基于相似度評(píng)價(jià)大青龍湯遵古煎煮工藝研究

馬啟風(fēng)，高紅梅，王炳然，張 淼，陳 晶，唐秋竹，邱智東

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117）

大青龍湯出自張仲景著《傷寒論》[1]，書(shū)中記載：“麻黃六兩（去節(jié)），桂枝二兩（去皮），甘草二兩（炙），杏仁四十枚（去皮尖），生姜三兩（切），大棗十二枚（擘），石膏如雞子大（碎），上七味，以水九升，先煮麻黃，減二升，去上沫，內(nèi)諸藥，煮取三升，去滓。”是治療太陽(yáng)病兼有里證的古方，具有發(fā)汗解表、清郁熱、消腫鎮(zhèn)痛、抗病毒的功效，主治外感風(fēng)寒、兼有里熱。臨床常用于治療哮喘，尤其善于治療小兒哮喘[2-3]、小兒急性支氣管炎、流感、暑熱、急性腎炎、原發(fā)性皮膚樣變、嗜睡等病癥[4-6]?！吨兴帍?fù)方制劑生產(chǎn)工藝研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[7]明確中藥復(fù)方制劑生產(chǎn)工藝研究應(yīng)遵循“尊重傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)”等基本原則和要求，應(yīng)最大限度發(fā)揮或優(yōu)于原有方劑的療效。文獻(xiàn)記載大青龍湯的使用方法為水煎服，但煎煮時(shí)間尚不明確，無(wú)法保證與傳統(tǒng)用藥的一致性。為同時(shí)確保大青龍湯煎煮的遵古特性及中藥資源的充分利用，本實(shí)驗(yàn)以古籍記載制備方法建立標(biāo)準(zhǔn)圖譜，對(duì)比分析指紋圖譜相似度，優(yōu)選出與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似度接近且提高飲片利用率的工藝參數(shù)。

中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，其藥理作用具有多靶點(diǎn)、多層次特點(diǎn)，用指標(biāo)成分含量評(píng)價(jià)提取工藝不具有整體性，而指紋圖譜技術(shù)能全面、定量地反映中藥所包含的已知成分和未知成分的種類和數(shù)量[8-10]，其圖譜相似度越接近，煎煮液與原有方劑的組成成分越相同，從而保證復(fù)方的有效性和遵古性。出膏率可以反映藥材成分的煎煮程度。熵權(quán)法[11-12]是一種根據(jù)各指標(biāo)的分散程度，利用信息熵計(jì)算各指標(biāo)權(quán)重的方法，避免人為因素帶來(lái)的偏差，評(píng)價(jià)結(jié)果客觀性更強(qiáng)，可以用于需要確定權(quán)重的過(guò)程?；诖耍狙芯繉?duì)比分析指紋圖譜相似度和出膏率，最終確定大青龍湯煎煮工藝參數(shù)，為其制劑生產(chǎn)工藝的研究及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供研究思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030 型高效液相色譜儀，日本Shimadzu 公司；AB135-S 型精密十萬(wàn)分之一分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FA1204B 萬(wàn)分之一分析天平，上海精密儀器科技有限公司；KQ-250B 型超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；電磁爐，長(zhǎng)春恒隆廚房設(shè)備有限公司；煎藥壺，潮州壺百飲電器實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 材料

麻黃（批號(hào)：20211217），炙甘草（批號(hào)：20211108），桂枝（批號(hào)：20211218-01），燀苦杏仁（批號(hào)：20210812），石膏（批號(hào)：20211123），大棗（批號(hào)：20211072）均購(gòu)自吉林省北藥中藥制藥集團(tuán)有限公司，生姜購(gòu)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)旁邊綜合市場(chǎng)，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)翁麗麗教授鑒定，飲片各項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)均符合《中國(guó)藥典》2020 版[13]相關(guān)規(guī)定，炙甘草由本實(shí)驗(yàn)組自行炒制，方法參照2015 版《浙江省中藥炮制規(guī)范》[14]：取甘草片，照清炒法炒至表面黃色，微具焦斑時(shí)，取出，攤涼。鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)：171241-201809）、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)：171237-201510）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所，甲醇，分析純，天津新通精細(xì)化工有限公司；乙腈，色譜純，北京化工廠；磷酸，色譜純，北京化工廠；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方分析

