外源24-表油菜素內(nèi)酯對(duì)花后蘋果短枝葉片糖代謝和成花基因表達(dá)的影響

楊天一 馬利萍 李凱 張滿讓

摘 要 以24-表油菜素內(nèi)酯為外源處理劑，于盛花期后35 d和39 d對(duì)‘長(zhǎng)富2號(hào)蘋果樹進(jìn)行0.2 mg/L、0.4 mg/L和1.0 mg/L不同濃度2次疊加處理。為探究外源油菜素內(nèi)酯處理對(duì)蘋果花后當(dāng)年生短枝葉片可溶性糖含量影響，測(cè)定分析當(dāng)年生短枝葉片可溶性糖含量變化，并對(duì)其可溶性糖和成花相關(guān)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析。結(jié)果表明：不同濃度外源24-表油菜素內(nèi)酯處理，各可溶性糖含量發(fā)生不同變化，濃度0.4 mg/L處理在所設(shè)濃度梯度效果較好。除花后50 d外，其他時(shí)間蔗糖含量均顯著高于對(duì)照；葡萄糖和果糖含量在花后50～80 d均高于對(duì)照；經(jīng)外源處理后山梨糖醇含量先增加，但在70～80 d含量降低?？扇苄蕴窍嚓P(guān)基因表達(dá)也發(fā)生相似變化。促花基因? MdSOC1、? MdFT 在花后50 d和70～80 d表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。以上結(jié)果表明：適宜濃度的外源油菜素內(nèi)酯處理可增加當(dāng)年生短枝葉片可溶性糖含量，累積源葉中碳水化合物，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，同時(shí)促花基因累積表達(dá)。

關(guān)鍵詞 蘋果；油菜素內(nèi)酯；可溶性糖；成花；基因表達(dá)

蘋果（Malus domestica Borkh.）是一種栽培廣泛、具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要經(jīng)濟(jì)作物。花芽分化是開花結(jié)果的基礎(chǔ)，是果樹由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化的重要生命活動(dòng)，如何促進(jìn)花芽分化進(jìn)而提高產(chǎn)量是生產(chǎn)實(shí)踐中的重要環(huán)節(jié)。

蘋果花芽分化以春梢停止生長(zhǎng)前后為起點(diǎn)開始進(jìn)行[1]，可分為生理分化期、形態(tài)分化期和性細(xì)胞形成期?；ㄑ糠只浅苫ㄒ蛩胤e累的過程，尤其花芽生理分化期是形成花芽的關(guān)鍵時(shí)期，促花措施應(yīng)在花芽孕育臨界期進(jìn)行效果較好[2]。同時(shí)，有研究表明碳水化合物的代謝、累積和轉(zhuǎn)化參與花芽分化過程，且二者顯著相關(guān)[3-4]。短枝葉片營(yíng)養(yǎng)水平的高低，與成花誘導(dǎo)關(guān)系密切。

以往研究表明：植物生長(zhǎng)不但受內(nèi)源激素調(diào)控，而且增施合理濃度外源激素可一定程度影響植株?duì)I養(yǎng)及生殖生長(zhǎng)。近年來新型植物激素研究不斷取得進(jìn)展，油菜素內(nèi)酯（Brassinolide，BR）、茉莉酸、水楊酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯已逐漸成為熱門研究的植物激素。油菜素內(nèi)酯是一種新型的甾醇類植物激素，被稱為第六大類植物激素[5]。其在促進(jìn)細(xì)胞分裂伸長(zhǎng)[6]、器官分化、維管組織發(fā)育[7]、種子休眠與萌發(fā)[8]、葉片伸展、開花時(shí)間[9]以及抗逆[10]等生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到重要調(diào)控作用。

油菜素內(nèi)酯的研究多應(yīng)用于模式植物擬南芥和1 a生作物，對(duì)調(diào)控蘋果研究較少。本試驗(yàn)選擇眾多油菜素內(nèi)酯中的一種，即24-表油菜素內(nèi)酯（24-Epi），以8 a生‘長(zhǎng)富2號(hào)蘋果樹為材料，于花芽生理分化期進(jìn)行不同濃度外源噴施處理，研究其對(duì)當(dāng)年生短枝葉片的可溶性糖含量及相關(guān)基因、成花相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響，為油菜素內(nèi)酯在蘋果生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理

