牦牛CCL14蛋白對HepG2細胞活性和凋亡的影響

梅群弟 李娟 王利

摘 要 旨在研究牦牛CCL14蛋白（Bos grunniens C-C motif chemokine 14 protein， BgCCL14）對HepG2細胞的影響和作用機制。將原核表達的BgCCL14蛋白與HepG2細胞共培養(yǎng)，利用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，平板克隆檢測細胞克隆形成能力，細胞劃痕檢測細胞遷移以及熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的表達量。結(jié)果表明，1? μg/mL、10? μg/mL和20? μg/mL的BgCCL14蛋白均能顯著降低HepG2細胞活性；20 μg/mL的BgCCL14蛋白對細胞增殖和遷移有極顯著抑制作用；20? μg/mL的BgCCL14蛋白處理36 h極顯著上調(diào)凋亡基因BAK和BAX 的mRNA水平，極顯著降低? HIF1A、? PI3K和 CDK1基因的mRNA水平，顯著降低mTOR基因 的mRNA水平。這表明BgCCL14蛋白可能通過促進細胞凋亡抑制肝癌細胞活性。

關(guān)鍵詞 CCL14；HepG2細胞；凋亡

趨化因子是一類分子質(zhì)量8～10 ku的分泌性蛋白，根據(jù)前兩個半胱氨酸殘基的位置可分為C、CXC、CC或CX3C 4 個亞家族[1]。CC基序趨化因子配體14（C-C motif chemokine 14 protein， CCL14）是一種小的分泌性蛋白，又被稱為血濾液CC趨化因子1（HCC-1），根據(jù)其序列和結(jié)構(gòu)同源性被確定為CC趨化因子家族成員[2-3]。? CCL14基因聚集在17q11.2號染色體[4-5]，編碼一種促進免疫細胞活化的趨化因子。? CCL14在血漿中濃度很高，且在脾、肝、骨骼肌、心肌、腸道和骨髓等正常組織中均有表達[6]，與CCR1、CCR3和CCR5結(jié)合，發(fā)揮促進單核細胞、嗜酸性粒細胞和T淋巴母細胞的趨化等功能[7-9]。此外，? CCL14在腫瘤中與腫瘤血管生成、侵襲以及腫瘤浸潤的免疫細胞趨化等密切相關(guān)。? CCL14還被報道與多種人類癌癥的預后相關(guān)，低水平的? CCL14 mRNA提示與包括肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺導管腺癌在內(nèi)的幾種癌癥的預后較差[10]。通過基因過表達與敲除研究? CCL14對肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma， HCC）細胞系增殖、遷移的影響[11]，但CCL14蛋白的體外活性、對癌細胞的影響及機制的研究還未見報道。

HCC是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居于前列。HCC具有較高的疾病復發(fā)率，且多數(shù)肝癌患者存在預后較差的問題[12-13]。因此，深入了解肝癌發(fā)病的分子機制對于開發(fā)新的治療方法以提高生存率至關(guān)重要。而牦牛作為中國西部高原的優(yōu)質(zhì)遺傳牛種，是非常寶貴的資源庫[14-15]。此前本實驗室（西南民族大學動物分子遺傳與育種實驗室）已克隆了牦牛? CCL14基因，并選擇pET-28a（+）載體進行原核表達，獲得26 ku的重組蛋白。本研究采用肝細胞癌HepG2細胞系與原核表達的牦牛? CCL14重組蛋白（BgCCL14）共培養(yǎng)，研究CCL14對HepG2細胞活性、克隆形成及遷移的影響和作用機制，以期為抗癌機制研究和肝細胞癌的治療積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材? 料

1.1.1 試驗細胞 肝細胞癌HepG2細胞系由成都醫(yī)學院饋贈。

1.1.2 主要試劑 BgCCL14蛋白由西南民族大學動物科學國家民委重點實驗室此前原核表達并凍存；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT reagent Kit（Cat# RR047A）和TB Green TM? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Cat# RR820A）購自寶日生物技術(shù)（北京）有限公司；結(jié)晶紫染液（S19004）購自源葉生物有限公司；青霉素-鏈霉素溶液（E607011-0100）、DMEM培養(yǎng)基（E600003-0500）、胎牛血清（E510008-0100）、胰蛋白酶消化液（E607002-0100），CCK-8試劑盒（E606335-0250），以及熒光定量PCR所涉及的引物購自生工生物工程有限公司，具體引物信息見表1，部分引物參照石浩等[12]設計。

1.2 方? 法

1.2.1 細胞分離培養(yǎng) 凍存的HepG2細胞于37 ℃水浴鍋中迅速融化，吸取細胞懸液至15 mL離心管中，加入10 mL DMEM培養(yǎng)液混勻后1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀用5 mL含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液重懸，加入到T25細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待HepG2細胞生長到80%～90% 覆蓋率，用0.25%的胰酶對細胞消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀重懸后用細胞計數(shù)儀計數(shù)，按對應的濃度將細胞加入相應的細胞培養(yǎng)板中，用于后續(xù)的試驗。

