ω-3多不飽和脂肪酸對(duì)急性肝功能衰竭小鼠肝細(xì)胞保護(hù)機(jī)制研究

張玉榮，李高峰，湯 彥，章美元

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院急診科，上海 201700）

目前，膿毒癥是一種致命性器官功能障礙綜合征，感染是引發(fā)膿毒癥的源頭，是臨床急危重患者常見(jiàn)病死原因之一。臨床膿毒癥患者往往存在高分解代謝和免疫紊亂，而機(jī)體免疫功能紊亂參與了膿毒癥相關(guān)性肝損傷甚至急性肝衰竭的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程，即使有效抗生素能夠及時(shí)清除病原體，也需要免疫調(diào)節(jié)使促炎和抗炎恢復(fù)平衡，減少細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征（MODS）發(fā)生，故免疫調(diào)節(jié)治療成為研究熱點(diǎn)[1]。目前，ω-3 多不飽和脂肪酸在膿毒癥中治療效應(yīng)已得到越來(lái)越多的關(guān)注，但治療效果不一致，還存在許多不確定問(wèn)題[2-3]。因此，有必要進(jìn)一步研究ω-3 多不飽和脂肪酸對(duì)膿毒癥相關(guān)性的急性肝衰竭是否存在抗炎、修復(fù)等保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取BLAB/C 小鼠100 只，雌雄各半，均6～8周齡，體質(zhì)量（21±2.6）g，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供[許可證號(hào)：SCXK（蘇）2021-0009]。遵循有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院批準(zhǔn)（EC-C-015-A01-V03）?？瞻捉M8 只，造模后隨機(jī)分成4 組：模型組 20 只，烏司他丁組 24 只，3-PUFA 組24 只，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組24 只。各組在造模和干預(yù)治療后6、12、24 h 時(shí)間點(diǎn)留取標(biāo)本。動(dòng)物6 只，籠飼養(yǎng)，自由飲水和飲食。

1.2 動(dòng)物模型制備和干預(yù)治療措施

小鼠自由飼養(yǎng)1 周，禁食1 天，自由飲水，先予以D-氨基半乳糖800 mg·kg-1（南京市生物有限公司）加脂多糖（8 mg·kg-1，批號(hào)：I4319，sigma）腹腔注射造模，隨后2 h 予以烏司他?。?.5萬(wàn)·kg-1，國(guó)藥準(zhǔn)字：H19990134）腹腔注射，3-PUFA（0.2 g·kg-1，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20100092）加無(wú)菌注射10% 糖水稀釋后尾部靜脈注射，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（20 mg·kg-1，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20046249）腹腔注射。

1.3 血清標(biāo)本采集和相關(guān)檢測(cè)

按照干預(yù)后時(shí)間點(diǎn)6、12、24 h 采集標(biāo)本，留取靜脈血，3 000 r·min-1，離心10 min 后，分離出血清放置-70℃冰箱存放，統(tǒng)一檢測(cè)。采取ELISA檢測(cè)血清降鈣素原（PCT）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和膽堿酯酶（CHE），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 肝組織標(biāo)本采集

采集血清標(biāo)本后，留取肝組織（生理鹽水沖洗后），肝組織放置預(yù)先留有2%甲醛溶液的標(biāo)本瓶，用于做病理HE 染色觀察，另為無(wú)菌干燥瓶，分別放入組織標(biāo)本，統(tǒng)一稱質(zhì)量1 g，然后加入0.9%生理鹽水2 mL，制作組織均漿，4 000 r·min-1離心10 min 后，留取上清液1 mL，在 miRBase 上查尋目的基因序列，由美國(guó)Invitrogen 公司設(shè)計(jì)合成引物，提取上清液中miRNAs，合成cDNA。以U6 作為內(nèi)參，在9700 型基因擴(kuò)增儀中擴(kuò)增 miRNAs。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10s，60℃退火60 s，共37 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT（Livak）法計(jì)算肝組織microRNA-122a 的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，TN F-α、IL-6 、PCT、ALT、AST、CHE、microRNA-122a 水平等計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間、組內(nèi)結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠變化比較

