骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的不良影響及其分子機(jī)制

吳超神　顧葉　葛婷

［摘 要］隨著老齡人口數(shù)量迅速增長(zhǎng)，老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)重。臨床科研工作者愈發(fā)重視衰老性疾病的診治，提高老年人的生活質(zhì)量。在這一過(guò)程中，基于細(xì)胞的治療手段顯示出其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中主要的候選細(xì)胞，具有獨(dú)特的自我更新和分化潛能，以及顯著的免疫調(diào)節(jié)活性。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生復(fù)制性衰老，可引起包括骨質(zhì)疏松在內(nèi)的與年齡相關(guān)的退行性疾病，其中端?？s短、氧化應(yīng)激損傷和表觀遺傳學(xué)改變是導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的重要因素。以“bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs，senescence，aging”為英文檢索詞，以“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、衰老”為中文檢索詞，分別檢索PubMed和中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的相關(guān)文獻(xiàn)，綜述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的研究進(jìn)展，以期為相關(guān)衰老性疾病的診治提供新的依據(jù)。

［關(guān)鍵詞］ 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；衰老；端粒；氧化應(yīng)激；表觀遺傳學(xué)

［中圖分類號(hào)］ R 329.2 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號(hào)］ 1005-0310（2023）02-0064-08

Adverse Effects of Senescence on Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells and Their Molecular Mechanism

WU? Chaoshen， GU? Ye， GE? Ting

（Central Laboratory/Department of Orthopedics， Changshu No.1 Peoples Hospital， Changshu Jiangsu 215500，? China）

Abstract： The aging population is increasing rapidly and the phenomenon of aging is becoming more and more common. Clinical researchers are increasingly paying attention to the? diagnosis and treatment of senile diseases to improve the quality of life of the elderly. In this process， cell-based therapy is showing its unique advantages and broad application prospects. Bone marrow mesenchymal stem cells are the main candidate cells for tissue engineering and regenerative medicine， with unique self-renewal and differentiation potential and significant immunomodulatory activity. Replicative senescence of bone marrow mesenchymal stem cells may cause age-related degenerative diseases including osteoporosis， among which telomere shortening， oxidative stress damage， and epigenetic changes are important factors leading to senescence of bone marrow mesenchymal stem cells. In this paper， “Bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs， senescence， aging” were used as the English keywords and bone marrow mesenchymal stem cells， senescence” as the Chinese keywords. The relevant literature reports included in PubMed and CNKI databases were retrieved respectively. The research progress of bone marrow mesenchymal stem cell senescence was reviewed to provide new insights for the diagnosis and treatment of related aging diseases.

Keywords： Bone marrow mesenchymal stem cells；Senescence；Telomere；Oxidative stress；Epigenetics

0 引言

隨著醫(yī)療技術(shù)的迅速發(fā)展和生活方式的改善，人類的平均預(yù)期壽命顯著增長(zhǎng)，全球人口正在迅速老齡化，衰老也日益普遍。衰老是指隨著時(shí)間的推移，生理功能的逐步喪失，在機(jī)體和細(xì)胞水平上，導(dǎo)致組織和器官的功能障礙［1］。衰老是一種與年齡相關(guān)的老年綜合征，影響著老年人的生活質(zhì)量。老年人發(fā)生意外導(dǎo)致不良健康結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)較大，如摔傷、殘疾和死亡等，同時(shí)支出的醫(yī)療費(fèi)用增加，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，日益成為全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［2］。

老年科學(xué)假說(shuō)指出，大多數(shù)與衰老相關(guān)的疾病都是由共同的和相互依賴的條件維持的，包括慢性低度炎癥、大分子/細(xì)胞器功能障礙、衰老細(xì)胞的積累和干細(xì)胞功能障礙［3］。