大青龍湯各飲片劑量為麻黃六兩、桂枝二兩、炙甘草二兩和燀苦杏仁四十枚，生姜三兩，大棗十二枚，石膏如雞子大，量器計(jì)量為“升”?！秱摗分械乃幬飫┝俊皟伞焙汀癵”的換算，參考《中國(guó)古代科技史·度量衡卷》[15]，得出東漢1 兩折合為 13.8 g，1 升約為現(xiàn)今200 mL，再結(jié)合非標(biāo)準(zhǔn)重量單位計(jì)量藥物實(shí)物考證，石膏雞子大折算劑量為60 g，杏仁一枚為0.3 g，大棗一枚為2.5 g，得處方一：麻黃82.8 g，桂枝27.6 g，甘草（炙）27.6 g，生姜（切）41.4 g，石膏（碎）60.0 g，杏仁（燀）12.00 g，大棗（擘）30.0 g。參考“十三五”規(guī)劃教材《方劑學(xué)》以及現(xiàn)今臨床常用劑量，一兩折合為3 g，得處方二：麻黃12.0 g，桂枝6.0 g，甘草（炙）6.0 g，生姜（切）9.0 g，石膏（碎）18.0 g，杏仁（燀）6.0 g，大棗（擘）3.0 g。

2.1.1 供試品溶液的制備 按處方一、處方二稱取各飲片，分別加水1 800 mL，先煮麻黃，減400 mL，去沫，入諸藥，煮取至600 mL，200 目紗布濾過(guò)，-18℃凍存12 h 后冷凍干燥72 h，得各處方凍干粉。

分別精密稱取各處方凍干粉0.1 g，置于100 mL具塞錐形瓶，精密加入80% 甲醇30 mL，超聲20 min，放冷后用80%甲醇補(bǔ)足減失重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品1.9 mg，置于2 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.95 mg·mL-1的混合對(duì)照品母液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為Platisil 5 μm ODS（4.6 mm× 250 mm），以0.15%磷酸（A）和乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫程序：0～10 min，4%～7% B；10～20 min，7%～9% B；20～22 min，9%～9% B；22～32 min，9%～12% B；32～40 min，12%～15% B；40～65 min，15%～35% B；65～80 min，35%～65% B，體積流量1 mL·min-1，柱溫25℃，波長(zhǎng)207 nm，進(jìn)樣體積5 μL。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5、10、20、40、80、120、160 μL 置入2 mL 量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度分別為2.375、4.75、9.5、19、38、57、76 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取系列對(duì)照品溶液5 μL 注入液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定。得回歸方程分別為Y= 11 572X+1 518.8，r= 0.999 6，線性范圍2.375～76 μg·mL-1，Y= 9 902.5X+232.9，r= 0.999 7，線性范圍2.375～76 μg·mL-1。結(jié)果表明，在相應(yīng)進(jìn)樣質(zhì)量濃度范圍內(nèi)各成分線性關(guān)系良好。

2.1.4.2 精密度考察 取“2.1.1”法制備的處方一供試品溶液，精密吸取5 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD 分別為0.22%和0.20%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性考察 取“2.1.1”法制備的處方一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的峰面積RSD 分別為1.09%和1.19%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.4 重現(xiàn)性考察 平行制備6 份處方一供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量均值分別為1.02%和0.70%，RSD 為1.12%和1.75%，表明重現(xiàn)性良好。

2.1.4.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的同一份大青龍湯樣品共6 份，每份約0.1 g，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的平均加樣回收率為98.88%和98.66%，RSD 為1.13%和1.10%（n= 6），表明該方法回收率良好。

2.1.5 劑量考察結(jié)果 結(jié)合表1，得出不同劑量處方麻黃飲片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿總含量相差不大，證明各處方對(duì)飲片利用率基本一樣。大青龍湯此次作為防疫方，在針對(duì)新型冠狀病毒疫情時(shí)，應(yīng)使用大劑量切中病機(jī)，迅速起效，基于此，本實(shí)驗(yàn)選用一兩折合13.8 g。

