煙葉香型特征致香成分研究及含量測定

張疏雨，云 晶，張善林，郝 捷，柴林山，李劍梅，謝存一，朱萬芹，徐 沖

（1. 遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽 122000；2. 內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）

煙草是一種具有特殊香味的物質(zhì)，人們通過吸食香煙，品嘗其香味，可獲得一定程度上的享受[1]。香型是指在烤煙煙葉燃吸過程中，產(chǎn)生的煙氣所呈現(xiàn)的整體香氣類型或風(fēng)格[2]。而香韻是形成煙葉風(fēng)格特色的基礎(chǔ)，香韻的種類包括干草香、清甜香、焦甜香、正甜香、焦香、青香、辛香、木香、花香、果香、豆香、草藥香、堅果香、樹脂香、酒香等15種[3]。煙草所表現(xiàn)出的香氣類型與煙草中含有的化學(xué)物質(zhì)尤其是與煙葉香氣相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)的種類和含量息息相關(guān)，研究表明，與煙葉香氣有關(guān)的化學(xué)物質(zhì)主要包括有機酸類、醇類、羧基類、酯類和內(nèi)酯及雜環(huán)類化合物。這些煙葉致香物質(zhì)的產(chǎn)生一般不是煙草碳、氮等基本代謝過程的直接產(chǎn)物，而是先合成脂類、萜類等不具揮發(fā)的大分子化合物，然后進一步在酶或非酶的作用下，分解轉(zhuǎn)化形成的。這種不具揮發(fā)性的大分子化合物構(gòu)成了致香物質(zhì)成分的前體物質(zhì)，構(gòu)成煙葉香氣的前體物質(zhì)主要包括類胡蘿卜素類、類西柏烷類、賴百當(dāng)類、糖酯類、棕色反應(yīng)類化合物等，一種香氣的前體物質(zhì)經(jīng)特定的降解途徑可形成特定的致香物質(zhì)。通過大量文獻查閱，以麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素、芳樟醇、β -大馬酮為主要的考查指標，并采用高效液相色譜法（HPLC） 進行含量檢測，以期提供科學(xué)的、簡便的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

湖南永州（2019） 煙葉，內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 試劑

麥芽酚（批號：J16O6R4435，純度：98%）、乙基麥芽酚（批號：J16O6R4435，純度：98%）、香蘭素（批號：J24A6R2696，純度：98%）、β - 大馬酮標準品（HPLC≥98%）、芳樟醇標準品（HPLC≥98%），上海源葉生物科技有限公司提供；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技（中國） 有限公司提供；乙酸銨（色譜純），Xiya Chemical Technology（Shandong）Co.，Ltd 提供；甲酸（分析純），北京化工廠提供；甲醇（色譜純），星馬克提供。

GL-21M型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產(chǎn)品；Waters2695 型高效液相色譜儀、Waters2489 型二極管陣列檢測器，Waters 公司產(chǎn)品；色譜柱Luna C18（3） 儀器：100A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、色譜柱Symmetry R C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），安捷倫產(chǎn)品；KQ-50DA 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙葉特征致香成分研究

主要通過書籍及文獻報道，總結(jié)歸納煙葉香型特征致香物質(zhì)的種類，挖掘出對煙葉香韻貢獻較大的代表性成分，最終確定以芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素、芳樟醇、β - 大馬酮為考查對象，進行樣品中的含量測定。

1.2.2 樣品制備

準確稱取煙葉樣品5.000 g，用70%乙醇溶液對煙葉進行超聲提取30 min，于4 ℃下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心20 min，用針頭過濾器過0.22 μm有機微孔濾膜，備用。

1.2.3 麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素含量測定

①標準儲備液的配制，精密稱取麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素各10 mg（精確至0.1 mg），分別置于10 mL 容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到相應(yīng)標準儲備液，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，于4 ℃下冰箱保存。②混合標準中間溶液的配制，精密量取麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素標準儲備液各1.0 mL，置同一容量瓶（10 mL） 中，用水稀釋至刻度，搖勻，得到混合標準中間溶液質(zhì)量濃度為100 μg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。③混合標準工作溶液的配制，分別精密量取中間標準溶液0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL置于10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為2，4，8，16，32 μg/mL 的系列線性標準工作溶液，供高效液相色譜儀測定。④高效液相色譜條件，色譜柱：SymmetryR C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為以0.1%甲酸溶液∶甲醇= 85∶15（體積比），流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為273 nm，柱溫為30 ℃，進樣量10 μL。