分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，使得基于細(xì)胞的治療正在成為一種創(chuàng)新方法，用于治療多種與衰老相關(guān)的退行性疾病，而隨著老年患者數(shù)量的不斷增長(zhǎng)，他們逐漸成為受益于細(xì)胞療法的主要目標(biāo)人群。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSCs）是一種具有自我更新和多向分化能力的多潛能細(xì)胞，是非造血組織的非定向前體，在組織的維護(hù)、修復(fù)和再生中發(fā)揮著重要作用。這一術(shù)語(yǔ)最初是由Caplan于1991年提出的［4］，隨后被大多數(shù)學(xué)者廣泛采用。MSCs可以從大多數(shù)器官的結(jié)締組織中分離出來(lái)，包括骨髓、骨膜、肌肉、滑膜液、毛囊、臍帶血、脂肪和胎盤等，并在人類、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物等多個(gè)物種中被報(bào)道。骨髓仍是MSCs 最重要的來(lái)源，大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)是基于骨髓開(kāi)展研究的。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是干細(xì)胞家族的重要成員之一，源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，它可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞等，用于維持人體正常的骨代謝。

1 數(shù)據(jù)和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

在PubMed和中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索1970年1月至2022年7月出版的文獻(xiàn)，英文檢索詞為“bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs，senescence，aging”；中文檢索詞為“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、衰老”。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

通過(guò)文獻(xiàn)標(biāo)題和摘要進(jìn)行初步篩選，選取論述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及衰老的相關(guān)研究文獻(xiàn)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

1）排除內(nèi)容與主題無(wú)關(guān)或陳舊、重復(fù)的研究文獻(xiàn)；

2） 排除邏輯不嚴(yán)謹(jǐn)、可信度差的文獻(xiàn)。

1.3 質(zhì)量評(píng)估與數(shù)據(jù)提取

通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索與手工檢索，共檢索到416篇參考文獻(xiàn)。按入選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行人工篩選，排除與主題相關(guān)性差及內(nèi)容陳舊、重復(fù)的文獻(xiàn)，最終對(duì)34篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述分析。

2 結(jié)果2.1 BMSCs的獲取、鑒定及生物學(xué)功能分析

BMSCs數(shù)量稀少，需經(jīng)分離、擴(kuò)大培養(yǎng)和鑒定后，才能發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)特性。它適用于加強(qiáng)組織修復(fù)，治療退行性疾病，甚至改善與正常衰老相關(guān)的功能障礙。

2.1.1 BMSCs的獲取

BMSCs在骨髓中的含量極低，不足單核細(xì)胞總數(shù)的0.01%，在進(jìn)行科學(xué)研究和臨床應(yīng)用前一般需進(jìn)行體外擴(kuò)增，才能達(dá)到細(xì)胞的數(shù)量要求。常用的獲取BMSCs的方法有貼壁分離法、密度梯度離心法和基于流式細(xì)胞儀的免疫磁珠分選法，其中貼壁分離法是利用BMSCs易于貼壁而其他細(xì)胞較難貼壁的原理，通過(guò)多次換液將其他細(xì)胞剔除，從而達(dá)到純化的目的。這種方法因其簡(jiǎn)單有效，至今仍是最經(jīng)典的BMSCs獲取方法，被廣泛采用。

2.1.2 BMSCs的鑒定

不同實(shí)驗(yàn)室分離和培養(yǎng)程序的差異推動(dòng)了BMSCs鑒定的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展。2006年，國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（The International Society for Cellular Therapy，ISCT）提出了定義人類BMSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)胞具有粘附性，能夠貼壁培養(yǎng)；②細(xì)胞表面標(biāo)志物CD73、CD90和CD105呈陽(yáng)性，造血標(biāo)志物CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45、CD79α和HLA-DR呈陰性；③具備分化潛能，在體外標(biāo)準(zhǔn)分化條件下向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化［5］。BMSCs在滿足以上標(biāo)準(zhǔn)的同時(shí)，顯微鏡下觀察一般呈紡錘形、旋渦狀生長(zhǎng)。

鑒定BMSCs的標(biāo)準(zhǔn)雖然簡(jiǎn)潔方便，但其免疫表型在人工體外培養(yǎng)條件下可能發(fā)生改變。同時(shí)，其他潛在的陽(yáng)性和陰性抗原標(biāo)記也被不斷發(fā)現(xiàn)。由于不同研究人員推薦的BMSCs標(biāo)記組合存在差異，因此BMSCs的鑒定仍存在一定困難。