試驗(yàn)于2021年在陜西省西北農(nóng)林科技大學(xué)寶雞千陽(yáng)蘋果試驗(yàn)示范站進(jìn)行。所用24-表油菜素內(nèi)酯購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，無水乙醇溶解后，水稀釋至所需濃度。

選擇生長(zhǎng)健壯、無病蟲害、樹勢(shì)接近的8 a生‘長(zhǎng)富2號(hào)蘋果樹。為保證試驗(yàn)處理有效性，于盛花期后35 d（2021-05-15）與39 d（2021-05-19）在同一材料進(jìn)行2次疊加噴施24-表油菜素內(nèi)酯處理，濃度分別為0.2 mg/L、0.4 mg/L和1.0? mg/L。以噴施清水作為對(duì)照（CK），噴施程度為葉片和莖表面充分濕潤(rùn)但無液滴凝聚下落。每個(gè)處理重復(fù)噴施4棵樹，共16棵樹。以第2次處理完成后第2天（5月20日，花后40 d）為第1次采樣時(shí)間，于花后50 d、60 d、70 d、80 d每隔10 d隨機(jī)采集當(dāng)年生飽滿短枝（＜5 cm）的葉片，錫紙包裹并標(biāo)記后，液氮迅速冷凍帶回，-80? ℃保存，用于后續(xù)指標(biāo)測(cè)定。

1.2 可溶性糖含量的測(cè)定

可溶性糖的測(cè)定參照崔維芳[11]的研究，略有改動(dòng)：稱取鮮質(zhì)量0.1 g樣品于2 mL試管，立即用液氮凍存。加入75%色譜級(jí)甲醇（-20? ℃預(yù)冷） ? 1 400? μL，渦旋10 s后加入100? μL Ribitol核糖醇（4 mg/mL）為內(nèi)標(biāo)，充分渦旋。在70? ?℃金屬浴恒溫震蕩儀上950 r/min混勻30 min，13 000 g、 4 ℃離心15 min。將800? μL上清液轉(zhuǎn)移到10 mL試管中加入750? μL色譜級(jí)CHCL3（-20 ℃預(yù)冷）和1? 400? μL ddH2O（4 ℃預(yù)冷），充分振蕩后2 200 g、4 ℃離心15 min。上清中取出1 mL放在2 mL離心管中-80 ℃凍存；取10? μL上清液到1.5 mL試管中，真空濃縮機(jī)干燥1 h。干燥后加入40? μL甲氧胺鹽酸鹽的吡啶液（吡啶溶解，5?mg/mL），金屬浴恒溫震蕩儀950 r/min、37 ℃條件下振蕩2 h。加入60? μL N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）衍生劑，金屬浴恒溫震蕩儀300?r/min、37 ℃振蕩30 min。轉(zhuǎn)入上樣瓶，使用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS- QP2010，島津，Japan）測(cè)定后并計(jì)算各種糖含量。

1.3 可溶性糖和成花相關(guān)基因熒光定量表達(dá)分析

參照秦玲[12]方法提取樣品中總 RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)所提 RNA 濃度，瓊脂核糖凝膠電泳驗(yàn)證所提 RNA 的完整性和純度。使用 Evo?M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。

設(shè)計(jì)引物，如表1所示。根據(jù)上述 cDNA 為模板，參照試劑盒 SYBR[HT5”SS]○R Green Pro TaqHS預(yù)混型說明書在 QuantStudio5 定量?jī)x上進(jìn)行 qRT-PCR 反應(yīng)。以蘋果? MdACTIN 基因?yàn)閮?nèi)參。反應(yīng)體系為10? μL（其中 SYBR[HT5”SS]○R? Premix Ex TaqTM II 2×為5? μL，上、下游引物共0.5? μL，cDNA為1? μL，dd H2O為3.5? μL）。反應(yīng)程序參照秦玲[12]所描述的方法，為95 ℃預(yù)變性3 min，94? ℃變性15 s，60? ℃退火20 s，72? ℃延伸20 s，40 次循環(huán)，均設(shè)置3次重復(fù)，通過2-ΔΔCt方法[13]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26.0，對(duì)所有數(shù)據(jù)（表示為3次重復(fù)的平均值）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），顯著性分析采用Duncan氏多范圍檢驗(yàn)（P<0.05）。使用Excel 2010制作相關(guān)圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源24-Epi對(duì)當(dāng)年生短枝葉片可溶性糖含量的影響