1.2.4 芳樟醇高效液相法（HPLC） 含量分析方法研究

①芳樟醇標準溶液的配制，精密稱取芳樟醇標準品20.00 mg，置于5 mL 棕色容量瓶中，加入無水乙醇使其溶解，并定容至刻度，搖勻，制得4 mg/mL的芳樟醇母液，4 ℃下避光存放備用。②高效液相色譜條件，色譜柱：色譜柱SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流動相：乙腈∶水= 1∶1（體積比）；流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為205 nm，柱溫為30 ℃，進樣量10 μL。③標準曲線制備，從4 mg/mL 芳樟醇標準品母液中，分別準確吸取0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mL 至5 mL 棕色容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，制成梯度質(zhì)量濃度分別為160，480，800，1 120，1 760 μg/mL 芳樟醇標準使用液，按照上述高效液相色譜條件上機分析，記錄各濃度標準品溶液的吸收峰面積，以標準品溶液濃度為橫坐標、相應(yīng)的紫外吸收峰峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算曲線方程。同時，準確吸取供試樣品液10 mL，加入一定含量的芳樟醇標準品，制備成加標樣品液；分別取預(yù)先制備好的樣品液、加標樣品液上機分析，在規(guī)定的色譜條件下，定性考查樣品液中芳樟醇的特征吸收峰保留時間及分離效果。

1.2.5 β - 大馬酮高效液相法（HPLC） 含量分析方法研究

①β - 大馬酮標準溶液配制，精密稱取β - 大馬酮標準品20.00 mg，用20 μL 移液槍轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶（5 mL） 中，用甲醇（色譜純） 溶解并定容至刻度，即為4.00 mg/mL 的β - 大馬酮標準儲備液，4 ℃下避光保存，備用。②HPLC 色譜條件，色譜柱為SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流動相：甲醇（A） -30 mmol/L 乙酸銨水溶液（B），采用梯度洗脫程序進行檢測（表1），流速0.9 mL/min，紫外檢測波長227 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。③標準曲線制備，準確吸取0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 mL β - 大馬酮儲備液于5 mL 棕色容量瓶中，用色譜純甲醇定容至5 mL，即可得到質(zhì)量濃度分別為100，200，400，800，1 600 μg/mL 的β - 大馬酮標準使用液，按照上述高效液相色譜條件上機分析，記錄各濃度標準品溶液吸收峰面積，以標準品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標、相應(yīng)的紫外吸收峰面積為縱坐標，繪制β - 大馬酮標準曲線，并計算曲線方程。準確吸取供試樣品液10 mL，加入一定含量的β - 大馬酮標準品，制備成加標樣品液，分別取預(yù)先制備好的樣品液、加標樣品液上機分析，在規(guī)定的色譜條件下，定性考查樣品液中β - 大馬酮的特征吸收峰保留時間及分離效果。

表1 β - 大馬酮HPLC 梯度洗脫程序

β - 大馬酮HPLC 梯度洗脫程序見表1。

1.2.6 方法學(xué)驗證

①準確度，取已知含量的煙葉提取物樣本6 份，分別加入標準品溶液，進行HPLC 分析，計算加標回收率。②精密度，取標準品溶液6 份，分6 次進行HPLC 分析，計算6 次結(jié)果的RSD 值。③穩(wěn)定性，煙葉提取物樣本分別于0，1，4，9，16，24 h 取樣進行HPLC 分析，通過峰面積觀察目標檢測物的穩(wěn)定性。④重現(xiàn)性，取已知含量的煙葉提取物樣本6 份，進行HPLC 分析，通過峰面積驗證目標檢測物的重現(xiàn)性。⑤定量限及檢出限，取標準品溶液，稀釋1 000 倍，進行HPLC 分析，以儀器噪音的3 倍值作為儀器檢出限，儀器噪音的10 倍值作為定量限。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素含量測定

2.1.1 標準曲線的建立

分別以麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素標準樣品質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標（X），相應(yīng)樣品峰面積分值為縱坐標（Y） 進行回歸分析，繪制標準曲線。

麥芽酚標準品曲線見圖1，乙基麥芽酚標準曲線見圖2，香蘭素標準曲線見圖3，線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2，混合標樣HPLC 圖譜見圖4。