表1 不同處方劑量考察結(jié)果 %

2.2 標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立

供試品溶液的制備 按“2.1.1”項(xiàng)下處方一方法制備供試品。色譜條件，同“2.1.3”色譜條件。標(biāo)準(zhǔn)圖譜，見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)圖譜

2.3 麻黃先煎去沫考察

原文記載為“以水九升，先煮麻黃，減二升，去上沫，再內(nèi)諸藥”，課題組前期對(duì)文獻(xiàn)[16]的考證，發(fā)現(xiàn)麻黃是否去沫可能與生物堿類成分關(guān)系不大，但于本實(shí)驗(yàn)的成分煎煮是否有影響，是否也不需要?；诖?，本研究以麻黃“先煎去沫”理論為切入點(diǎn)，以麻黃先煎去沫圖譜為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，設(shè)置時(shí)間窗寬度為0.1，得到各圖譜相似度，評(píng)價(jià)分析麻黃是否需要先煎去沫。圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 麻黃去沫指紋圖譜

按處方一稱取飲片，加水1 800 mL，入諸藥，煮取至600 mL，200 目紗布濾過(guò)，-18℃凍存12 h后冷凍干燥72 h，即得麻黃未先煎去沫液凍干粉。按“2.1.1”法制備平行樣品。

由圖譜可得麻黃未先煎去沫圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似度分別達(dá)到0.947 和0.930，證明麻黃先煎去沫與否對(duì)大青龍湯的成分提取沒(méi)有太大影響，且麻黃先煎去沫不適用于實(shí)際生產(chǎn)，故本實(shí)驗(yàn)麻黃不用先煎去沫。

3 煎煮工藝研究

3.1 單因素考察

3.1.1 煎煮時(shí)間 稱取大青龍湯處方量飲片，在料液比1:6、煎煮1 次的條件下，分別對(duì)煎煮時(shí)間1 h、2 h、3 h 進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表2，圖譜見(jiàn)圖3。與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，出膏率逐漸增加，相似度逐漸降低，煎煮2 h 和3 h，出膏率和相似度變化不大，因此煎煮時(shí)間選擇1、1.5、2 h 進(jìn)行正交工藝優(yōu)化。

圖3 單因素試驗(yàn)指紋圖譜

表2 大青龍湯提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.2 料液比 稱取大青龍湯處方量飲片，在煎煮1 h、煎煮1次的條件下，分別對(duì)料液比1:6、1:12、1:18進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表2，圖譜見(jiàn)圖3。與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，出膏率逐漸增加，相似度逐漸降低，料液比為1:12與1:18 時(shí)，相似度變化不大，考慮節(jié)約溶劑用量，因此料液比選擇1:6，1:8，1:10 倍進(jìn)行正交工藝優(yōu)化。

3.1.3 煎煮次數(shù) 稱取大青龍湯處方量飲片，在煎煮1 h、料液比1:6 的條件下，分別對(duì)煎煮次數(shù)1 次、2 次、3 次進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表2，圖譜見(jiàn)圖3。與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比，發(fā)現(xiàn)隨煎煮次數(shù)增加，出膏率逐漸增加，相似度逐漸降低，煎煮3 次時(shí)，相似度的結(jié)果已不是很高，故將最高煎煮次數(shù)確定為3 次，進(jìn)行正交工藝優(yōu)化。

3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，優(yōu)化煎煮時(shí)間（A）、料液比（B）、煎煮次數(shù)（C）三個(gè)影響因素，以相似度及出膏率的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳煎煮工藝參數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析及結(jié)果見(jiàn)表4，圖譜見(jiàn)圖4。

圖4 正交試驗(yàn)指紋圖譜

表3 大青龍湯提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 大青龍湯提取工藝的正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

3.3 熵權(quán)計(jì)算權(quán)重

熵權(quán)法[17-18]是對(duì)指標(biāo)體系客觀賦權(quán)的方法，其指標(biāo)的變異程度越小，信息熵就越大，其對(duì)應(yīng)的權(quán)值也應(yīng)該越低，則該指標(biāo)對(duì)綜合評(píng)價(jià)的影響就越小，反之，該指標(biāo)影響就越大。經(jīng)計(jì)算得出相似度和出膏率的權(quán)重為0.492，0.508。