2.1.3 BMSCs的生物學(xué)功能

BMSCs的活性變化影響骨髓和髓外組織的衰老。在衰老的背景下，進(jìn)一步了解BMSCs的生物學(xué)特性至關(guān)重要。BMSCs調(diào)節(jié)骨生長(zhǎng)和骨重塑，形成將骨鈣素沉積在礦化骨組織中的成骨細(xì)胞，并通過(guò)旁分泌刺激調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞通過(guò)骨吸收協(xié)調(diào)骨鈣素的釋放和激活。自體骨髓移植的安全性較高，可以避免產(chǎn)生與干細(xì)胞移植相關(guān)的倫理問(wèn)題。BMSCs被認(rèn)為是一種更安全的細(xì)胞治療來(lái)源，患者自身的BMSCs可用于治療骨折愈合不良、退行性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥（Multiple sclerosis，MS）等一系列臨床疾病和損傷。已有研究者提出，BMSCs有助于組織和器官的修復(fù)，并在多種靶組織的再生中具有治療潛力［6］，是一種重要的移植細(xì)胞來(lái)源。

BMSCs不僅具有強(qiáng)大的分化潛能，還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，有助于免疫抑制和組織愈合。近年來(lái)，有研究表明，BMSCs不僅可以抑制T細(xì)胞增殖和產(chǎn)生免疫細(xì)胞因子活性，還能抑制B細(xì)胞合成抗體和NK細(xì)胞的非特異性殺傷功能［7-8］。此外，BMSCs表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ 分子，不表達(dá)MHC Ⅱ 分子，可以保護(hù)BMSCs免受宿主的免疫監(jiān)測(cè)。因此，BMSCs自身的低免疫原性可用于異體移植而不會(huì)引起嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，這些特性可使BMSCs參與以移植物抗宿主病（Graft versus-host disease，GVHD）為代表的免疫相關(guān)疾病的臨床治療。

迄今為止，BMSCs被認(rèn)為是最有希望用于細(xì)胞治療的干細(xì)胞類型之一，它具有獨(dú)特的自我更新能力和廣泛的分化潛力，在修復(fù)受損骨的結(jié)構(gòu)和功能方面具有明顯的治療優(yōu)勢(shì)，引起再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。

2.2 BMSCs的衰老

BMSCs經(jīng)歷復(fù)制衰竭后，在氧化應(yīng)激、紫外線照射和化學(xué)物質(zhì)的刺激下，自身的再生能力下降，自我更新和分化潛能受損，產(chǎn)生增殖潛能降低、衰老細(xì)胞數(shù)量增加和體內(nèi)骨形成缺失等與年齡相關(guān)的變化，可導(dǎo)致包括骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松在內(nèi)的退行性疾病的發(fā)生。

2.2.1 BMSCs衰老特征

BMSCs經(jīng)歷增殖和分化后，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)的一系列變化，也會(huì)迎來(lái)自身的逐步衰老，這是細(xì)胞的正常歸宿。這與細(xì)胞衰老的海弗利克限制（Hayflick limit）有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞分裂次數(shù)達(dá)到Hayflick限制，亦稱最大分裂次數(shù)時(shí)，細(xì)胞就會(huì)衰老，啟動(dòng)自身的凋亡程序而死亡。BMSCs在培養(yǎng)初期保持其紡錘體樣的特征形態(tài)，經(jīng)過(guò)20～30次種群分裂后，BMSCs胞體增大，胞質(zhì)多呈顆粒狀，內(nèi)含許多包涵體，失去其特有的紡錘體樣結(jié)構(gòu)，增殖能力低于年輕的同類細(xì)胞。隨著培養(yǎng)時(shí)間和供體年齡的增加，BMSCs的增殖能力逐漸喪失，還伴有分化能力的丟失，經(jīng)歷復(fù)制性衰老。