對(duì)外源24-Epi處理后當(dāng)年生短枝葉片的可溶性糖含量研究發(fā)現(xiàn)（圖1），蔗糖含量在處理后隨即響應(yīng)處理，花后40 d時(shí)發(fā)生顯著變化；花后50 d時(shí)各種濃度處理均降低了短枝頂芽毗鄰葉蔗糖含量，除此外其他4個(gè)采樣時(shí)間的0.4 mg/L處理后的葉片蔗糖含量均高于對(duì)照?；ê?0 d，處理0.4 mg/L和1.0? mg/L與對(duì)照相比顯著提高了蔗糖含量，分別增加70%和42%，此期0.2 mg/L濃度處理對(duì)蔗糖含量?jī)H有少量增加。花后60 d時(shí)，各濃度處理葉片的蔗糖含量均顯著高于對(duì)照，同時(shí)處理0.4 mg/L顯著高于其他濃度處理?；ê?0 d處理0.2 mg/L和0.4 mg/L顯著增加葉片蔗糖含量?；ê?0 d時(shí)，0.4 mg/L處理的蔗糖含量顯著高于對(duì)照和其他處理，相較于對(duì)照增加了22%。

外源處理對(duì)葉片葡萄糖含量影響自花后50 d開始有顯著變化。處理0.4 mg/L在花后自響應(yīng)起至末期（花后50～80 d）均增加短枝葉片葡萄糖含量且顯著高于對(duì)照。處理0.2 mg/L于花后60～70 d相較于對(duì)照顯著增加了葉片葡萄糖含量。處理1.0 mg/L在花后50 d時(shí)提高了葡萄糖含量，顯著高于對(duì)照。短枝葉片果糖含量對(duì)處理的響應(yīng)時(shí)間最晚，且只在60 d和70 d發(fā)生了顯著變化?；ê?0 d時(shí)，處理0.4 mg/L葡萄糖含量顯著高于對(duì)照和其他處理，處理1.0 mg/L卻使葉片的葡萄糖含量相較于對(duì)照和其他處理顯著降低?；ê?0 d處理0.2 mg/L和0.4 mg/L顯著高于對(duì)照和處理1.0 mg/L。綜合變化趨勢(shì)來看，處理使葉片中果糖含量在花后40 d時(shí)先有所降低，50～70 d不同程度升高后，花后80 d時(shí)又下降。

同蔗糖一樣，在花后40 d時(shí)短枝葉片山梨糖醇含量已經(jīng)發(fā)生變化。此時(shí)各濃度處理均上調(diào)了葉片中山梨糖醇含量，其中處理0.2 mg/L的山梨糖醇含量顯著高于對(duì)照和1.0 mg/L；在花后50 d時(shí)該濃度處理顯著降低了山梨糖醇含量，60 d時(shí)又有所提高。處理0.4 mg/L在花后50 d和60 d時(shí)均分別顯著高于對(duì)照。在所有采樣時(shí)間內(nèi)，處理1.0 mg/L對(duì)山梨糖醇含量影響變化與對(duì)照間沒有顯著差異。山梨糖醇含量呈現(xiàn)規(guī)律性變化，花后40 d時(shí)各處理增加了短枝葉片中山梨糖醇的含量，花后50 d時(shí)呈不同程度下調(diào)趨勢(shì)，60 d上升后60～80 d對(duì)照和各處理的山梨糖醇含量在逐漸降低。

2.2 外源24-Epi對(duì)當(dāng)年生短枝葉片糖代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

與蔗糖合成相關(guān)聯(lián)的基因蔗糖合酶基因? MdSUSY1、蔗糖磷酸合成酶基因? MdSPS6 在外源24-Epi處理后發(fā)生顯著變化（圖2）。 MdSUSY1 表達(dá)量在花后40 d均呈現(xiàn)不同程度增加，且處理0.4 mg/L和1.0 mg/L顯著高于對(duì)照。處理0.4 mg/L在花后50 d顯著下調(diào)了基因? MdSUSY1表達(dá)，但花后70 d和80 d時(shí)該濃度處理使其表達(dá)顯著高于對(duì)照?；ê?0 d處理0.4 mg/L和1.0 mg/L上調(diào)基因? MdSPS6 表達(dá)且顯著高于對(duì)照?；ê?0 d和80 d時(shí)，0.4 mg/L顯著增加基因? MdSPS6 表達(dá)量，但在花后70 d處理0.2 mg/L顯著下調(diào)該基因表達(dá)水平。