空白組小鼠表現(xiàn)正常飲食活躍，造模后2 h 內(nèi)各組累計(jì)死亡18 只：模型組6 只，烏司他丁組4 只，3-PUFA 組5 只，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組3 只。造模后各組存活小鼠表現(xiàn)為體毛松散，活動(dòng)明顯減少，進(jìn)食量少；烏司他丁組、3-PUFA 組和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組均表現(xiàn)為卷曲明顯，活動(dòng)減少，能夠勉強(qiáng)自由采食和飲水。

2.2 各組小鼠血清ALT、AST 與CHE 比較

造模后6 h 后小鼠血清ALT 與AST 水平升高，CHE 水平明顯下降，且模型組與空白組的ALT、AST和CHE 水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組、烏司他丁組、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組的ALT、AST 和CHE水平比模型組明顯下降，且2 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組與烏司他丁組的ALT、AST 和CHE水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組與促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組的ALT、AST 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CHE 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠治療后的血清ALT、AST 與CHE 比較（± s ） U·L-1

表1 各組小鼠治療后的血清ALT、AST 與CHE 比較（± s ） U·L-1

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組比較，△P ＜0.05

組別時(shí)間總數(shù)/死亡數(shù)ALT AST CHE空白組8 44.0±2.3# 26.1±2.4#1 121.4±124.0#模型組3-PUFA 組烏司他丁組6 h20/6344.1±78.4 774.8±156.3256.0±25.3 12 h765.3±103.31 023.0±234.2114.2±11.3 24 h889.2±174.1#1 200.2±314.7# 75.1±3.5#6 h24/5320.4±67.2 722.1±112.5324.3±31.2 12 h314.1±63.2 564.0±113.2444.2±72.3 24 h189.4±24.6#△ 444.1±78.6#△752.1±103.2#△6 h24/4365.2±45.1 661.0±102.2345.4±19.8 12 h361.7±24.6 560.1±78.6489.2±26.7 24 h331.1±45.8# 554.2±102.3#499.4±48.3#促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組6 h24/3321.3±15.4 561.1±142.3448.2±24.6 12 h156.0±21.3 479.3±75.2613.1±44.6 24 h151.3±9.2# 145.4±17.3#758.1±31.5#

2.3 各組小鼠的血清TNF-α、IL-6 與PCT 水平比較

造模后小鼠血清TNF-α、IL-6 和PCT 水平明顯升高，且模型組與空白組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組、烏司他丁組、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平比模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA組比烏司他丁組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組與促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組的TNF-α、IL-6 和PCT 水平比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠治療后血清TNF-α、IL-6 與PCT 水平比較（± s ） pg·mL-1

表2 各組小鼠治療后血清TNF-α、IL-6 與PCT 水平比較（± s ） pg·mL-1

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與烏司他丁組比較，△P ＜0.05

組別時(shí)間 總數(shù)/死亡數(shù)TNF-α IL-6 PCT空白組8 14.1±1.2 24.2±1.5 0.1±0.0模型組3-PUFA 組6 h20/61 556.0±191.2 663.3±86.010.2±1.5 12 h2 006.4±203.9 953.0±121.124.2±4.2 24 h3 156.3±421.0#1 022.1±115.3#57.2±9.4#6 h24/51 224.3±155.4 660.5±71.1 10.0±2.1 12 h 986.4±112.3 512.2±86.2 11.1±2.5 24 h 453.2±75.3#△ 324.1±54.6#△ 7.2±1.09#△6 h24/4 365.4±45.1 661.0±102.234.5±2.0 12 h 361.1±24.6 560.4±78.648.9±2.7 24 h 331.3±45.8# 554.2±102.3#△49.9±4.8#促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組 6 h24/3 678.2±141.3 401.3±79.3 9.1±2.0 12 h 622.4±101.4 332.2±14.3 6.1±1.2 24 h 426.1±97.9# 396.4±20.1# 6.0±0.9#烏司他丁組

2.4 各組小鼠肝組織的microRNA-122a 水平比較

造模后小鼠血清microRNA-122a 水平明顯升高，且模型組與空白組的microRNA-122a 水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組、烏司他丁組、促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組的microRNA-122a 水平比模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組比烏司他丁組的microRNA-122a 水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3-PUFA 組與促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組的microRNA-122a水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3和圖1。