在BMSCs衰老的過(guò)程中，有一系列衰老標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，有助于更好地了解和監(jiān)測(cè)BMSCs的衰老進(jìn)程，如與衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-Galactosidase，SA-β-gal）、p53、p21和p16INK4α，其中SA-β-gal最為常見(jiàn)。SA-β-gal的活性與體外細(xì)胞衰老有關(guān)，反映細(xì)胞溶酶體的功能狀態(tài)，由于其易于檢測(cè)，因此是衰老細(xì)胞中使用最廣泛的生物標(biāo)志物之一。SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量在晚期傳代細(xì)胞中增加，活性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖停滯。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，與年輕捐獻(xiàn)者相比，在年老捐獻(xiàn)者獲得的培養(yǎng)物中，SA-β-gal的積累增加，表明年老捐獻(xiàn)者的BMSCs可能在體內(nèi)經(jīng)歷了更多的傳代倍增。Stolzing等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在來(lái)自老年人的BMSCs中，p53和p21以及細(xì)胞凋亡的水平升高。p53是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑和衰老標(biāo)志物，在應(yīng)激和細(xì)胞功能障礙誘導(dǎo)衰老的凋亡反應(yīng)中具有重要作用。p53和p21隨著年齡增長(zhǎng)表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)BMSCs增殖和成骨細(xì)胞的生成減少。

目前絕大多數(shù)關(guān)于BMSCs衰老的研究都是在體外擴(kuò)大培養(yǎng)的條件下進(jìn)行的。這些BMSCs在連續(xù)的傳代增殖中經(jīng)歷了衰老過(guò)程，發(fā)生形態(tài)、表型和遺傳的變化，但這些研究?jī)H提供了BMSCs在體內(nèi)如何衰老的間接證據(jù)。在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)和擴(kuò)展這些細(xì)胞時(shí)可能受到多種因素的影響，如細(xì)胞來(lái)源、供體年齡和患者的病理?xiàng)l件等［10］，并沒(méi)有反映體內(nèi)的生態(tài)位。因此，BMSCs在體內(nèi)和體外的衰老可能既有共同特征，也存在一定的差異。

2.2.2 BMSCs衰老的不良影響

細(xì)胞衰老會(huì)損害BMSCs自我更新和分化潛能，從而限制其在組織器官修復(fù)、異體移植和退行性疾病中的治療效果。BMSCs的數(shù)量往往隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，其分化為不同類型組織的能力也隨著年齡的增長(zhǎng)而改變，表現(xiàn)出退行性特征，包括成骨分化能力和增殖能力的下降以及成脂分化能力的增強(qiáng)［10］，最終導(dǎo)致骨骼老化。越來(lái)越多的證據(jù)表明，BMSCs老化以損害成骨為代價(jià)促進(jìn)脂肪的生成，導(dǎo)致骨形成能力受損，這與體內(nèi)衰老過(guò)程中骨髓中脂肪組織增加的現(xiàn)象一致。這種變化可能是由于與PDZ結(jié)合的基序轉(zhuǎn)錄共激活因子（Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ ）的表達(dá)減少，從而提高過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）的表達(dá)。PPAR-γ作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子參與體內(nèi)外脂肪細(xì)胞分化，通過(guò)抑制與成骨相關(guān)的runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）的表達(dá)，誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化［11］。Cao等［12］通過(guò)條件敲除小鼠體內(nèi)的PPAR-γ，發(fā)現(xiàn)小鼠血清中脂聯(lián)素、抵抗素和瘦素等脂肪因子的濃度降低，同時(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞炎癥相關(guān)基因的表達(dá)水平明顯下降。靶向PPAR-γ被認(rèn)為是防止衰老過(guò)程中骨丟失的一種潛在策略。Baker等［13］研究表明，老年人BMSCs的成骨分化能力受損是導(dǎo)致年齡相關(guān)性骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)重要原因。BMSCs這一系列功能和生物學(xué)性狀的退化，可能導(dǎo)致人體衰老及與年齡相關(guān)的退行性疾病的發(fā)生。