圖1 麥芽酚標準品曲線

圖2 乙基麥芽酚標準曲線

圖3 香蘭素標準曲線

圖4 混合標樣HPLC 圖譜

表2 線性方程及相關(guān)系數(shù)

結(jié)果表明在規(guī)定的色譜條件下，標準煙片質(zhì)量濃度為0～32 μg/mL 時，麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素濃度與紫外吸收峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為R2=0.999 9，R2=0.997 7，R2=1。由圖4可知，麥芽酚出峰時間為8～9 min，乙基麥芽粉出峰時間為25～26 min，香蘭素出峰時間為30～31 min，且能達到基線分離。

2.1.2 方法學(xué)考查

①準確度分析，檢測結(jié)果顯示，同一煙葉樣品6 次檢測的RSD 分別為0.38%，0. 34%，0.35%，表明該方法回收率較好、準確度較高。②精密度分析，濃度為2 μg/mL 的標準品重復(fù)進樣6 次，麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素的測定平均值分別為2.003，2.004，2.001 μg/mL，相對標準 偏 差RSD 分別 為0.26%，0.18%，0.29%（n=6），表明該方法精密度良好。③穩(wěn)定性分析，在規(guī)定色譜條件下，分別在0，1，4，9，16，24 h 對樣品溶液中麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素紫外吸收峰面積進行測定，其不同時間段的平均值分別為0.857 9，1.632，1.435 μg/g，相對標準偏差RSD 分別為1.11%，1.08%，1.91%（n=6），表明24 h 內(nèi)試驗穩(wěn)定性良好。④重現(xiàn)性，檢測結(jié)果顯示，在規(guī)定的HPLC 色譜條件下，同批次煙葉樣品重復(fù)進樣6 次，供試樣品液中麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素紫外吸收峰面積均值分別為108 053，259 338，252 608，相對標準偏差（RSD） 分別為0.35%，0.61%，0.80%（n=6），表明該方法有良好的重現(xiàn)性。⑤定量限及檢出限，檢測結(jié)果顯示麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素的最低檢出限分別為0.02，0.01，0.02 μg/mL；定量限為0.03，0.04，0.04 μg/mL，符合定量分析的要求。

準確度驗證結(jié)果見表3，樣品液HPLC圖譜見圖5。

圖5 樣品液HPLC 圖譜

表3 準確度驗證結(jié)果

2.2 芳樟醇與大馬酮HPLC 含量測定

2.2.1 檢測方法標準曲線建立

以標準溶液芳樟醇質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標（X），HPLC 紫外吸收峰的峰面積為縱坐標（Y） 進行回歸分析，繪制標準曲線。結(jié)果表明，在規(guī)定的色譜條件下，芳樟醇吸收峰的保留時間為9.7 min，下，樣品溶液在9.7～9.9 min 內(nèi)出現(xiàn)了芳樟醇特征吸收峰，且與樣品中的其他組分均能達到良好的基線分離。

以β - 大馬酮標準溶液質(zhì)量濃度（μg/mL） 為橫坐標（X），HPLC 紫外吸收峰峰面積為縱坐標（Y），進行回歸分析，繪制標準曲線。結(jié)果表明，在規(guī)定的且質(zhì)量濃度范圍為160～1 760 μg/mL 時，芳樟醇質(zhì)量濃度與紫外吸收峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=13 480X+30 709，相關(guān)系數(shù)R2=0.996。

芳樟醇標準曲線見圖6，芳樟醇HPLC圖譜見圖7。

圖6 芳樟醇標準曲線

圖7 芳樟醇HPLC 圖譜

由圖6、圖7 可知，在相同的HPLC 色譜條件色譜條件下，β- 大馬酮吸收峰的保留時間為11.8 min，在0.1～1.6 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大馬酮濃度與紫外吸收峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=29 865X+3×106，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 5。

β - 大馬酮標準曲線見圖8，β - 大馬酮HPLC圖譜見圖9。

圖8 β - 大馬酮標準曲線

圖9 β - 大馬酮HPLC 圖譜

由圖8、圖9 可知，在相同的HPLC 色譜條件下，雖然樣品液中成分復(fù)雜，但標準品及樣品溶液在11.6 min 均出現(xiàn)了β - 大馬酮特征吸收峰，且β -大馬酮與樣品中的其他組分的基線分離效果較好。

