動物布魯氏菌病不同初篩及確診方法組合檢測差異性比對分析

劉麗婭 席銳 葉鋒 馬曉菁 谷文喜 陳榮貴 葛小強 馬俊杰 易新萍

摘 要 為探討布魯氏菌病采用先初篩、后確診不同方法及試劑組合檢測結果的差異性，對實驗室保存的133份牛、羊血清，以英國布病參考實驗室RBT、SAT、APHA-cELISA方法為標準確定布病陽性血清73份、陰性血清60份。選擇4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑，按照先初篩，對結果陽性樣品再確診的檢測程序對確定的133份血清樣品分別用6種方法（9種試劑）進行檢測，結果表明：用18種組合方法檢測牛陽性血清樣品，符合率100%的有3種，檢測結果假陰性率為0～53.33%；用12種組合方法檢測羊陽性血清樣品，符合率100%的有2種組合方法，檢測結果假陰性率為0～50.00%。用所有方法檢測牛陰性血清樣品，符合率100%的有1種方法（試劑），檢測結果假陽性率為0～77.78%；檢測羊陰性血清樣品，符合率100%的有4種方法（試劑），檢測結果假陽性率為0～41.67%。應用不同的初篩、確診組合方法檢測同批樣品，結果出現(xiàn)了多樣性。建議布病初篩可優(yōu)先選擇iELISA、RBT、FPA，確診可優(yōu)先選擇cELISA。

關鍵詞 布魯氏菌??；初篩；確診；差異性

布魯氏菌病作為主要的人畜共患病，不僅對人類健康產(chǎn)生較大的威脅，對畜牧業(yè)也造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。中國作為農(nóng)牧業(yè)大國，布病發(fā)病率較高，特別是人畜之間的傳染現(xiàn)象較為嚴重[2]。近年來布病疫情呈持續(xù)上升態(tài)勢，最主要的原因是傳染源的持續(xù)存在，病畜沒有及時被檢出，發(fā)現(xiàn)的病畜不能被及時處理，加之畜牧業(yè)的快速發(fā)展，牲畜交易、流通頻繁，造成傳染源的擴散[3]。國家布魯氏菌病防治計劃要求在全國范圍內實施監(jiān)測凈化，快速、準確的診斷方法及檢測產(chǎn)品是有效開展布病防控工作的關鍵環(huán)節(jié)和必要條件。

目前，布病的診斷主要采用病原學和血清學方法，相對復雜繁瑣、耗時長、危險大的病原學細菌分離方法而言，血清學方法因其快速、簡便、費用低等優(yōu)點，是動物布病檢疫最常用的診斷方法[4-8]。布病血清學診斷方法種類很多，但目前還沒有任何一種方法能兼具高敏感性、高特異性以及操作簡便、易行、快速等優(yōu)點[9]。為了避免造成陽性動物的誤檢或漏檢，布病檢測應先選擇敏感性高、操作較為簡便、價格低廉的方法進行初篩，再用敏感性、特異性均較高的診斷方法予以確診，以達到最全面、準確的檢測效果[10]。已有報道對布病的不同血清學方法或試劑檢測結果存有差異進行了研究分析[11-16]。中國國標《動物布魯氏菌病診斷技術》（GB/T18646-2018）中規(guī)定，可用RBPT和iELISA方法進行動物布魯氏菌病的初篩，用SAT和cELISA方法進行確診。目前國內外對布病的診斷方法研究非常多，實際采用的診斷方法也多種多樣，但都存在著不同的缺點[17]。本研究應用不同診斷試劑，及不同先初篩后確診的組合方法，對布病檢測結果進行比對分析。選用4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑，對已確定布病的陰、陽性牛、羊血清進行檢測，以此了解應用不同初篩、確診組合方法及不同廠家診斷試劑檢測結果的差異性，以期為中國布病防控工作的有效開展提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 樣品 新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所保存的133份樣品，其中牛血清81份，羊血清52份。