2.3 BMSCs衰老的分子機(jī)制

BMSCs衰老是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，是伴隨著代謝、遺傳、表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯變化引起的功能改變［14］。BMSCs衰老往往涉及多種信號(hào)通路，如p53/p21、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤（p16/RB）、蛋白激酶B（Akt/mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期永久阻滯和不可逆損傷［15］。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多分子參與BMSCs的衰老，如叉頭框蛋白P1（Forkhead box P1，F(xiàn)OXP1）。FOXP1的表達(dá)水平與衰老標(biāo)志物p16INK4α的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。啟動(dòng)子占位分析顯示，F(xiàn)OXP1通過(guò)直接抑制p16INK4α的轉(zhuǎn)錄來(lái)減緩BMSCs的衰老，同時(shí)以劑量和年齡依賴的方式維持其復(fù)制能力［16］。BMSCs衰老的不同分子機(jī)制已被證實(shí)，包括端?？s短、氧化應(yīng)激損傷和表觀遺傳學(xué)的改變等，這些理論近年來(lái)得到了較為詳盡的探究。

2.3.1 端粒酶學(xué)說(shuō)

絕大多數(shù)衰老細(xì)胞中都存在端粒（Telomere）縮短的現(xiàn)象，端粒酶（Telomerase）學(xué)說(shuō)被認(rèn)為是細(xì)胞衰老的第一可能機(jī)制［17］。這一學(xué)說(shuō)在BMSCs的衰老中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它保持染色體的完整性，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞的分裂周期。端粒長(zhǎng)度是細(xì)胞復(fù)制能力的良好預(yù)測(cè)指標(biāo)，被稱為細(xì)胞壽命的“有絲分裂鐘”。Stenderup等［18］研究發(fā)現(xiàn)，端粒在BMSCs中以每?jī)纱?00 bp的速度縮短，端粒平均長(zhǎng)度從早期傳代細(xì)胞的10.4 kbp減少至晚期傳代細(xì)胞的7.1 kbp。當(dāng)端?？s短至某一長(zhǎng)度時(shí)，細(xì)胞即停止復(fù)制，進(jìn)入衰老狀態(tài)。大量研究表明，干細(xì)胞增殖、分化和歸巢能力下降以及衰竭可能是由干細(xì)胞端粒長(zhǎng)度縮短所致，并且干細(xì)胞的自我更新能力和端粒長(zhǎng)度與供體年齡有著很強(qiáng)的相關(guān)性。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，通過(guò)將DNA重復(fù)序列（TTAGGG）添加到真核生物染色體末端端粒區(qū)域DNA鏈的3′端，從而延長(zhǎng)DNA鏈中的端粒，防止衰老細(xì)胞處于有絲分裂后狀態(tài)及凋亡的發(fā)生。雖然許多研究已經(jīng)檢測(cè)到BMSCs中端粒酶的活性，并且衰老的BMSCs往往表現(xiàn)出端粒酶活性下調(diào)，但BMSCs是否具有端粒酶活性仍然存在爭(zhēng)議，尚未達(dá)成共識(shí)。這一爭(zhēng)議主要是由于端粒酶活性測(cè)定的方法不同，這些測(cè)定方法的敏感性以及來(lái)自不同年齡的供體和物種的BMSCs導(dǎo)致獲得的結(jié)果不一致。

已有研究試圖通過(guò)誘導(dǎo)端粒酶的異位表達(dá)來(lái)緩解由于BMSCs衰老導(dǎo)致的功能退化。Shi等［19］認(rèn)為，強(qiáng)制上調(diào)端粒酶可以增加BMSCs的分裂時(shí)間，增強(qiáng)分化潛力，說(shuō)明端粒酶活性在維持BMSCs的增殖和分化潛能方面發(fā)揮著重要作用，端粒酶活性異常導(dǎo)致BMSCs的衰老。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（Telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶的催化成分，在端粒酶的活化中扮演著關(guān)鍵角色。TERT的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞均處于失活狀態(tài)，僅在生殖細(xì)胞、干細(xì)胞和約90%含有功能性端粒酶的癌細(xì)胞中高表達(dá)。Bocker等［20］研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)的TERT可以防止BMSCs衰老，恢復(fù)細(xì)胞染色體的穩(wěn)定性，表現(xiàn)出更高的增殖能力。Tsai等［21］發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的TERT可以重建端粒酶的活性，并誘導(dǎo)BMSCs壽命的延長(zhǎng)。

2.3.2 氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)