2.2.2 方法學(xué)考查

①準確度分析，檢測結(jié)果顯示，同一煙葉樣品6 次檢測的RSD 分別為1.19%，1.17%，表明方法回收率較好、準確度較高。②精密度分析，質(zhì)量濃度為0.800 mg/mL 的標準品重復(fù)進樣6 次，芳樟醇與大馬酮的測定平均值分別為0.802，0.805 mg/mL，相對標準偏差RSD 分別為0.15%，0.65%（n=6），表明芳樟醇與大馬酮測定方法精密度良好。③穩(wěn)定性分析，在規(guī)定色譜條件下，分別在0，1，4，9，16，24 h 對樣品溶液中芳樟醇、大馬酮紫外吸收峰面積進行測定，其不同時間段的平均值分別為102.36，78.27 μg/g，相對標準偏差RSD 分別為0.24%，0.58%（n=6），表明24 h 內(nèi)試驗穩(wěn)定性良好。④重現(xiàn)性，檢測結(jié)果顯示，在規(guī)定的HPLC 色譜條件下，同批次煙葉樣品重復(fù)進樣6 次，供試樣品液中芳樟醇、大馬酮紫外吸收峰面積均值分別為2 743 948，1 632 537，相對標準偏差（RSD） 分別為1.24%，1.66%（n=6），表明該方法有良好的重現(xiàn)性。⑤定量限及檢出限，檢測結(jié)果顯示芳樟醇、大馬酮的最低檢出限分別為0.03，0.02 μg/mL，定量限為0.04，0.05 μg/mL，符合定量分析的要求。

準確度驗證結(jié)果見表4。

表4 準確度驗證結(jié)果

2.2.3 煙葉樣品中芳樟醇及大馬酮含量測定

按照試驗建立的芳樟醇、β - 大馬酮含量HPLC含量分析方法，對湖南永州的2019 年陳化煙葉中芳樟醇、β - 大馬酮含量進行了測定分析。結(jié)果表明，在相同的色譜條件下，煙葉供試樣品液分別在芳樟醇、β - 大馬酮特征吸收峰保留時間形成了相同的特征吸收峰，所建立的HPLC 方法對樣品中芳樟醇、β - 大馬酮分離圖譜穩(wěn)定，方法可靠性高。

湖南永州（2019） 樣品液β - 大馬酮HPLC 圖譜見圖10，湖南永州（2019） 品液芳樟醇HPLC 圖譜見圖11。

圖10 湖南永州（2019） 樣品液β - 大馬酮HPLC 圖譜

圖11 湖南永州（2019） 品液芳樟醇HPLC 圖譜

3 結(jié)論

（1） 煙草所表現(xiàn)出的香氣類型與煙草中含有的化學(xué)物質(zhì)尤其是與煙葉香氣相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)的種類和含量息息相關(guān)[3]，與煙葉香氣有關(guān)的化學(xué)物質(zhì)主要包括有機酸類、醇類、羧基類、酯類和內(nèi)酯及雜環(huán)類化合物[4]。這些煙葉致香物質(zhì)的產(chǎn)生一般不是煙草碳、氮等基本代謝過程的直接產(chǎn)物，而是先合成脂類、萜類等不具揮發(fā)性的大分子化合物，然后進一步在酶或非酶的作用下，分解轉(zhuǎn)化形成[5]。這種不具揮發(fā)性的大分子化合物構(gòu)成了致香物質(zhì)成分的前體物質(zhì)[6]，主要包括類胡蘿卜素類、類西柏烷類、賴百當(dāng)類、糖酯類、棕色反應(yīng)類化合物等，一種香氣的前體物質(zhì)經(jīng)特定的降解途徑可形成特定的致香物質(zhì)[7]。杜詠梅等人[8]從170 個煙樣中分離測定出73 種致香成分，主要來源于六大類化合物，其中醛、酮類34 種，醇類8 種，內(nèi)酯及酯類7 種，酚類6 種，呋喃類8 種，氮雜環(huán)類10 種。按照至香物質(zhì)和前體物質(zhì)之間的關(guān)系可將致香物質(zhì)分為5 類：①異戊二間烯和降- 異戊二烯類，包括類胡蘿卜素、無環(huán)類異戊間二烯、帶環(huán)的類胡蘿卜素降解化合物、雙萜類、賴百當(dāng)類、碳環(huán)的半倍萜烯和單萜烯；②脂類代謝產(chǎn)物，包括甘油酯類、糖酯類、磷脂類、神經(jīng)鞘脂類等降解產(chǎn)物；③糖和氨基酸非酶棕化反應(yīng)產(chǎn)物，包括氮雜環(huán)類的吡啶、吡咯、吡嗪類衍生物及呋喃、酸類和羧基化合物等；④生物堿及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，主要是氮雜環(huán)類的香氣成分，如煙堿、假木賊堿等；⑤苯丙氨酸和木質(zhì)素類代謝產(chǎn)物，主要有苯甲醇、苯甲醛、苯乙醛、苯乙醇、2 - 呋喃甲醛等[9]。

