(qū)往往在不同季節(jié)盛行不同的瘡痂病原鏈霉菌［19-20］。新疆奇臺地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的研究還未見報道，本研究旨在對奇臺地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原進行分離鑒定及生物學特性分析，為系統(tǒng)研究新疆馬鈴薯瘡痂病病原的種類及該病害防治提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯瘡痂病病薯塊莖和根際土壤于2021年8月采自新疆奇臺縣半截溝鎮(zhèn)。對照菌株：Steptomyces scabies YN由云南農(nóng)業(yè)大學提供。

分離培養(yǎng)基為燕麥麩皮培養(yǎng)基（OMA）：20 g燕麥麩皮、15 g瓊脂和1 L去離子水；高氏一號固體培養(yǎng)基（G1）：20.0 g可溶性淀粉，0.5 g磷酸氫二鉀，1.0 g硝酸鉀，0.5 g氯化鈉，0.01 g七水硫酸亞鐵，0.5 g七水硫酸鎂，20.0 g瓊脂粉，1 L去離子水。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化

將采集自不同地段的患病馬鈴薯及根際土拍照保存記錄（圖1）。病薯塊莖用水反復沖洗，之后用滅菌水沖洗，用滅菌過的解剖刀切取塊莖病健交界處5 mm2左右的組織塊，用0.3%次氯酸鈉溶液浸泡組織塊30 s，滅菌水沖洗3遍，用無菌濾紙吸取殘余水分，切成厚度為 1.2 mm 的小片，置于OMA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d；挑取單菌落在OMA培養(yǎng)基上劃線純化3次，得到純化后的菌株［21］。

將采集的馬鈴薯瘡痂病發(fā)病地塊土壤于自然條件下風干1 d，用無菌研缽研細，利用稀釋涂布法，稱取1 g根際土壤，加9 mL無菌水，渦旋混勻，靜置30 min后進行101、102、103倍梯度稀釋。取50 μL混懸液分別涂布于OMA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d。挑取單菌落在OMA培養(yǎng)基上純化并編號，純化菌株轉(zhuǎn)接斜面置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 病原菌的致病基因測定

根據(jù)報道，產(chǎn)生鏈霉菌致病性的基因，包括參與 thaxtomins類生物合成的致病基因（txtAB）、壞死基因（nec1）和番茄紅素酶基因（tomA）通常聚集在一個致病島（PAI）中，是參與菌株致病全過程的毒性因子，將病原菌是否含有txtAB基因作為該菌是否具有致病性的檢測指標［22］。通過PCR擴增的方法，檢測鏈霉菌中是否含有致病基因。以對照菌株S. scabies YN為陽性對照，對txtAB、nec1、tomA基因進行檢測。致病基因檢測PCR反應(yīng)體系見表1，引物序列如表2所示，擴增條件如表3所示，PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 病原菌的致病性測定

利用小薯片法、蘿卜苗法測定含有致病基因的鏈霉菌菌株的致病性［26-27］。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學及生物學特性

病原菌形態(tài)特征觀察：挑取OMA平板上生長5 d的鏈霉菌單菌落置于載玻片上，40×光學顯微鏡下觀察鏈霉菌孢子形態(tài)特征。根據(jù)國際鏈霉菌計劃（ISP）方法，進行生理生化鑒定。

1.2.5 16S rDNA序列分析菌株基因組DNA的提取參照文獻［28］中的方法進行。采用16S rDNA通用引物，通用引物為27F、1492R，PCR反應(yīng)體系為30 μL：15 μL Mix，2 μL模板，ddH2O 11 μL，上下游引物各1 μL，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測定。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上比對，利用Mega7.0構(gòu)建發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離

馬鈴薯塊莖病健交界處組織和馬鈴薯根際土壤中共分離純化得到97株放線菌，其中鏈霉菌32株，對分離得到的菌株進行初步歸類并編號。

2.2 馬鈴薯瘡痂病病原的致病性測定

2.2.1 病原菌的致病基因PCR檢測

根據(jù)致病基因測定方法，對篩選得到的鏈霉菌進行致病基因檢測，結(jié)果表明，4株鏈霉菌具有致病基因，其中2株具有txtAB基因，K1-4和T6同時具有txtAB、nec1、tomA等3種致病基因（圖2）所示。

蘿卜幼苗法表明，致病鏈霉菌菌株均能抑制蘿卜幼苗的生長，其中K1-4菌株抑制率達到80.86%，僅次于陽性對照菌株（表4）。與空白對照組相比致病菌株菌懸液處理組小蘿卜幼苗的根部和苗明顯受到抑制且部分有壞死現(xiàn)象（圖3）。因此，4株致病性鏈霉菌菌株均具有較強的致病性。

利用小薯片法和蘿卜片法對具有致病基因的4株菌株進行致病性測定，7 d后可觀察到蘿卜片中央有壞死現(xiàn)象，薯片表面變褐有凹陷，而對照的小薯片和蘿卜片無變化（圖4）。

2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

2.3.1 形態(tài)學描述

菌株T6、K1-4、5-51、B4K3-21 等4種菌株在OMA平板上形態(tài)特征見圖5。T6、K1-4、5-51菌落呈灰白色， 邊緣稍有褶皺突起，呈同心圓狀，革蘭氏染色呈陽性，孢子呈灰色，孢子鏈呈直柔曲狀（圖5）。B4K3-21菌落呈白色，革蘭氏染色呈陽性，孢子呈白色。