氧化應(yīng)激在BMSCs老化過(guò)程中至關(guān)重要，而且很可能是延長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致衰老的一個(gè)關(guān)鍵因素。線粒體作為生命活動(dòng)和新陳代謝所需能量的供應(yīng)者，能量的供應(yīng)伴隨著不穩(wěn)定的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）生成。ROS主要包括超氧陰離子自由基（O2—）、過(guò)氧化氫（H2O2）和羥自由基（OH—）等，一定水平的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生適度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，有利于細(xì)胞生存，維持體內(nèi)平衡。

在BMSCs培養(yǎng)過(guò)程中，線粒體會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，氧化呼吸鏈功能障礙引起ROS釋放增加。ROS積累可導(dǎo)致衰老細(xì)胞中核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性增強(qiáng)。NF-κB是骨重建過(guò)程中的主要調(diào)節(jié)因子。Lin等［22］發(fā)現(xiàn)，老年小鼠BMSCs成骨減少與NF-κB活性增強(qiáng)相關(guān)，NF-κB通過(guò)增強(qiáng)β連環(huán)蛋白（β-catenin）的降解來(lái)抑制其成骨分化作用。當(dāng)體內(nèi)的抗氧化劑和ROS之間失去平衡，大量蓄積的ROS會(huì)損害線粒體本身，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的大分子包括DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的損傷，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，最終由于損傷積累引起氧化性衰老。幾乎所有衰老細(xì)胞都遭受線粒體損傷和氧化應(yīng)激損傷。Wu等［23］利用DNA芯片技術(shù)分析來(lái)自不同年齡供體的間充質(zhì)干細(xì)胞，篩選出CTNNB1、FYN、PPP2R1A、PIK3C2A和MAPK1等基因在氧化應(yīng)激中發(fā)揮作用。其中CTNNB1編碼的β-catenin蛋白是抵抗氧化損傷所必需的。Hurley等［24］研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)度激活Wnt/β-catenin信號(hào)可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，導(dǎo)致DNA損傷。

雖然BMSCs來(lái)自不同年齡的捐贈(zèng)者，但它們具有相似的細(xì)胞適應(yīng)性。缺氧是一種更接近體內(nèi)氧水平的培養(yǎng)條件，被認(rèn)為可以延緩細(xì)胞衰老。在長(zhǎng)期低氧環(huán)境下，BMSCs減少氧氣消耗和ROS的生成，改善自身的生長(zhǎng)狀態(tài)并減少凋亡的發(fā)生，從而獲得更高的基因組穩(wěn)定性。Rosova等［25］發(fā)現(xiàn)，在5%氧氣濃度的環(huán)境下處理來(lái)自不同年齡供體的BMSCs細(xì)胞系，與傳統(tǒng)的21%氧氣濃度相比，可以使細(xì)胞生長(zhǎng)得更強(qiáng)健，氧化應(yīng)激反應(yīng)更少。BMSCs在32℃低溫培養(yǎng)時(shí)耗氧更少，直接降低有氧呼吸產(chǎn)生的自由基，誘導(dǎo)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老和凋亡。低溫培養(yǎng)還通過(guò)改變p53和p21的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)BMSCs的自我更新能力，維持BMSCs的多能性。

一系列藥物如低劑量異硫氰酸酯已經(jīng)被用于體外延緩BMSCs衰老，它可通過(guò)減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和保護(hù)BMSCs免受化學(xué)誘導(dǎo)的氧化損傷反應(yīng)來(lái)發(fā)揮作用。在一項(xiàng)研究中，Sun等［26］通過(guò)提供年輕細(xì)胞外基質(zhì)而不是陳舊細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)糾正年老BMSCs自我更新和骨形成能力的缺陷，發(fā)現(xiàn)年輕細(xì)胞外基質(zhì)能夠降低BMSCs擴(kuò)張和分化過(guò)程中的ROS水平，保護(hù)BMSCs免受氧化應(yīng)激損傷，糾正成骨譜系向成脂譜系轉(zhuǎn)變，維持骨細(xì)胞功能并保持骨骼穩(wěn)態(tài)。Peffers等［27］通過(guò)對(duì)BMSCs成骨、成軟骨和成腱結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定隨年齡增長(zhǎng)而差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，建議在以BMSCs為基礎(chǔ)的老年人治療方法中需要關(guān)注對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)。