己糖激酶基因? MdHXK1 在花后60～80 d發(fā)生顯著變化，在此期間處理0.4 mg/L均顯著上調(diào)表達(dá)。同時(shí)在花后60 d和70 d處理0.2 mg/L也顯著增加了基因? MdHXK1 的表達(dá)量。處理1.0 mg/L在花后60 d相較于對(duì)照顯著上調(diào)? MdHXK1 表達(dá)，但70 d時(shí)卻又顯著下調(diào)。處理1.0 mg/L在花后50 d和70 d顯著上調(diào)果糖激酶基因? MdFK4 表達(dá)水平。0.4 mg/L在花后70～80 d顯著上調(diào)? MdFK4 表達(dá)。0.2 mg/L處理僅在花后80 d對(duì)? MdFK4 基因表達(dá)產(chǎn)生影響，顯著低于對(duì)照和其他兩個(gè)濃度處理。

山梨糖醇合成關(guān)鍵基因6-磷酸山梨醇脫氫酶? MdS6PDH 在外源處理后的前期變化較明顯?；ê?0 d（即處理12 h），3種濃度處理顯著上調(diào)? MdS6PDH 表達(dá)?；ê?0 d處理0.2 mg/L和0.4 mg/L促使基因? MdS6PDH 表達(dá)顯著低于對(duì)照，但在花后60 d此兩種濃度處理使基因表達(dá)顯著高于對(duì)照?；ê?0 d處理0.4 mg/L，基因? MdS6PDH 相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照和1.0 mg/L。

2.3 外源24-Epi對(duì)當(dāng)年生短枝葉片成花相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖3可見，基因? MdSOC1 相對(duì)表達(dá)量在花后50 d響應(yīng)處理發(fā)生顯著變化，此時(shí)外源0.4 mg/L處理顯著增加了其表達(dá)量，同濃度處理在花后70～80 d也顯著上調(diào)? MdSOC1 表達(dá)；且在花后50 d和80 d時(shí)，0.4 mg/L濃度處理后基因? MdSOC1 表達(dá)量顯著高于對(duì)照和其他兩個(gè)濃度處理。花后60 d時(shí)處理0.2 mg/L和1.0 mg/L顯著下調(diào)了? MdSOC1 表達(dá)，但處理1.0 mg/L在花后70 d時(shí)顯著上調(diào)了該基因表達(dá)。

花后40 d時(shí)基因? MdFT 表達(dá)量已發(fā)生顯著變化，外源0.2 mg/L處理顯著降低該基因表達(dá)水平，1.0 mg/L卻使表達(dá)量顯著升高，但此時(shí)0.4 mg/L處理的基因表達(dá)量與對(duì)照較接近無明顯變化。花后50 d時(shí)處理0.4 mg/L 和1.0?mg/L上調(diào)了? MdFT 表達(dá)顯著高于對(duì)照。在60～80 d僅有處理0.4 mg/L對(duì)? MdFT 表達(dá)水平產(chǎn)生顯著影響，處理0.4 mg/L在花后50 d和70～80 d顯著上調(diào)了基因表達(dá)。

同? MdSOC1 一樣，基因? MdFLC 表達(dá)于花后50 d才開始變化，0.2 mg/L和1.0 mg/L顯著上調(diào)了表達(dá)；處理0.4 mg/L在此期顯著下調(diào)了基因表達(dá)?；ê?0 d，0.4 mg/L和1.0 mg/L顯著上調(diào)? MdFLC 表達(dá)。

外源0.2 mg/L處理在花后40 d顯著下調(diào)? MdSVP 表達(dá)；但花后50 d起均使表達(dá)量增加，尤其50 d和70～80 d顯著高于對(duì)照。0.4 mg/L處理在花后40 d和50 d顯著下調(diào)表達(dá)水平。1.0 mg/L在花后50 d和60 d顯著上調(diào)了基因? MdSVP 表達(dá)水平。