在我國的煙葉香型分類中，煙葉香型大致分為焦甜香和清甜香，焦甜香是濃香型香煙制品主要香韻特征，焦甜香型煙葉香氣濃郁厚實，亦焦亦甜，濃焦厚甜是其主要特色，其成熟煙草的本質(zhì)香氣是烘烤香、甜香、清香、辛香、花香等多種香氣混合的生成產(chǎn)物，是增強卷煙香味和擴展風(fēng)格特色的重要組分，其主體貢獻香韻多為有木香、焦香、焦甜香、辛香等。胡安福等人[10]對主流煙氣焦甜、奶甜和豆香特征成分組群的分布特征和感官貢獻分析，表明甲基環(huán)戊烯醇酮、麥芽酚、4 - 羥基- 2,5 -二甲基- 3（2H） - 呋喃酮等是構(gòu)成焦香特征的主要致香物質(zhì)，根據(jù)其化合物結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生途徑分析，通常來至美拉德反應(yīng)中經(jīng)Amadori 產(chǎn)物降解生產(chǎn)的α - 二酮中間體；盧夢夢7]通過GC-MS 定性定量對宜賓市烤煙焦甜香香韻特征物質(zhì)進行分析，其中主流煙氣中與焦甜香香韻特色密切相關(guān)的致香物質(zhì)有糠醇、苯酚、2 - 甲基苯酚、2 - 呋喃甲酸- 4 - 十五烷基酯、2 - 甲氧基苯酚、3 - 乙基苯酚、2,3 - 二氫苯并呋喃、5 - 羥甲基糠醛、煙堿、茄酮、金合歡醇、棕櫚酸甲酯等；王鵬澤等人[11]以3 個香型的269 份煙葉樣品為材料，采用偏相關(guān)分析、通徑分析和逐步回歸分析對烤煙香味成分（多酚、有機酸和中性致香成分） 與香韻（干草香、焦甜香、焦香、正甜香、清甜香和青香） 的關(guān)系進行研究，不同香型烤煙主要香味物質(zhì)成分與香韻指標的關(guān)系的結(jié)果表明，氧化異佛爾酮、6 - 甲基- 5 - 庚烯- 2 - 醇、香葉基丙酮、苯甲醇、法尼基丙酮、β - 二氫大馬酮、茄酮與焦甜香韻和焦香香韻呈極顯著正相關(guān)且正面影響較大。周志磊[12]通過研究煙氣甜味和苦味與主流煙氣成分之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，雜環(huán)化合物和萜類化合物降解產(chǎn)物與煙氣甜味有顯著正相關(guān)，其中2 - 糠醛、甲基環(huán)戊烯醇酮、5 - 甲基- 2 - 糠醛、苯酚、3 -甲基- 2 - 環(huán)戊烯- 1 - 酮和麥芽酚等物質(zhì)在影響煙氣呈甜味方面貢獻最大。朱遠洋等人[13]研究焦糖化香料制備及在卷煙中應(yīng)用，指出煙葉焦糖化反應(yīng)產(chǎn)生甲基環(huán)戊烯醇酮、乙基環(huán)戊烯醇酮、糠醛、糠醇、呋喃酮、5 - 甲基糠醛、丁二酮等。李壽波等 人[14]基于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的揮發(fā)性成分分析，顯示揮發(fā)組分主要是酮類、醛類、醇類、酯類、吡啶、吡嗪、吡咯等，其中吡嗪和吡啶類物質(zhì)是具有強烈焦糖香、烘烤香物質(zhì)，與煙草協(xié)調(diào)性很好，能夠修飾和掩蓋部分雜氣，改善余味，提升煙草香氣。司曉喜等人[15]通過加熱卷煙氣溶膠中香氣成分的分析，顯示28 種卷煙氣溶膠中比較，焦甜香突出的卷煙中乙基麥芽酚、香蘭素、甲基環(huán)戊烯醇酮、3 - 羥基- 2 - 丁酮含量較高。馮云龍等人[16]利用水解多肽與葡萄糖在110 ℃下經(jīng)美拉德反應(yīng)形成香味物質(zhì)，經(jīng)檢測主要致香物質(zhì)為麥芽酚?？梢?，焦甜香香氣風(fēng)格的是多種致香物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，其對焦甜香香韻均有貢獻，其前體物質(zhì)多為萜烯類、糖苷類、糖酯類及棕色反應(yīng)類化合物降解產(chǎn)物，其中主要以棕色反應(yīng)化合物形成焦甜香致香物質(zhì)貢獻最顯著。綜合文獻報道，典型焦甜香的致香物質(zhì)種類主要包括甲基環(huán)戊烯醇酮、乙基環(huán)戊烯酮醇、麥芽酚、乙基麥芽酚、4-羥基- 2,5 - 二甲基- 3（2H） - 呋喃酮、2,5 - 二甲基- 3（H） 呋喃酮、糠醛、糠醇、香蘭素等。這些典型的焦甜香致香物質(zhì)作為單體香料廣泛應(yīng)用于卷煙生產(chǎn)中的風(fēng)味調(diào)制過程中。以麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素為指標開展相關(guān)檢測，建立高效液相同步檢測3 種物質(zhì)的檢測方法。