2.3.3 表觀遺傳學(xué)的改變

表觀遺傳學(xué)是指在基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳變化。表觀遺傳調(diào)控涉及多種不同的生物學(xué)進(jìn)程，如染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控、X染色體失活、基因印跡和基因組不穩(wěn)定等，在細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。許多研究表明，隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的表觀基因組改變會(huì)影響干細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，因此考慮表觀基因組學(xué)對(duì)細(xì)胞衰老的影響十分必要。

表觀遺傳介質(zhì)通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾和ATP依賴的染色質(zhì)重塑，調(diào)節(jié)多能干細(xì)胞的分化。DNA甲基化是最早被發(fā)現(xiàn)，也是研究最深入的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一。它是指在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號(hào)碳位共價(jià)結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)，根據(jù)基因組區(qū)域的不同，增強(qiáng)或抑制基因的表達(dá)。BMSCs長(zhǎng)期培養(yǎng)DNA甲基化的變化分析顯示，甲基化模式總體上保持穩(wěn)定，但特定啟動(dòng)子區(qū)域的變化非常顯著，特別是同源盒基因（Homeobox genes）和細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子，這些變化與體內(nèi)衰老過(guò)程中觀察到的變化顯著重疊。在這些表觀遺傳修飾物中，Oh等［28］研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑RG108能夠通過(guò)增加間質(zhì)標(biāo)記物CD105、NANOG和Sox4以及TERT的表達(dá)，特別是減少啟動(dòng)子的甲基化，來(lái)挽救BMSCs的干細(xì)胞特性，同時(shí)該種治療能夠降低衰老標(biāo)志物p53和p21的表達(dá)。Li等［29］研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs衰老導(dǎo)致的表觀遺傳失調(diào)會(huì)抑制參與自我更新的基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致分化功能出現(xiàn)障礙。Jung等［30］通過(guò)體外研究表明，在BMSCs的衰老過(guò)程中，組蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）表達(dá)降低，這一過(guò)程可以通過(guò)應(yīng)用HDACs抑制劑來(lái)誘導(dǎo)。

MicroRNAs（miRNAs）已成為與細(xì)胞衰老相關(guān)的基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子，這是一類長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)mRNA降解或翻譯抑制參與調(diào)控靶基因的表達(dá)。有證據(jù)表明，miR-199a直接參與軟骨和成骨的分化。Faraonio等［31］的研究指出，正常人類二倍體成纖維細(xì)胞的復(fù)制性衰老伴隨著一系列miRNAs的表達(dá)改變，包括14個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)和10個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)。Okada等［32］發(fā)現(xiàn)，miR-195的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增加，并且年齡誘導(dǎo)的miR-195消失可以通過(guò)誘導(dǎo)端粒酶的活化而使衰老的BMSCs恢復(fù)活力，延長(zhǎng)端粒的長(zhǎng)度。Davis等［33］將研究重心轉(zhuǎn)移到微囊泡和外泌體介導(dǎo)的miRNAs上，該種miRNAs轉(zhuǎn)運(yùn)是一種新的細(xì)胞和分子通訊途徑。在這項(xiàng)研究中，驗(yàn)證了細(xì)胞外囊泡及其miRNAs可能隨著年齡的變化而改變，從而得到年齡相關(guān)干細(xì)胞功能障礙的假設(shè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-183-5p在骨源性細(xì)胞外囊泡中隨年齡增長(zhǎng)，抑制BMSCs的增殖，誘導(dǎo)干細(xì)胞衰老。Pandey等［34］研究了年輕和年老供體中分離的BMSCs的miRNAs表達(dá)譜，分析顯示，隨著年齡的增長(zhǎng)，活性miRNAs的小亞群發(fā)生了變化，其中抑制性κB激酶（Inhibitory kappa-B kinase，IB）、IL-1α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）、MAPK、ERK1/2、c-fos和c-jun的基因表達(dá)水平顯著降低， 而NF-κB、myc和IL-4受體的mRNA水平在骨髓庫(kù)的老化細(xì)胞中明顯升高。這一系列研究結(jié)果顯示miRNAs是參與細(xì)胞衰老的重要組成部分。目前報(bào)道的與年齡相關(guān)的miRNAs豐度的減少及其在間充質(zhì)干細(xì)胞中的可能作用已成為一個(gè)重要的前沿研究領(lǐng)域，值得進(jìn)一步探究。