2.3.2 病原菌生物學特性的測定

各菌株生物學測定結(jié)果見表5。菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21均能以D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、D-甘露醇為單一碳源，以L-賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸為單一氮源，對結(jié)晶紫和苯酚敏感，在含10％的NaCl培養(yǎng)基中無法生長，均能產(chǎn)生黑色素、H2S和淀粉酶（表5）。

2.3.3 病原菌的16S rDNA序列分析

采用細菌通用引物，對分離到的鏈霉菌菌株進行擴增，得到長度為1 500 bp的16S rDNA片段（圖6），本研究選取K1-4、T6、5-51、B4K3-21的16S rDNA片段送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。通過在NCBI GenBank中進行BLAST比對，證明以上4個菌株均為鏈霉菌的16S rDNA序列。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示（圖7、圖8），菌株K1-4、T6、5-51 與Streptomyces galilaeus（MK 424308.1）的親緣關(guān)系最近，相似率為99.86%。菌株B4K3-21與Streptomyces europaeiscabiei（NR116533.1）的親緣關(guān)系最近，相似率為99.64%，結(jié)合形態(tài)學特征，將其初步鑒定為S. europaeiscabiei。

3 討論

馬鈴薯瘡痂病的主要傳播方式為種薯和土壤傳播，其中帶病種薯的區(qū)域間調(diào)撥是致使不同種瘡痂病病原菌大范圍擴散的主要原因。在鑒定病原菌的過程中，各生物學特性可能存在地域性差異，不同地區(qū)間相同種屬的不同菌株亦可能存在差異，因此要盡可能選取更多的生物學指標進行系統(tǒng)分析。國內(nèi)對馬鈴薯瘡痂病病原菌的相關(guān)研究較晚，截至目前我國已報道的瘡痂鏈霉菌病原共計18種，在河北省鑒定出3個致病種——S. diastatochromogenes、S. europaeiscabiei和瘡痂鏈霉菌［29］；在黑龍江省鑒定出4個致病種——普通瘡痂鏈霉菌、酸式瘡痂鏈霉菌、腫痂鏈霉菌和歐式瘡痂鏈霉菌［30］；新病原菌的不斷出現(xiàn)表明我國瘡痂鏈霉菌的病原組成具有多樣性。

由于鏈霉菌種類受環(huán)境和氣候影響較大，因此明確當?shù)伛R鈴薯瘡痂病病原菌的種類，才能更有效地制定病害防控措施。

本研究對新疆奇臺地區(qū)分離出的病原菌菌株進行生物學特性和16S rDNA序列分析，將造成新疆奇臺縣的馬鈴薯瘡痂病的病原鑒定為S. galilaeus和S. europaeiscabie，研究發(fā)現(xiàn)S. galilaeus的致病力僅次于S. scabies。在前人研究中，對伊犁地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原進行分離鑒定到S. acidiscabies、S. scabies等2種瘡痂鏈霉菌，其中分離到的S. acidiscabies致病性較強，對小蘿卜幼苗抑制率為70.6%。

本試驗在新疆奇臺縣分離到2種病原菌分別為S. galilaeus和S. europaeiscabie，其中S. galilaeus K1-4、T6和5-51菌株的蘿卜苗抑制率分別為80.86%、77.42%、73.55%，S. europaeiscabie B4K3-21 對小蘿卜幼苗抑制率為77.20%，致病性明顯高于酸式瘡痂鏈霉菌，且這2株菌為新疆首次報道的病原菌，通過對特定地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌的分離和鑒定，可為新疆奇臺地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的防治提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

以新疆奇臺縣馬鈴薯種植地采集的土壤和病署塊莖為研究對象，經(jīng)形態(tài)學及16S rDNA序列同源性分析初步鑒定該菌株與S. galilaeus和S. europaeiscabie同源性相近，均為新疆首次報道的馬鈴薯瘡痂病病原菌。致病基因PCR擴增試驗篩選得到4株具有致病基因的菌株，其中K1-4和T6同時含有3種致病基因txtAB、tomA、nec1。致病性試驗證實，菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21均可以抑制蘿卜幼苗的生長，使小薯片表面變褐有凹陷，小蘿卜片表面壞死，而對照無發(fā)病現(xiàn)象。生物學特性顯示菌株K1-4、T6、5-51、B4K3-21能利用D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖、肌醇、D-甘露醇6種碳源，能利用L-賴氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等3種氮源，對苯酚和結(jié)晶紫敏感，在含10％ NaCl培養(yǎng)基中不能生長，均能產(chǎn)生黑色素、H2S和淀粉酶。

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收稿日期：2022-07-24

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)重點研發(fā)任務(wù)專項（編號：2022B02044-2）；新疆農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新重點培育專項（編號：Xjkcpy-202203）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室開放基金（編號：KFJJ202006）。

作者簡介：劉曉祿（1997—），男，新疆奇臺人，碩士研究生，主要從事微生物活性產(chǎn)物研究。E-mail：1738634315 @qq.com。

通信作者：包曉瑋，博士，教授，主要從事食品營養(yǎng)與安全研究，E-mail：408531623@qq.com；宋素琴，碩士，研究員，主要從事微生物活性產(chǎn)物及作物病害研究，E-mail：suqin_song@163.com。