1.1.2 診斷試劑 布病對照血清：陽性對照血清購自哈藥集團生物疫苗有限公司（201401）），陰性對照血清購自哈藥集團生物疫苗有限公司（201403）；標準樣品檢測試劑：英國參考實驗室布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原，英國參考實驗室布病試管凝集實驗抗原（0054），英國參考實驗室APHA競爭性ELISA試劑盒（C223-17）；初篩方法（試劑）：ZS-RBT為北京某所布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原（2017810）；HP-FPA為哈爾濱某公司布魯氏菌病熒光偏振測定法試管型抗體檢測試劑盒（921012-1）；SZ-GICA為深圳某公司布魯氏菌病抗體快速檢測卡（2018041212）；LY-GICA為蘭州某公司布魯氏菌抗體檢測試劑盒（膠體金法）（20170501）；ZS-iELISA為某所牛布病間接ELISA抗體檢測試劑盒（17111506）；ZD-iELISA為浙江某公司牛布魯氏菌病間接ELISA抗體檢測試劑盒（01117）；確診方法（試劑）：ZS-SAT為某所布病試管凝集實驗抗原（20170620）；BW-cELISA為北京某公司cELISA布魯氏桿菌抗體檢測試劑盒（18040308G）；SZ-cELISA為深圳某公司布魯氏菌病抗體檢測試劑盒（2018030902）。所有試劑、檢測卡和試劑盒均在有效期內。

1.2 方? 法

1.2.1 血清樣本檢測與結果判定 所有方法均嚴格按照國標GB/T18646-2018 的規(guī)定和試劑盒說明書進行操作及結果判定。

1.2.2 標準陰、陽性血清樣品的確定 對113份血清樣品進行布病檢測，先用英國參考實驗室布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗抗原進行RBT初篩，初篩陽性樣品再用英國參考實驗室布病試管凝集實驗抗原、英國參考實驗室APHA-cELISA方法進行確診。后2種確診方法檢測結果都為陽性的判定為陽性。3種方法檢測結果都為陰性的判定為陰性。以此結果為標準確定本試驗的標準陰、陽性血清樣品。

1.2.3 差異性分析 對上述確定的陽性血清樣品，先選擇一種初篩方法（試劑）進行初篩，對初篩結果為陽性的樣品，再選擇一種確診方法（試劑）進行確診。對上述確定的陰性血清樣品，用9種方法（試劑）分別進行檢測（表1）。計算假陽性率=b/（b+d），假陰性率=c/（a+c）[18]。

2 結果與分析

2.1 陰、陽性血清樣品的確定

對133份牛、羊血清樣品進行檢測，最終確定標準牛陽性血清45份、陰性36份；標準羊陽性血清28份、陰性24份（表2）。

2.2 布病牛血清檢測結果差異性

2.2.1 牛標準陽性血清樣品的檢測 對45份標準牛布病陽性血清，選擇4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑，按照先應用初篩方法全面檢測后，結果為陽性的樣品再應用確診方法進行檢測，共有18種檢測組合。

結果顯示，檢測出45份陽性血清、假陰性率為0的有3種組合，分別為ZS-RBT、BW-cELISA；ZD-iELISA、BW-cELISA；ZS-iELISA、BW-cELISA。檢測出21份陽性血清、假陰性率最高達53.33%的有3種組合，分別為LY-GICA、ZS-SAT；LY-GICA、BW-cELISA；LY-GICA、BW-cELISA。檢測陽性血清為44份的有9種組合，檢測陽性血清為43份的有1種組合，檢測陽性血清為42份的有2種組合，假陰性率為2.22%～6.67%。

2.2.2? 牛標準陰性血清樣品的檢測 分別用4種初篩方法共6種試劑、2種確診方法共3種試劑對36份標準牛陰性血清進行檢測。

結果顯示（表3），檢測出36份陰性血清、假陽性率為0的有1種方法（試劑）是LY-GICA；檢測出8份陰性血清、假陽性率為77.78%的有1種方法（試劑）是ZD-iELISA。檢測陰性血清為32份的有1種方法（試劑），檢測陰性血清為28份的有1種方法（試劑），檢測陰性血清為24份的有2種方法（試劑），檢測陰性血清為20份的有1種方法（試劑），檢測陰性血清為12份的有1種方法（試劑），檢測陰性血清為10份的有1種方法（試劑），檢測陰性血清為8份的有1種方法（試劑），假陽性率為11.11%～72.22%。

2.3 布病羊血清差異性檢測

2.3.1 羊標準陽性血清樣品的檢測 分別用3種初篩方法共4種試劑、2種確診方法共3種試劑對28份標準羊陽性血清進行檢測，按照先應用初篩方法全面檢測，對結果為陽性的樣品再應用確診方法進行檢測，共有12種檢測組合。