圖1 各組的microRNA-122a 隨時(shí)間變化

表3 各組小鼠肝組織的microRNA-122 a 水平比較（± s ）

表3 各組小鼠肝組織的microRNA-122 a 水平比較（± s ）

注：與空白組比較，# P ＜0.05；與烏司他丁組比較，△P ＜0.05

組別時(shí)間 總數(shù)/死亡數(shù) microRNA-122a空白組80.112±0.002模型組6 h20/60.515±0.072 12 h0.667±0.044 24 h0.751±0.001#△3-PUFA 組6 h24/50.322±0.056 12 h0.288±0.026 24 h0.234±0.011#烏司他丁組6 h24/40.440±0.078 12 h0.367±0.018 24 h0.304±0.023#促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組6 h24/30.304±0.098 12 h0.279±0.011 24 h0.221±0.024#

2.5 各組小鼠肝組織的病理變化比較

光鏡下HE 染色觀察（40×10：放大400 倍），空白組肝組織中少量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯的細(xì)胞水腫；模型組表現(xiàn)為在肝組織的大量漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，彌漫性細(xì)胞水腫變性，肝組織切片中在匯管區(qū)尤其明顯淤血；與模型組比較，各治療組肝組織充血明顯和肝細(xì)胞水腫，漿細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，其中3-PUFA 組漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組次之，烏司他丁組居后，各組炎癥程度變化也隨著時(shí)間推移逐步減輕。見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肝組織的病理變化比較（HE 染色，×400）

3 討論

雖然臨床采用多種免疫調(diào)節(jié)治療措施，但是膿毒癥并發(fā)急性肝衰竭的免疫狀態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制網(wǎng)絡(luò)比較復(fù)雜，臨床病死率仍高達(dá)11.1%～40.7%[4]，其中炎癥介質(zhì)釋放及免疫功能紊亂是膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要因素，隨著產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），產(chǎn)生過(guò)量的自由基導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線粒體DNA 損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙的發(fā)生，故膿毒癥相關(guān)性肝損傷甚至肝衰竭可出現(xiàn)在膿毒癥的各個(gè)病程階段，是發(fā)生MODS 和死亡的獨(dú)立預(yù)警危險(xiǎn)因素[5]，膿毒癥患者早期肝功能障礙是預(yù)后不良的高危因素，盡早發(fā)現(xiàn)和干預(yù)膿毒癥相關(guān)性肝損傷可以改善患者預(yù)后，故如何免疫調(diào)節(jié)恢復(fù)免疫平衡是阻止膿毒癥相關(guān)肝損傷的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[6]。此外，在膿毒癥形成發(fā)展過(guò)程中由于應(yīng)激消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和炎癥介質(zhì)的形成，故除病因處理之外，在治療上既需要營(yíng)養(yǎng)支持又要免疫調(diào)節(jié)，既往研究提示及時(shí)予以如ω-3多不飽和脂肪酸，可以直接為機(jī)體提供能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)，還可以具有抗微血栓、調(diào)節(jié)微循環(huán)、調(diào)控基因表達(dá)等作用，可能起到減少炎癥反應(yīng)、恢復(fù)和調(diào)節(jié)免疫平衡等的治療作用，進(jìn)而有助于控制感染發(fā)展，改善預(yù)后[7]。

膿毒癥相關(guān)性肝損傷已經(jīng)在基因組學(xué)、表觀遺傳學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)取得很大進(jìn)展，但是具體病生理機(jī)制尚未完全揭示，免疫紊亂導(dǎo)致肝內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其主要內(nèi)容，級(jí)聯(lián)瀑布樣細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致多器官功能障礙發(fā)生。對(duì)于膿毒癥相關(guān)性肝損傷和急性肝功能衰竭，控制炎癥因子釋放，減少免疫介質(zhì)損傷成為關(guān)鍵手段之一，故免疫營(yíng)養(yǎng)治療成為必然需要且需把握給藥時(shí)機(jī)。