3 討? 論

3.1 外源24-Epi對(duì)當(dāng)年生短枝葉片可溶性糖含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響

在花芽分化研究過程中，研究普遍認(rèn)為碳水化合物的積累有利于花芽分化。糖作為主要能源來源參與植物開花過程[14]，可溶性糖的累積是花芽分化的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。糖通過光合作用在成熟葉片中合成，最終由韌皮部輸送到需養(yǎng)部位加以貯藏利用，實(shí)現(xiàn)從源到庫(kù)的轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。借助 RNA 測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)‘長(zhǎng)富和‘煙富蘋果花期短枝頂芽差異表達(dá)的基因與糖信號(hào)通路存在關(guān)聯(lián)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的外源24-表油菜素內(nèi)酯處理影響了當(dāng)年生短枝葉片的可溶性糖含量。

外源處理后（花后40 d），蔗糖含量得到顯著增加。雖然在花后50 d時(shí)各濃度處理降低蔗糖含量，但在花芽生理分化期后期各濃度處理仍增加葉片蔗糖含量，尤其處理0.4 mg/L促使葉片蔗糖含量顯著高于對(duì)照。蘋果葉片中蔗糖合成的主要 SPS 家族基因蔗糖磷酸合成酶? MdSPS6，與蔗糖相關(guān)的基因蔗糖合成酶? MdSUSY1 表達(dá)量也明顯升高?；ê?0 d時(shí)， MdSUSY1 表達(dá)量的增加較為明顯。處理0.4 mg/L對(duì)這兩個(gè)基因表達(dá)水平影響變化較為明顯。李天來等[17]對(duì)番茄幼苗葉噴施epi-BL，發(fā)現(xiàn)葉片蔗糖含量下降，這與本研究結(jié)果有相似之處，但處理明顯提高了番茄葉片 SUSY 的 mRNA 水平促進(jìn)轉(zhuǎn)錄水平的積累。Petzold等[18]在對(duì)蠶豆的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，外源24-Epi顯著增加了蠶豆葉片對(duì)蔗糖的吸收。蔗糖代謝是調(diào)控花芽分化的代謝樞紐之一，雖然目前尚不清楚蔗糖是作為信號(hào)分子還是作為能源物質(zhì)影響花芽分化，但可以肯定的是蔗糖的積累有利于花芽分化。在本研究中發(fā)現(xiàn)以濃度0.4 mg/L處理，除花后50 d外其他時(shí)間蔗糖含量均顯著高于對(duì)照，外源24-Epi增加了‘長(zhǎng)富2號(hào)當(dāng)年生短枝葉片蔗糖累積。山梨糖醇含量也在花后40 d亦開始響應(yīng)處理發(fā)生變化，但此時(shí)只有0.2 mg/L濃度處理顯著提高了葉片中山梨糖醇含量。外源24-Epi對(duì)山梨糖醇影響在花芽生理分化期后期不顯著，處理誘導(dǎo)變化發(fā)生在40～60 d，在此期間0.2 mg/L和0.4 mg/L的外源24-Epi顯著增加了山梨糖醇含量。6-磷酸山梨醇脫氫酶基因? S6PDH主要在葉片表達(dá)，其參與的反應(yīng)是山梨糖醇合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟[19]。對(duì)基因? MdS6PDH 定量分析發(fā)現(xiàn)，花后40 d各濃度處理的該基因表達(dá)均顯著高于對(duì)照，變化與山梨糖醇含量變化相一致。 MdS6PDH 在花后80 d表達(dá)顯著下調(diào)，此期山梨糖醇含量雖也有所下調(diào)但未達(dá)到顯著水平。