1.2.2 CCK-8檢測 消化傳代的HepG2細胞按1×104個/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞達到80%～90%覆蓋率左右換液，加入終濃度為0 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的BgCCL14蛋白（每個濃度設置復孔3 個）。在相同條件下培養(yǎng)24 h，加入10 μL CCK-8 Solution后37 ℃孵育，酶標儀檢測波長450 nm處的吸光值。

1.2.3 細胞克隆形成試驗 對數(shù)生長期的HepG2細胞消化傳代后，以約1×103個/孔細胞的密度將細胞接種于6孔板中，加入終濃度為0 μg/mL和20 μg/mL的BgCCL14蛋白（每個濃度設置復孔3個），將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)2周，棄除細胞培養(yǎng)液上清后，加入4%的多聚甲醛覆蓋細胞，固定30 min左右，用無菌PBS洗滌2～3次，加入結(jié)晶紫對細胞染色10 min，用無菌水洗滌，晾干后拍照并計數(shù)。

1.2.4 細胞劃痕試驗 將細胞密度為5×105個/mL的HepG2細胞鋪于24孔板上，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，直至長成單層細胞。用直尺和10 μL槍頭對單層的肝癌細胞劃線，呈“一”字劃痕，劃線完成的細胞用PBS緩沖液洗滌2～3 次，加入DMEM培養(yǎng)液，再加入終濃度為0 μg/mL和20 μg/mL的BgCCL14蛋白進行處理（每個濃度設置復孔3個）。相同條件下培養(yǎng)36 h，在倒置相差顯微鏡下觀察肝癌細胞的遷移情況，并用Image J軟件對遷移程度進行分析。

1.2.5 總RNA提取和cDNA的獲得 取處理后的細胞，去除上清液，加入1 mL的Trizol溶液，用苯酚/氯仿/異戊醇的方法抽提細胞總RNA，使用Prime ScriptTM RT reagent Kit和反轉(zhuǎn)錄程序獲得細胞cDNA。

1.2.6 熒光定量PCR檢測 將消化傳代的HepG2細胞以3×105 個/cm2的密度接種于6孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后進行換液，向其中加入終濃度為20 μg/mL的CCL14蛋白，并設置未加任何細胞因子的對照組。將細胞在相同條件下培養(yǎng)12 h、24 h和36 h，分別在3 個不同時間段收集細胞，提取HepG2細胞RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以細胞cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參，檢測BAK、BAX、? HIF1A、? PI3K、mTOR、 CDK1基因的mRNA水平。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，細胞遷移情況采用Image J軟件進行分析，熒光定量PCR相關(guān)基因表達量以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進行處理。采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）分析顯著性，“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BgCCL14蛋白降低HepG2細胞活性

利用CCK8方法檢測HepG2細胞在不同濃度BgCCL14蛋白處理下的細胞活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1）HepG2細胞活性隨BgCCL14蛋白的質(zhì)量濃度增加而降低。HepG2細胞活性在1 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL的BgCCL14蛋白處理下均受到抑制，在20 μg/mL的BgCCL14蛋白處理下活性最低，且3 個BgCCL14蛋白濃度處理下的HepG2細胞活性均顯著低于0 μg/mL組。

2.2 BgCCL14蛋白抑制HepG2細胞的克隆形成

經(jīng)BgCCL14蛋白處理的HepG2細胞培養(yǎng)過后，用倒置相差顯微鏡進行拍照，并記錄其克隆形成情況（圖2），發(fā)現(xiàn)BgCCL14蛋白對肝癌細胞的克隆大小和克隆數(shù)量有一定的抑制作用，且BgCCL14蛋白處理的肝癌細胞數(shù)量極顯著低于0 μg/mL組。

2.3 BgCCL14蛋白抑制HepG2細胞的遷移

對BgCCL14蛋白處理24 h的HepG2細胞進行遷移能力測定，計算其細胞的遷移率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)BgCCL14蛋白處理的肝癌細胞遷移率降低，極顯著低于0 μg/mL組（圖3）。

2.4 BgCCL14蛋白促進HepG2細胞凋亡

經(jīng)20 μg/mL的BgCCL14蛋白處理12 h、24 h和36 h后，利用熒光定量PCR對HepG2細胞進行相關(guān)基因水平的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BAK基因在BgCCL14蛋白處理12 h、24 h和36 h的表達量均增加（圖4），且12 h和36 h表達量均極顯著高于0 μg/mL組。BAX基因表達量在BgCCL14蛋白處理12 h、24 h和36 h均增加，且12 h、24 h和36 h處理的表達量極顯著高于0 μg/mL組。? HIF1A基因的表達量在CCL14蛋白處理12 h后極顯著高于0 μg/mL組，24 h和36 h的表達量降低，且36 h的表達量極顯著低于0 μg/mL組。? PI3K基因表達量在BgCCL14蛋白處理12 h、24 h和36 h后降低，且3 個時間段均極顯著低于0 μg/mL組。mTOR基因的表達量在CCL14蛋白處理12 h、24 h和36 h后均降低，且36 h顯著低于0 μg/mL組。 CDK1基因表達量在BgCCL14蛋白處理12 h、24 h 和36 h后均降低，且3 個時間段的表達量均顯著低于0 μg/mL組。