結果顯示（表4），檢測出28份陽性血清、假陰性率為0的有2種組合，分別為HP-FPA、BW-cELISA；HP-FPA、SZ-cELISA。檢測出14份陽性血清、假陰性率最高達50%的有1種組合，為LY-GICA、ZS-SAT。檢測陽性血清為26份的有4種組合，檢測陽性血清為24份的有2種組合，檢測陽性血清為22份的有1種組合，檢測陽性血清為16份的有1種組合，假陰性率為7.14%～42.86%。

2.3.2 羊標準陰性血清樣品的檢測 對24份標準羊陰性血清，用3種初篩方法共4種試劑、2種確診方法共3種試劑分別進行檢測。

結果顯示（表5），檢測出24份陰性血清、假陽性率為0的有4種方法（試劑）：ZS-RBT、SZ-GICA、LY-GICA、SZ-cELISA；檢測出14份陰性血清、假陽性率為41.67%的有1種方法（試劑）：BW-cELISA。檢測陰性血清為22份的有1種方法（試劑），檢測陰性血清為16份的有1種方法（試劑），假陽性率為8.33%～33.33%。

3 討? 論

畜間布病是人間布病流行的晴雨表，做好畜間布病防控對人畜健康都有重要意義。近年來隨著中國養(yǎng)殖規(guī)模的擴大及牲畜、畜產(chǎn)品的大量流通，畜間布病仍未得到有效控制?？傮w來看，每年的發(fā)病數(shù)量沒有呈現(xiàn)出顯著性下降的趨勢[19]，布病防控工作任重而道遠。當前中國布病防控采取“檢疫撲殺和疫苗免疫”相結合的綜合防控措施，診斷結果的準確性關乎著防控工作的成功與否。在實際檢疫中，診斷方法的選擇、診斷試劑敏感性、特異性的差別以及檢測人員的操作，都影響著布病診斷的最終結果。

本研究對牛、羊應用布病不同初篩及確診方法組合的檢測差異性結果進行研究、比對分析。選擇布病臨床診斷中常用的4 種初篩方法共6 種試劑、2 種確診方法共3 種試劑，依照先初篩再確診的組合檢測方法，對確定的標準牛、羊血清樣品進行檢測。標準牛陽性血清檢測用18種組合方法，陽性符合率為100%的有3種組合，檢測結果假陰性率為0～53.33%；標準羊陽性血清檢測用12種組合方法，陽性符合率為100%的僅有2種組合，檢測結果假陰性率為0～50.00%。標準牛陰性血清用所有方法（試劑）進行檢測，陰性符合率為100%的僅有1種方法（試劑），檢測結果假陽性率為0～77.78%；標準羊陰性血清用所有方法進行檢測，陰性符合率為100%的有4種方法（試劑），檢測結果假陽性率為0～41.67%。研究表明，布病初篩方法可優(yōu)先選擇iELISA、RBT、FPA。不同廠家的膠體金方法檢測結果間存在顯著差異；確診方法可優(yōu)先選擇cELISA。

本研究應用的診斷方法、商品化的診斷試劑及不同的初篩、確診組合方法，在實際檢測中常會用到，所得的檢測結果間卻存有較大差異。這些漏檢的假陰性樣品、誤檢的假陽性樣品，致使傳染源進一步傳播擴大，或因誤殺健康動物造成不必要的經(jīng)濟損失，都制約著布病的有效防控和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為避免診斷結果出現(xiàn)的多樣性與不確定性[20]，在診斷試劑的監(jiān)管、評估方面應加強管理，制定全國統(tǒng)一的質量標準要求，保證檢驗效果，從而確保檢測結果的可靠性。

參考文獻 Reference：

［1］ 韓玉霞，孫志華，劉 娟，等.布氏桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)相關蛋白基因RicA的克隆、原核表達及免疫原性分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2015，24（5）：18-23.

HAN Y X，SUN ZH H，LIU J，et al.Cloning and prokaryotic expression of related proteins gene RicA in brucella type Ⅳ secretion system and its immunogenicity analysis［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2015，24（5）：18-23.

［2］ 劉 鑫.布魯氏菌病的實驗室檢測及疫苗研究進展［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2016，16（65）：31.