相較于蔗糖和山梨糖醇，葡萄糖和果糖對(duì)外源24-Epi處理的響應(yīng)較晚。在花后50 d時(shí)，0.2 mg/L和0.4 mg/L外源24-Epi處理顯著增加葉片中葡萄糖含量，同時(shí)在花后60～80 d處理0.4 mg/L葉片中葡萄糖含量顯著高于對(duì)照。張麗之等[20]研究發(fā)現(xiàn)噴施葡萄糖可作為一種調(diào)控‘富士蘋果成花的有效手段。本研究發(fā)現(xiàn)外源24-Epi處理增加了當(dāng)年生短枝葉片葡萄糖含量，這可能是外源24-Epi有利于蘋果花芽生理分化的又一原因。果糖在花后60 d時(shí)才發(fā)生顯著變化。葡萄糖和果糖在處理后沒有立即響應(yīng)外源處理，可能是其本身對(duì)油菜素內(nèi)酯響應(yīng)較晚，還存在另一可能，即前期累積的蔗糖通過蔗糖合成酶或轉(zhuǎn)化酶轉(zhuǎn)化分解形成了較多的葡萄糖和果糖，致使二者在葉片中含量增加。己糖激酶（HXK）已被證明是擬南芥中的葡萄糖感受器[21]，本研究同時(shí)對(duì)葡萄糖感應(yīng)因子己糖激酶基因? ?HXK1進(jìn)行了定量分析，其結(jié)果與葡萄糖含量變化較為一致，然而果糖激酶基因? MdFK4 與葉片中果糖含量變化一致性卻不是很高。

不同濃度外源24-Epi處理對(duì)短枝頂芽毗鄰葉的可溶性糖含量變化有一定影響，且不同濃度處理存在不相一致的變化。有關(guān) BR 濃度與其效應(yīng)的關(guān)系，Tong 等[22]認(rèn)為外源處理的 BR 濃度不同，會(huì)造成不同甚至相反的生理效應(yīng)。在本研究中濃度0.4 mg/L外源24-Epi處理促進(jìn)葉片中蔗糖、葡萄糖和果糖含量增加，較為明顯地積累了源葉中碳水化合物，這可為后期短枝頂芽發(fā)育需要較多的可溶糖能量積累做好“源”端準(zhǔn)備，可以促進(jìn)輸送較多同化物。同時(shí)糖也是高等植物葉片光合作用的產(chǎn)物[23]，當(dāng)年生短枝葉片中可溶性糖含量增多也恰從另一方面證明外源24-Epi對(duì)光合作用起到積極促進(jìn)作用。

3.2 外源24-Epi對(duì)當(dāng)年生短枝葉片成花相關(guān)基因表達(dá)的影響

在擬南芥中已有研究表明，BR通過調(diào)控 FLC 表達(dá)從而影響開花時(shí)間[24]。SVP 可能是受 BR 的直接調(diào)控[25]。并且有研究表明 SVP、 FT 和 SOC1 間存在關(guān)聯(lián)直接作用[26]。同時(shí)鑒于前人研究結(jié)果 FLC 作為參與春化和自主途徑的關(guān)鍵開花抑制因子，在蘋果花芽分化階段幾乎沒有在芽中表達(dá)[27]。在本研究中為了探究 BR 如何影響蘋果成花相關(guān)基因，對(duì)當(dāng)年生短枝葉片中的? MdFT、? MdSOC1、? MdFLC、? MdSVP 基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量分析。結(jié)果表明? MdFT 和? MdSVP 在處理第2天（花后40 d）就已對(duì)外源處理產(chǎn)生顯著響應(yīng)， MdSOC1 和? MdFLC 相較于對(duì)照雖均有不同程度下調(diào)但此期未達(dá)顯著變化。但蘋果成花誘導(dǎo)是一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)性過程，在本研究中? MdFT 和? MdSOC1 的表達(dá)量于花后50 d、70 d和80 d有一致的轉(zhuǎn)錄水平，均被0.4 mg/L外源24-Epi顯著上調(diào)，這可能是有利于‘長(zhǎng)富2號(hào)蘋果花芽生理分化的因素。本研究?jī)H對(duì)部分成花關(guān)鍵基因進(jìn)行了 RT-qPCR 相對(duì)表達(dá)量的分析，但未證明外源24-表油菜素內(nèi)酯是如何直接或間接影響具體哪個(gè)成花相關(guān)基因從而調(diào)控整個(gè)蘋果成花途徑，尚需后續(xù)的研究給予解答。

4 結(jié)? 論

綜上所述，于蘋果盛花期后2次疊加施用0.4 mg/L外源24-表油菜素內(nèi)酯有利于可溶性糖含量積累，促進(jìn)成花基因表達(dá)，對(duì)果樹光合作用起到一定促進(jìn)作用。在實(shí)際生產(chǎn)中可以參考這一手段調(diào)控蘋果樹體生長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ MONSELISE S P，HALEVY A H.Chemical inhibition and promotion of citrus flower bud induction［J］.Procamersochort，1964，84（5）：141-146.