本研究對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行極差和方差分析，結(jié)果顯示各考察因素對(duì)考察指標(biāo)影響大小的次序?yàn)镃 ＞A ＞B，根據(jù)評(píng)分值確定A3B1C2為最佳煎煮工藝，即煎煮2 h、加6 倍量水、煎煮2 次。本研究進(jìn)一步對(duì)正交試驗(yàn)綜合評(píng)分結(jié)果進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)正交實(shí)驗(yàn)因素C（煎煮次數(shù)）有顯著性差異，因素B（料液比）和因素A（煎煮時(shí)間）沒(méi)有顯著性差異，即煎煮次數(shù)對(duì)結(jié)果影響最大，料液比和煎煮次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大，考慮實(shí)際生產(chǎn)所用時(shí)間和資源成本，故減少時(shí)間的消耗，確定最佳工藝為用A2B1C2即煎煮1.5 h、料液比1:6、煎煮2 次。

3.4 工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

稱取大青龍湯全方藥材共281.4 g 3 份，按照上述所得最優(yōu)大青龍湯煎煮工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5，可見(jiàn)3 批樣品綜合評(píng)分的RSD 值均在2%以內(nèi)，說(shuō)明此煎煮工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表5 大青龍湯的工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

4 討論

新冠疫情暴發(fā)以來(lái)，造成了極大的恐慌，也給人們生命安全造成了很大的威脅，而在這次疫情防控中，中醫(yī)藥廣泛參與新冠肺炎的治療，深入介入診療全過(guò)程，有效發(fā)揮了積極作用，助力中國(guó)疫情局勢(shì)實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)，作為防疫方的大青龍湯為漢代記載方劑，療效確切，應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)，但可能存在歷代方義衍變，古今提取容器、提取方式的變化等問(wèn)題，故為實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)制法與現(xiàn)代提取工藝的質(zhì)量一致性和有效性，應(yīng)參考古籍，與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合來(lái)對(duì)大青龍湯的提取工藝進(jìn)行研究。

指紋圖譜是一種綜合、可量化的鑒定手段，可以對(duì)中藥復(fù)方制劑中多組分、多靶點(diǎn)進(jìn)行整體評(píng)價(jià)[19-20]，指紋圖譜大多用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，近年來(lái)應(yīng)用于中藥復(fù)方的提取工藝。研究[21-23]在評(píng)價(jià)提取工藝時(shí)，不僅考察指標(biāo)成分含量和出膏率，還包括指紋圖譜相似度，故本研究在遵古的基礎(chǔ)上，與現(xiàn)代技術(shù)相結(jié)合，考察了處方飲片的現(xiàn)代臨床劑量以及麻黃飲片在煎煮過(guò)程中的加入方式，確定處方關(guān)鍵信息，得到標(biāo)準(zhǔn)圖譜，建立出膏率和圖譜相似度為主的工藝評(píng)價(jià)體系，與指標(biāo)成分含量最大的評(píng)價(jià)體系相比，本方法不僅兼顧了中藥復(fù)方多成分作用特點(diǎn)，還能有效克服在煎煮工藝考察中采用單一評(píng)價(jià)指標(biāo)的局限性，最大程度保證尊重傳統(tǒng)用藥的原則，為后續(xù)大青龍湯的工業(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

參考古籍原文記載，本實(shí)驗(yàn)以水為提取溶劑，采用煎煮法進(jìn)行提取。影響提取工藝的因素為料液比、煎煮次數(shù)與煎煮時(shí)間，且因素間有交互作用。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)確定各因素水平的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步運(yùn)用高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化大青龍湯現(xiàn)代煎煮工藝參數(shù)，所得參數(shù)穩(wěn)定可行。最終確定煎煮工藝參數(shù)為煎煮2 次，加6 倍水，煎煮1.5 h。此工藝圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似度為0.901，出膏率18.3%，可以看出本實(shí)驗(yàn)采取的工藝優(yōu)化未對(duì)大青龍湯應(yīng)有成分造成破壞，標(biāo)準(zhǔn)圖譜與工藝優(yōu)化后大青龍湯圖譜基本一致，且煎煮效率有所提升，為其他復(fù)方的現(xiàn)代工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。