如上所述，BMSCs衰老往往是由體內(nèi)外多種因素共同導(dǎo)致的，包括端?？s短、氧化應(yīng)激和表觀遺傳學(xué)的改變等。不斷涌現(xiàn)的新理論和新學(xué)說(shuō)，對(duì)理解BMSCs衰老的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)新的治療方案大有裨益。

3 總結(jié)與展望

目前，BMSCs已用于軟骨修復(fù)和骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞治療的臨床實(shí)驗(yàn)，在骨折愈合和肌腱治療中也有應(yīng)用，但由于其在老年慢性病患者中的再生潛力衰減，在大多數(shù)臨床應(yīng)用中的治療效果仍然有限。供體年齡也是影響B(tài)MSCs形態(tài)、增殖潛力和分化能力的關(guān)鍵因素，來(lái)自不同年齡供體的BMSCs的特征差異導(dǎo)致細(xì)胞的治療效果參差不齊，在移植研究前應(yīng)選擇理想的細(xì)胞來(lái)源。

綜上所述，BMSCs是一類具有自我更新和多向分化能力的祖細(xì)胞群，可修復(fù)廣泛的組織損傷和調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)，甚至改善由正常衰老引起的功能障礙，被認(rèn)為是最有希望應(yīng)用于細(xì)胞治療的干細(xì)胞類型之一。BMSCs經(jīng)歷增殖和分化后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，失去其特有的紡錘體結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞分裂次數(shù)達(dá)到Hayflick限制時(shí)，發(fā)生復(fù)制性衰老，SA-β-gal、p53和p21等衰老標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用有助于更好地了解和監(jiān)測(cè)BMSCs的衰老進(jìn)程。一系列證據(jù)表明，BMSCs在體內(nèi)受到衰老的影響，導(dǎo)致其數(shù)量及多系分化、歸巢、免疫調(diào)節(jié)和傷口愈合等功能的年齡相關(guān)性下降，引發(fā)包括骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松在內(nèi)的與年齡相關(guān)的退行性疾病。有研究提出了以BMSCs為基礎(chǔ)的衰老治療的新思路，但目前臨床試驗(yàn)的規(guī)模和數(shù)量仍然不大，需要通過(guò)深入研究來(lái)闡明這種治療策略在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中是否安全有效。同時(shí)，盡管我們?cè)贐MSCs的衰老過(guò)程和潛在分子機(jī)制的研究上取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但BMSCs的衰老往往涉及多個(gè)分子和多條信號(hào)通路。目前雖然出現(xiàn)了端粒縮短、氧化應(yīng)激和表觀遺傳學(xué)改變等較為詳盡的研究，但仍有許多未探索的領(lǐng)域有待發(fā)現(xiàn)，有望進(jìn)一步探究后通過(guò)調(diào)節(jié)與BMSCs衰老過(guò)程相關(guān)的特定因素或者微環(huán)境來(lái)提高治療效果。我們有理由相信，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，BMSCs的應(yīng)用能夠成為預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)人體衰老的一種創(chuàng)新治療方法。

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（責(zé)任編輯 柴 智）

［收稿日期］ 2022-10-12

［基金項(xiàng)目］ 江蘇省重點(diǎn)研發(fā)（社會(huì)發(fā)展）項(xiàng)目“基于乙酰基-11-酮基-β-乳香酸提高假體生存率策略的建立及臨床應(yīng)用”（BE2021673）。

［作者簡(jiǎn)介］ 吳超神（1995—），男，江蘇常熟人，常熟市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)研究員，主要研究方向?yàn)殛P(guān)節(jié)外科研究；葛婷（1994—），女，江蘇泰州人，常熟市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)習(xí)研究員，主要研究方向?yàn)閯?chuàng)傷外科研究。

［通訊作者］顧葉（1981—），男，江蘇常熟人，常熟市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室副主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)楣强蒲芯?。E-mail： edwinguye@126.com