3 討? 論

趨化因子主要參與調(diào)節(jié)細胞運輸和控制血管生成參與感染和炎癥期間的宿主反應，在免疫細胞到損傷和感染部位的募集和激活中起關(guān)鍵作用[1， 16-17]，還與癌癥的進展、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。作為腫瘤微環(huán)境的重要成員，趨化因子介導免疫細胞向腫瘤微環(huán)境的募集，直接或間接地參與腫瘤環(huán)境和免疫機制的形成，還可直接影響腫瘤細胞的生存和發(fā)展[18-19]。例如，CXCL9和CXCL10與卵巢癌、結(jié)腸癌患者腫瘤免疫細胞浸潤、轉(zhuǎn)移及生存率相關(guān)，裸鼠動物試驗也證明它們具有抗腫瘤作用[20]；CXCL8在腫瘤微環(huán)境中募集Treg細胞，參與腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[21]；CCL7通過ERK/JNK通路影響肝癌細胞的侵襲和遷移[22]；CXCL3調(diào)節(jié)乳腺癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]等。

CCL14與CC家族其他的趨化因子一樣，除了與機體免疫的發(fā)生相關(guān)，還參與癌癥等許多疾病進展[24-26]。CCL14除在多種正常組織中表達外，也在癌組織中存在異常表達。CCL14在包括肝癌、乳腺癌、肺癌和胰腺導管腺癌等多種人類癌癥組織中表達量明顯低于正常組織，被確定為一種潛在的預后生物標志物[27]。肝癌中CCL14 mRNA水平與腫瘤浸潤的免疫細胞類型和數(shù)量相關(guān)；過表達和敲除試驗發(fā)現(xiàn)CCL14可抑制多種HCC細胞系的增殖活性和動物移植瘤模型的生長[11， 25， 28]。而本試驗的BgCCL14蛋白也具有相同的作用，體外與HepG2細胞共培養(yǎng)使細胞活性、克隆形成和遷移能力降低。表明BgCCL14重組蛋白擁有與體內(nèi)蛋白相似的性質(zhì)，對腫瘤細胞有一定抑制作用。

目前關(guān)于趨化因子抗腫瘤的機制研究仍較少見，誘導腫瘤細胞凋亡是很重要的一種手段[29]。慢病毒載體過表達的CCL14可以通過抑制Wnt/β-catenin通路的激活而發(fā)揮促進腫瘤細胞凋亡，抑制癌細胞增殖的作用[30]。本試驗中BgCCL14蛋白可顯著上調(diào)HepG2細胞凋亡相關(guān)基因BAX、 BAK和? CDK1 mRNA 水平，BAX和BAK是BCL-2家族典型的凋亡促進基因，其蛋白質(zhì)形式可以在線粒體膜形成膜孔，釋放細胞色素C，誘導凋亡小體產(chǎn)生[31]； CDK1在有絲分裂、G2/M期檢查點執(zhí)行維護、細胞凋亡、細胞多能性和基因組穩(wěn)定性維護等發(fā)揮重要作用[32-33]。? HIF1A由于在腫瘤中具有雙向調(diào)控的作用，其基因水平在短時間內(nèi)升高，隨著時間增加而下調(diào)[34-35]。表明BgCCL14蛋白可能也通過凋亡途徑抑制腫瘤細胞活性。同時存在通路相關(guān)基因? PI3K、mTOR下調(diào)的現(xiàn)象，PI3K/mTOR通路可能是BgCCL14促細胞凋亡的潛在機制。

綜上所述，肝癌細胞HepG2與牦牛CCL14蛋白共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BgCCL14能夠顯著抑制HepG2細胞活性和上調(diào)凋亡相關(guān)BAX和BAK基因，并下調(diào)? PI3K、mTOR和 CDK1基因mRNA水平。這表明，BgCCL14可能通過促進凋亡抑制HepG2細胞的活性和增殖。

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Abstract The aim of this study is to study the effect of Bos grunnies C-C motif chemokine 14 protein （BgCCL14） on HepG2 cells and its mechanism.HepG2 cells were co-cultured with prokaryotic expressed BgCCL14 protein.The cell viability was detected by CCK-8 kit， the ability of cell clone formation was detected by plate clone， the cell migration was detected by scratch test ，and the expression of related genes was detected by qPCR.The results showed that BgCCL14 protein of 1? μg/mL，?10? μg/mL and 20? μg/mL significantly decreased the viability of HepG2 cells.And BgCCL14 protein of 20? μg/mL significantly inhibited cell proliferation and migration.In addition， BgCCL14 protein of 20? μg/mL extremely significant up-regulate the mRNA levels of apoptotic genes BAK and BAX in 36 h， and decreased mRNA levels of? ?HIF1A，? ?PI3K， and? CDK1 genes.And the mRNA levels of mTOR also significantly decreased.So BgCCL14 may affect viability of HepG2 cells and promotes its apoptosis.This study will benefit for further study of the function of CCL14.

Key words CCL14; HepG2 cells; Apoptosis