LIU? ?X.Laboratory detection and vaccine research progress of brucellosis［J］.Digest of World Latest Medical Information，2016，16（65）：31.

［3］ 崔步云，姜 海.2005-2016年全國布魯氏菌病監(jiān)測數(shù)據(jù)分析［J］.疾病監(jiān)測，2018，33（3）：188-192.

CUI B Y，JIANG H.Surveillance data of brucellosis in China 2005-2016［J］.Disease Surveillance，2018，33（3）：188-192.

［4］ 孫瑞敏，劉培偉.布魯氏菌病14例報告［J］.中國地方病學雜志，2003（3）：23.

SUN R M，LIU P W.Report of 14 cases of brucellosis［J］.Chinese Journal of Endemiology，2003（3）：23.

［5］ 才學鵬.我國人畜共患病流行現(xiàn)狀與對策［J］.獸醫(yī)導刊，2014（13）：24-26.

CAI X P.Current status and countermeasures of zoonotic diseases in my country［J］.Veterinary Guide，2014（13）：24-26.

［6］ 趙鳳菊，劉坤洋，于學武，等.牛布魯氏菌病不同血清學檢測方法的比較分析［J］.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015（3）：12-15.

ZHAO F J，LIU K Y，YU X W，et al.Comparative analysis of different serological detection methods for bovine brucellosis［J］.Modern? ? Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2015（3）：12-15.

［7］ 毛愛民，范 鋒，楊芝芬，等.奶牛布魯氏菌抗體檢測常用方法的篩選［J］.中國畜牧獸醫(yī)文摘，2016，32（11）：59-60.

MAO A M，F(xiàn)AN F，YANG ZH F，et al.Screening of common methods for detecting antibodies to Brucella in dairy cows［J］.Chinese Journa? ?l of Animal Husbandry and Veterinary Digest，2016，32（11）：59-60.

［8］ 蔡一非，鐘 旗，伊日蓋，等.兩奶牛場布氏桿菌分離鑒定及四種血清學檢測方法比較［J］.中國人獸共患病雜志，2009，25（5）：456-459.

CAI Y F，ZHONG Q，YI R G，et al.Isolation and identification of Brucella from two dairy farms and comparison of four serological de? ?tection methods［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2009，25（5）：456-459.

［9］ 何亞鵬，許信剛，付明哲，等.豬種、牛種、羊種、綿羊種布魯菌多重PCR檢測方法的建立及應用［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2017，26（8）：1135-1140.

HE Y P，XU X G，F(xiàn)U M ZH，et al.Fundation and initial application of multiplex PCR method for detecting B.suis，B.Abortus，B.Melitensis and B.ovisinfotion［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2017，26（8）：1135-1140.

［10］ 王玉玲，王 可，張俊哲，等.布魯氏菌病6種血清學檢測方法的臨床應用比較［J］.中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2014，37（5）：318-320.

WANG Y L，WANG K，ZHANG J ZH，et al.Comparison of clinical application of six serological detection methods for brucellosis［J］.Chinese? Journal of Frontier Health and Quarantine，2014，37（5）：318-320.

［11］ 藺旭光，史量全，李佳怡，等.羊布魯氏菌病4種血清學檢測方法的臨床應用比較［J］.中國微生態(tài)學雜志，2018，30（4）：471-473.

LIN X G，SHI L Q，LI J Y，et al.Clinical application and comparation of four serological tests for sheep brucellosis in goats［J］.Chinese? ? Journal of Microecology，2018，30（4）：471-473.

［12］ 莫 茜，陽愛國，郝力力，等.牛羊不同布魯氏菌病血清學檢測方法的比較［J］.中國動物保健，2021，23（8）：109-110.

MO Q，YANG A G，HAO L L，et al.Comparison of different serological detection methods for brucellosis in cattle and sheep［J］.China Animal Health，2021，23（8）：109-110.

［13］ 尉瑞平，王美霞，宋利桃，等.布魯氏菌病3種檢測方法的比較分析［J］.醫(yī)學動物防制，2019，35（7）：711-713.

WEI R P，WANG M X，SONG L T，et al.Comparison and analysis of three detection methods for brucellosis［J］.Medical Animal Control， 2019，35（7）：711-713.