清香煙葉還有一種特征香型為清甜香，在煙葉復(fù)雜的化學(xué)成分中，具有清香特征的物質(zhì)主要是中性香氣成分，其與質(zhì)體色素、西柏三烯類等降解物有關(guān)，其中類胡蘿卜素和非環(huán)萜烯及其降解產(chǎn)物的種類接近100 種，有70%是類胡蘿卜降解產(chǎn)物；李超等人[17]對全國主產(chǎn)區(qū)煙葉香型特質(zhì)進行了排序：清香表現(xiàn)為云＞閩＞蜀，在對香型與香氣的理化指標相關(guān)分析結(jié)果表明，與清香香型呈顯著或極顯著正相關(guān)的指標有苯乙醇、10 - 十一烯醛、兔耳草醛、異佛爾酮、巨豆三烯酮、β - 大馬酮和異丁酸香葉酯；茅中一等人[18]采用全二維氣相色譜- 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀對煙葉提取物致香成分進行了定性分析，明確了彰顯清香特征的致香成分有11 種（見表5），其中7 - 甲基- 3,5 - 庚二烯- 2 - 酮、β - 大馬酮和β - 二氫大馬酮起重要作用；凌軍等人[19]在設(shè)定的14 種重要致香成分中，云南清甜香典型片煙中有8 種揮發(fā)性致香成分含量顯著高于3 組非典型碎煙，包括β - 大馬酮、巨豆三烯酮的4 個同分異構(gòu)體、二氫獼猴桃內(nèi)酯、3 - 羥基- β - 二氫大馬酮和3 - 氧代- α - 紫羅蘭醇；其中，β - 二氫大馬酮、β - 大馬酮、巨豆三烯酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、3 - 羥基-β - 二氫大馬酮和3- 氧代- α - 紫羅蘭醇屬于具有代表性的類胡蘿卜素類降解香氣產(chǎn)物[20-21]；可見，在文獻報道中，均體現(xiàn)了類胡蘿卜素降解產(chǎn)物β - 二氫大馬酮、β - 大馬酮等成分在清甜香煙葉香韻增香方面有較為突出的貢獻。芳樟醇是萜類化合物的重要組分之一，也是煙葉中主要的致香物質(zhì)，劉巍等人[22]采用氣相色譜- 質(zhì)譜法在煙葉中檢測到芳樟醇；另外，煙草品質(zhì)的優(yōu)劣很大程度上取決于煙葉中的致香物質(zhì)，王玉華等人[23]發(fā)現(xiàn)中部煙葉中芳樟醇、α -松油醇、香葉醇、吡咯和喹啉等含量明顯優(yōu)于其他部位的煙葉，說明該類物質(zhì)對卷煙制品中的風(fēng)味形成產(chǎn)生一定的積極影響，這在一定程度上促進了中部煙葉感官品質(zhì)的提升。研究表明，芳樟醇氧化物糖苷類屬于煙葉潛香化合物，煙葉在微生物作用下，微生物代謝產(chǎn)生的胞外酶可有利于該類潛香物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乙基香蘭素等致香成分，使卷煙香氣風(fēng)格更加突出。另外在煙葉制品的加工生產(chǎn)中，β - 二氫大馬酮、β - 大馬酮、芳樟醇、7 - 甲基- 3,5 - 庚二烯-2 - 酮也是煙葉制品主要的單品香料，可提高清甜香煙葉制品煙氣的圓潤性和滿足感，增加煙葉制品香氣的豐富性[24]。綜合多方面的研究結(jié)論，確定以β -大馬酮、芳樟醇為主要的考查對象，并對其煙葉樣品中的含量進行檢測。