免疫損傷引起線粒體功能障礙常導(dǎo)致膿毒癥相關(guān)性肝損傷或者急性肝衰竭發(fā)生，臨床表現(xiàn)為肝臟是膿毒癥中能量代謝障礙發(fā)生最早、程度最嚴(yán)重的器官，在膿毒癥發(fā)生時(shí)出現(xiàn)微循環(huán)障礙、能量代謝障礙、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞凋亡或壞死等病理生理特點(diǎn)[8]。研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥相關(guān)性肝損傷甚至急性肝衰竭中，蛋白質(zhì)合成功能受到影響均表現(xiàn)為凝血功能障礙和代謝紊亂以及膽紅素代謝受損等[9]，而且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，膿毒癥相關(guān)性急性肝衰竭可通過(guò)AMPK 通路影響線粒體生物合成和激活線粒體自噬反應(yīng)，其中肝細(xì)胞線粒體作為機(jī)體重要的能量代謝中心，在膿毒癥應(yīng)激病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞線粒體損傷可引起肝臟能量代謝和解毒功能障礙，導(dǎo)致急性肝功能不全，甚至發(fā)生急性肝衰竭[10-11]。因此膿毒癥相關(guān)性肝病發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，各因素之間相互影響，目前尚無(wú)特效的治療手段[12]，加上膿毒血癥高消耗特點(diǎn)和免疫異常反應(yīng)的特點(diǎn)，故目前營(yíng)養(yǎng)免疫成為治療膿毒癥相關(guān)性肝病的重要輔助方法之一[13-14]。

既往研究表明，ω-3PUFA 不僅能滿足機(jī)體代謝所需的能量需求，在膿毒癥以分解代謝為主時(shí)減少白蛋白的消耗，還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞膜損傷的修復(fù)，進(jìn)一步影響中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，激活其細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)，從而影響細(xì)胞表面受體活性變化、激素的釋放和調(diào)節(jié)基因表達(dá)，最終激活中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等免疫活性細(xì)胞，減少炎癥因子釋放，減少ROS 產(chǎn)生，改善組織微循環(huán)，起到抗微循環(huán)血栓形成等，減少花生四烯酸產(chǎn)生類花生酸，并減少組織炎癥，對(duì)抗白三烯來(lái)抗血小板聚集，降低細(xì)胞表面黏附因子水平等作用[15-16]，然而膿毒血癥患者補(bǔ)充ω-3PUFA 的獲益療效缺乏足夠證據(jù)[17]。

血清ALT、AST 是肝功能損傷早期臨床表現(xiàn)的指標(biāo)，在反映急性肝損傷時(shí)具有很高的靈敏度及特異性，其含量常與肝細(xì)胞損傷程度成正比[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠血清中ALT 和AST 含量與空白組比較顯著升高，HE 染色提示肝細(xì)胞水腫、壞死和漿細(xì)胞浸潤(rùn)等，而ω-3PUFA 干預(yù)組可明顯降低膿毒癥小鼠血清中ALT 和AST 含量，并改善肝臟病理變化，初步說(shuō)明ω-3PUFA 對(duì)膿毒癥引發(fā)的肝損傷具有保護(hù)作用。MicroRNA-122a 是一種肝臟特異性miRNAs，在肝臟中高度表達(dá)，在維持肝細(xì)胞正常功能和緊急啟動(dòng)肝細(xì)胞修復(fù)中起著十分重要的作用[19]。研究[20]表明，在腸道細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，LPS 可刺激MicroRNA-122a 表達(dá)，促進(jìn)TNF-a、IL-6 釋放，從而促進(jìn)炎癥過(guò)度反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組MicroRNA-122a 表達(dá)明顯升高，而3-PUFA、烏司他丁和促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素干預(yù)后，其表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此表明，ω3-PUFA 可能存在通過(guò)下調(diào)MicroRNA-122a 表達(dá)起到抗炎和肝細(xì)胞保護(hù)作用，具體的作用通路及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，營(yíng)養(yǎng)與免疫的關(guān)系已經(jīng)突破了營(yíng)養(yǎng)缺乏、營(yíng)養(yǎng)過(guò)度和營(yíng)養(yǎng)失衡的范疇，從宏觀上講，營(yíng)養(yǎng)與免疫的關(guān)系是相互的，營(yíng)養(yǎng)是免疫的基礎(chǔ)。ω-3PUFA 不但提供了能量支持，減少血清白蛋白消耗，而且在減輕膿毒癥相關(guān)性肝病的全身炎癥、內(nèi)毒素血癥和膿毒癥的肝外其他器官保護(hù)方面安全有效。本研究證實(shí)，ω-3PUFA 可能通過(guò)下調(diào)MicroRNA-122a 的表達(dá)，起到對(duì)急性肝衰竭起到抗炎和保護(hù)作用，而且為在膿毒癥早期就可以啟動(dòng)給藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。