［14］ 趙 娜，趙赤鴻，榮 蓉，等.布魯氏菌病血清學Brucellacapt和iELISA檢測方法的比較［J］.中國人獸共患病學報，2014，30（10）：1045-1047.

ZHAO N，ZHAO CH H，RONG R，et al.Comparison of Brucellacapt and iELISA in serological diagnosis of Brucellosis［J］.Chinese Journal of Zoonoses，2014，30（10）：1045-1047.

［15］ 李盛瓊，侯 巍，莫 茜，等.不同布魯氏菌血清學方法檢測牛羊血清抗體的比對［J］.中國動物檢疫，2021，38（8）：99-102.

LI SH Q，HOU W，MO Q，et al.Comparison of different brucella serology methods for detection of bovine and sheep serum antibodies［J］.China Animal Quarantne，2021，38（8）：99-102.

［16］ 王慧飛，宗 鵬，徐 磊，等.Brucellacapt、RBT、SAT、iELISA四種血清學檢測方法對布魯氏菌病檢測價值的比較研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2019，19（4）：672-675，641.

WANG H F，ZONG P，XU L，et al.Comparison of four serological detection? mMethods of brucellacapt，RBT， SAT and iELISA in the detection of brucellosis［J］.Advances in Modern Biomedicine，2019，19（4）：672-675，641.

［17］ 范偉興，鐘 旗，何倩倪，等.幾種布魯氏菌病血清學診斷方法的比較研究［J］.中國動物檢疫，2006，23（6）：31-33.

FAN W X，ZHONG Q，HE Q N，et al.A comparative study on several methods of serological diagnosis of brucellosis［J］.Chinese Animal? Quarantine，2006，23（6）：31-33.

［18］ 王秀麗，蔣玉文，毛開榮，等.布魯氏菌病實驗室診斷方法的研究進展［J］.中國獸藥雜志，2011，45（11）：37-42.

WANG X L，JIANG Y W，MAO K R，et al.Research progress of laboratory diagnostic methods for brucellosis［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2011，45（11）：37-42.

［19］ 丁 雪，王 巖，劉麗蓉，等.布魯氏菌病檢測和防治方法研究進展［J］.中國動物檢疫，2019，36（5）：43-48.

DING X，WANG Y，LIU L R，et al.Research progress in detection and control methods of brucellosis［J］.Chinese Animal Quarantine，2019，36（5）：43-48.

［20］ 李 峰，黃興軍，董炳梅，等.某地區(qū)羊布魯氏菌病血清學調查與4種血清學檢測方法的比較應［J］.中國草食動物科學，2020，40（2）：48-50.

LI F，HUANG X J，DONG B M，et al.Serological investigation of sheep brucellosis in a certain area and the comparison and application of four serological detection methods［J］.Chinese Herbivore Science，2020，40（2）：48-50.

Abstract In order to explore brucellosis，the methods such aspreliminary screening at first， and then diagnosis confirmation，the differences of reagent combinationresults were used.The RBT， SAT， APHA-cELISA method of the British Brucellosis Laboratory were used as the standard，73 samples of brucellosis positive sera and 60 samples of negative sera? were confirmed with the 133 samples of bovine and sheep serum stored in the laboratory.Four primary screening methods including 6 reagents， and 2 confirmatory methods including 3 reagents were selected，the preliminary screening was done first ， and then the positive results were confirmed， the determined 133 serum samples were tested by 6 methods （9 reagents）.The result showed that 18 kinds of combination methods were used to detect positive sera from cattle， 3 of which had a 100% coincidence rate， and the false-negative rate was 0 to 53.33%;12 combinations? were used to detect positive sera from sheep， and two combinations had a 100% coincidence rate ， the false negative rate of test results was 0-50.00%. Cattle negative serum was tested by all methods，there was 1 method （reagent） with a compliance rate of 100%， and the false positive rate of test results was 0-77.78%;sheep negative serum was tested by all methods and the compliance rate was 100% by use of 4 methods （Reagent）， the false positive rate of test results was 0-41.67%. In this study， different combination methods for preliminary screening and diagnosis were used to detect the same batch of samples， and the results showed diversity. It is recommended that iELISA， RBT， and FPA should be preferred for initial screening of brucellosis， and cELISA should be preferred for diagnosis.

Key words Brucellosis; Preliminary screening; Diagnosis; Difference