表5 清香特征的致香成分

清香特征的致香成分見表5。

（2） 建立麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素HPLC同步測定方法。在規(guī)定色譜條件下，麥芽酚吸收峰的保留時間為8～9 min；乙基麥芽酚吸收峰的保留時間為25～26 min；香蘭素吸收峰的保留時間為30～31 min；3 種物質(zhì)質(zhì)量濃度為0～32 μg/mL 時，標準樣品質(zhì)量濃度與紫外吸收峰面積呈良好線性關(guān)系，其回歸方程分別為麥芽酚Y=35 094X-16 954，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4；乙基麥芽酚Y=36 897X-33 531，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3；香蘭素Y=33 786X-8 222.8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。樣品液在20，26，30 min 左右出現(xiàn)特征吸收峰，通過加標試驗驗證相應(yīng)麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素特征吸收峰，樣品液及標準液均與其他各組分均達到良好的基線分離。建立的3 種物質(zhì)同步檢測色譜條件如下：色譜柱SymmetryR C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1%甲酸溶液∶甲醇=85∶15（體積比）；流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為273 nm，柱溫為30℃，進樣量10 μL。

（3） 建立芳樟醇HPLC 含量測定方法。在規(guī)定的色譜條件下，芳樟醇吸收峰的保留時間為9.7 min，在160～1 760 μg/mL 范圍內(nèi)，芳樟醇質(zhì)量濃度與紫外吸收峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=13 490Y+18 143，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 1；樣品溶液在9.7～9.9 min 內(nèi)出現(xiàn)了芳樟醇特征吸收峰，且芳樟醇峰與樣品中的其他組分均能達到良好的基線分離。芳樟醇色譜條件：色譜柱：SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流動相為以乙腈∶水= 1∶1（體積比）；流速1.0 mL/min，紫外檢測波長為205 nm，柱溫為30℃，進樣量10 μL。

（4） 建立β - 大馬酮含量測定方法，吸收峰的保留時間為11.8 min，且在100～1 600 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，大馬酮質(zhì)量濃度與紫外吸收峰峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=29 977X+140 680，相關(guān)系數(shù)R2=0.990 3，樣品液在標準品及樣品溶液在11.6 min 出現(xiàn)了β - 大馬酮特征吸收峰，且基線分離效果較好。β - 大馬酮的色譜條件：色譜柱為色譜柱SymmetryR C18（3.9 mm×150 mm，5 μm），流動相：甲醇（A） -30 mmol/L 乙酸銨水溶液（B） 梯度洗脫程；流速0.9 mL/min，紫外檢測波長227 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。梯度洗脫程序：0～3 min 甲醇(A)-30 mmol/L 乙酸銨水溶液（B） 50∶50（V/V）；3～6 min，80∶20（V/V）；6～10 mim 80∶20（V/V）；10～13 min，50∶50（V/V）。

（5） 按照試驗建立HPLC 分析方法，進行了煙葉樣品中麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素、β - 大馬酮、芳樟醇含量比對分析。試驗對湖南永州2019 年陳化煙葉中5 種致香物質(zhì)含量測定結(jié)果表明，所建立的HPLC 方法對樣品中麥芽酚、乙基麥芽酚、香蘭素、芳樟醇、β - 大馬酮分離圖譜穩(wěn)定，但各組分檢測結(jié)果顯示5 種物質(zhì)通過二氯甲烷萃取測得的含量均較低，因此在樣品測定時可作為定性或半定量分析方法，在試驗檢測過程中可結(jié)合LC-MS 氣質(zhì)聯(lián)用方法予以精確定量分析。