［2］ 曹尚銀.蘋果花芽發(fā)育過程及其內(nèi)源激素變化規(guī)律的研究［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2000.

CAO SH Y.Studies on the developmental process of apple flower buds and the changes of endogenous hormones［D］.Nanjing：Nanjing Agricultural University，2000.

［3］ BUBAN T，F(xiàn)AUST M.Flower Bud? Induction in Apple Trees：Internal Control and Differentiation［M］.UK：Palgrave Macmillan，1982.

［4］ GARCIA L A，F(xiàn)ORNES F，GUARDIOLA J L.Leaf carbohydrates and flower formation in citrus［J］.Jamersochortsci，1995，120（2）：222-227.

［5］ SANTNER，AARON，CALDERON V，et al.Plant hormones are versatile chemical regulators of plant growth［J］.Nature Chemical Biology，2009，5（5）：301-307.

［6］ CLOUSE S D.Molecular genetic studies confirm the role of brassinosteroids in plant growth and development［J］.Plant Journal，2010，10（1）：1-8.

［7］ MITCHELL J W，MANDAVA N，WORLEY J F，et al.Brassins-a new family of plant hormones from rape pollen［J］.Nature，1970，225（5237）：1065-1066

［8］ STEBER C M，MCCOURT P.A role for brassinosteroids in germination in? Arabidopsis［J］.Plant Physiology，2001，125（2）：763-769.

［9］ NAKAMOTO D，IKEURA A，ASAMI T，et al.Inhibition of brassinosteroid biosynthesis by either a dwarf4? mutation or a brassinosteroid? biosynthesis? inhibitor rescues defects in tropic? responses of hypocotyls in the Arabidopsis? mutant nonphototropic hypocotyl 41［J］.Plant Physiology，2006，141（2）：456-464.

［10］ HAO J J，YIN Y H，F(xiàn)EI? S Z.Brassinosteroid signaling network：implications on yield and stress tolerance［J］.Plant Cell Reports，2013，32（7）：1017-1030.

［11］ 崔維芳.生長(zhǎng)素對(duì)蘋果糖代謝的影響及蘋果MdARP功能的初步研究［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2019.

CUI W F.Effects of auxin on sugar metabolism in apples and a preliminary study on the function of MdARP in apples［D］.Yangling Shaanxi：Northwest A&F University，2019.

［12］ 秦 玲.噴施亞精胺對(duì)‘長(zhǎng)富2號(hào)蘋果花芽成花的影響及多胺氧化酶基因家族的鑒定與分析［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2020.

QIN L.Effects of spermidine spraying on flower bud formation of apple ‘Nagafu 2 and identification and analysis of polyamine oxidase gene family［D］.Yangling Shaanxi：Northwest A&F University，2020.

［13］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-delta? delta C（T）） method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408.

［14］ GIBSON S? I.Control of plant development and gene expression by sugar signaling［J］.Current? Opinion in Plant Biology，2005，8（1）：93-102.

［15］ ROLLAND F，SHEEN J.Sugar sensing and signalling networks in plants［J］.Biochemical Society Transactions，2005，33（1）：269-271.

［16］ LI Y M，ZHANG D，ZHANG X，et al.A transcriptome?analysis of two apple （Malus×domestica） cultivars with different flowering abilities reveals a gene network module associated with floral transitions［J］.Scientia Horticulturae，2018，239：269-281.

［17］ 李天來，趙聚勇，崔 娜，等.苗期噴施表油菜素內(nèi)酯對(duì)番茄葉中蔗糖代謝的影響［J］.植物生理學(xué)報(bào)通訊，2008，44（3）：417-420.

LI T L，ZHAO J Y，CUI N，et al.Effects of spraying epibrassinolide at seedling stage on sucrose metabolism in tomato leaves［J］.Plant Physiology Journal，2008，44（3）：417-420.

［18］ PETZOLD U，PESCHEL S，DAHSE I，ADAM G.Stimulation of source-applied 14 C-sucrose export in Vicia faba plants by brassinosteroids，GA 3 and IAA［J］.Plant Biology，1992，41（4）：469-479.

［19］ 楊國(guó)嬋，謝銀鵬，馬鋒旺，等.蘋果6-磷酸山梨醇脫氫酶基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化及其轉(zhuǎn)錄活性［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，44（9）：8.

YANG G CH，XIE Y P，MA F W，et al.Transformation of apple sorbitol 6-phosphate dehydrogenase gene promoter and its transcriptional activity［J］.Journal of Northwest A&F University （Natural Science Edition），2016，44（9）：8.

［20］ 張麗之，張 昕，左希亞，等.2019.外源葡萄糖對(duì)‘長(zhǎng)富2號(hào)蘋果花芽生理分化期可溶性糖和相關(guān)基因表達(dá)的影響［J］.園藝學(xué)報(bào)，2019，46（1）：11-24.

ZHANG L ZH，ZHANG X，ZUO X Y，et al.Effects of exogenous glucose on the expression of soluble sugar and related genes during physiological differentiation of apple flower buds in ‘Nagafu 2［J］.Acta Horticulturae Sinica，2019，46（1）：11-24.

［21］ JYAN-CHYUN J，PATRICIA L，LI Z，et al.Hexokinase as a sugar sensor in higher plants［J］.The Plant Cell? Online，1997，9（1）：5-19.

［22］ TONG H N，XIAO，Y H，LIU D P，et al.Brassinosteroid regulates cell elongation by modulating gibberellin metabolism in rice［J］.The Plant Cell，2014，26（11）：4376-4393.

［23］ ELENA L，LUIGI D，AMEDEO A，et al.Why and how do plant cells sense sugars？［J］.Annals of Botany，2001，（5）：803-812.

［24］ DOMAGALSKA M A，SCHOMBURG F M，AMASINO R M，et al.Attenuation of brassinosteroid signaling enhances FLC expression and delays flowering［J］.Development （Cambridge，England），2007，134（15）：2841-2850.

［25］ 李計(jì)紅.擬南芥內(nèi)源油菜素內(nèi)酯對(duì)開花時(shí)間的影響及機(jī)理研究［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2011.

LI? J H.Effect of endogenous oleuropein lactones of Arabidopsis thaliana on flowering time and the mechanism［D］.Lanzhou：Lanzhou University，2011.

［26］ SEARLE I，HE Y H，TURCK F，et al.The transcription factor FLC confers a flowering response to vernalization by repressing meristem competence and systemic signaling in Arabidopsis［J］.Genes & Development，2006，20（7）：898-912.

［27］ XING L B，ZHANG D，LI Y M，et al.Transcription profiles reveal sugar and hormone signaling pathways mediating flower induction in apple （Malus domestica Borkh.）［J］.Plant Cell Physiol，2016，56（10）：2052-2068.

Abstract In order to explore the effect of exogenous brassinosteroids on the soluble sugar content in the annual spur leaves，24-Epicastasterone was used as exogenous treatment agent，‘Nagafu 2 apple trees were treated with 24-Epi at 35 and 39 days with two overlapping concentrations of 0.2 mg/L，0.4 mg/L and 1.0 mg/L after full bloom. The changes of soluble sugar content in the annual spur leaves were measured，and the quantitative real-time PCR analysis of soluble sugar and flowers related genes was conducted.The results showed that different concentrations of exogenous 24-Epicastasterone had different changes in soluble sugar content，and the concentration of 0.4 mg/L treatment had better effect in the set concentration gradient.The content of sucrose was significantly higher than the control at other times except for 50 days after full bloom; the content of glucose and fructose was higher than that of the control from 50-80 days after full bloom.The content of sorbitol increased after exogenous treatment，but decreased at 70-80 days.Similar changes occurred in soluble sugar-related gene expression.The expression of the flower-promoting genes? MdSOC1 and? MdFT were significantly higher than those of the control at 50 days and 70-80 days after full bloom.The above results indicated that exogenous oleuropein lactone treatment at appropriate concentrations could increase the soluble sugar content of annual spur leaves，accumulate carbohydrates in the? leaves，facilitate nutrient transport，and the accumulate the expression of flower-promoting genes.

Key words Malus domestica; Brassinolide; Soluble sugar; Flowering; Gene expression