松露多酚的提取純化工藝研究

李美鳳 趙建偉 王曉雅 郭力

摘要：采用正交試驗法優(yōu)化松露多酚的提取工藝，探究提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度4個因素對多酚得率的影響，確定松露多酚的最佳提取工藝，并用大孔吸附樹脂對得到的粗多酚進(jìn)行初步的純化。結(jié)果顯示，最佳提取工藝為乙醇濃度60%、料液比1∶30 （g/mL）、提取溫度70 ℃、提取時間40 min，此時提取率為6.17 mg/g。經(jīng)大孔樹脂純化后，多酚純度由11.13%提高到47.59%。研究結(jié)果表明，松露多酚超聲輔助提取工藝具有提取時間短、工藝簡單、提取率較高的優(yōu)點，為后續(xù)食用菌多酚的提取、分離和純化奠定了試驗基礎(chǔ)和相關(guān)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：松露；多酚；超聲輔助提?。惶崛」に?；純化

中圖分類號：TS201.2? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0131-05

Abstract： Orthogonal test method is used to optimize the extraction process of truffle polyphenols， and the? effects of four factors including extraction temperature， extraction time， solid-liquid ratio and ethanol concentration on the yield of polyphenols are investigated to determine the optimal extraction process of truffle polyphenols. The crude polyphenols are preliminarily purified by macroporous adsorption resin. The results show that the optimal extraction process is ethanol concentration of 60%， solid-liquid ratio of 1∶30 （g/mL）， extraction temperature of 70 ℃， extraction time of 40 min. At this time， the extraction yield is 6.17 mg/g. After purification by macroporous resin， the purity of polyphenols increases from 11.13% to 47.59%. The results show that the ultrasonic-assisted extraction process of truffle polyphenols has the advantages of short extraction time， simple process and high extraction yield， which has laid an experimental basis and relevant data for the subsequent extraction， separation and purification of polyphenols from edible fungi.

Key words： truffle; polyphenols; ultrasound-assisted extraction; extraction process; purification

收稿日期：2022-11-29

基金項目：四川省科技基礎(chǔ)條件平臺項目（2019JDPT0032）

作者簡介：李美鳳（1986－），女，博士，研究方向：藥食兩用資源開發(fā)利用。

*通信作者：王曉雅（1995－），女，碩士，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；

郭力（1964－），男，教授，博士，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

松露（truffle），又名塊菌、豬拱菌、無娘果，隸屬于子囊菌門，是通過感染植物地下根系而形成的一種外生菌根真菌，主產(chǎn)于歐洲各地，在我國主要分布于四川、云南等地[1-4]。松露是一種商品價值較高的藥食同源真菌[5-6]，具有獨特的風(fēng)味和口感，且富含多種氨基酸、蛋白質(zhì)、多酚、維生素、礦物質(zhì)等物質(zhì)[7]。此外，松露含有多種活性物質(zhì)，如松露多糖、多酚、α-雄烷醇等，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等功效[8-9]。課題組前期已完成對松露多糖的提取分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定，并對不同產(chǎn)地松露的營養(yǎng)價值做了全面評價[10-11]，本文主要對松露中多酚的提取、純化工藝進(jìn)行研究。

多酚是一類產(chǎn)生于植物代謝過程中的次生產(chǎn)物[12]。真菌多酚具有多種生物活性，包括抗氧化、抑菌、抗病毒等，已有研究表明，茶薪菇多酚類提取物能減緩自由基對小鼠臟器的損害[13-16]；氧化型茶多酚能改變高脂飲食老年大鼠的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，從而改善其健康狀況[17]。目前對多酚提取方法的研究多采用常規(guī)提取法、超聲提取法[18-19]，本文采用超聲提取法研究松露多酚的最佳提取工藝，由于多酚粗提取含有較多的雜質(zhì)，因此后續(xù)將繼續(xù)對其進(jìn)行分離純化，以獲得純度更高的多酚類物質(zhì)，并評價其生理活性。本文探討了松露多酚的提取工藝及純化方法，為松露多酚的進(jìn)一步研究和在功能性產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了理論研究和相關(guān)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

松露：購于四川會東縣嘎吉村，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)龍飛副教授鑒定為印度塊菌Tuber indicum。

沒食子酸：購于成都瑞芬思生物科技有限公司；NKA-9：購于天津浩聚樹脂科技有限公司；SP-700、D-101、S-8、HPD-100：均購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；福林酚試劑：購于美國Sigma公司；無水碳酸鈉、無水乙醇：均為分析純，購于成都科龍化工試劑廠。

1.2 主要儀器與設(shè)備

101-2AB型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；KM-500DE型超聲波清洗儀 昆山美美超聲儀器有限公司；ZYCGE-Ⅱ-10T超純水機 四川卓越水處理設(shè)備有限公司；HTX-2酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；H1850型臺式高速離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；BP211DAG型分析天平 德國賽多利斯公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原材料的預(yù)處理

將新鮮松露清洗切片，烘干粉碎后過80目藥篩備用。

1.3.2 多酚含量的測定[20]

準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用去離子水溶解并定容至100 mL，即為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 mL于10 mL容量瓶中定容，再分別吸取0.2 mL稀釋后的溶液，加入1.0 mL 10%福林酚溶液，混勻后加入2.8 mL 7.5%飽和碳酸鈉溶液，混勻后室溫放置30 min，在750 nm處測定吸光度值。根據(jù)吸光度值與各溶液的沒食子酸濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性方程為y=0.007 1x+0.005 26，R2 =0.998。按照式（1）計算多酚得率：

W=C·V·Nm。（1）

式中：W為松露多酚得率，mg/g；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得的提取液中多酚濃度，mg/mL；V為提取液的總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為松露干粉的質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗

稱取松露干粉1.00 g，以乙醇水溶液作為提取溶劑超聲提取，單因素試驗設(shè)計分析料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，g/mL）、提取時間（20，30，40，50，60 min）、提取溫度（50，55，60，65，70 ℃）、乙醇濃度（60%乙醇-水、65%乙醇-水、70%乙醇-水、75%乙醇-水、80%乙醇-水）對多酚得率的影響。

1.3.4 正交試驗

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，選取料液比、提取時間、提取溫度、乙醇濃度4個因素作為自變量，每個因素中最佳的3個變量為正交試驗的3個水平，以松露多酚提取率為評價指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平正交試驗，見表1。

1.3.5 松露多酚的分離純化

1.3.5.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

用無水乙醇對D-101、NKA-9、SP-700、HPD-100和S-8樹脂進(jìn)行洗滌，靜置12 h，除去漂浮的雜質(zhì)和樹脂碎片，之后用無水乙醇沖洗至澄清透明，再用蒸餾水將大孔樹脂沖洗至無醇味，再將大孔樹脂分別用5%的鹽酸溶液浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性后，再用5%的NaOH溶液浸泡4 h，用蒸餾水沖洗至中性后直接使用或浸泡在無水乙醇中，儲存?zhèn)溆肹21]。

1.3.5.2 大孔吸附樹脂吸附容量和解吸率的測定

稱取2.0 g活化處理后的D-101、NKA-9、SP-700、HPD-100和S-8大孔樹脂，置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL已知濃度的松露多酚粗提液，置于25 ℃、150 r/min的恒速振動器上振蕩8 h以達(dá)到吸附平衡狀態(tài)。吸附完成，倒出上層樣品液，用去離子水將吸附多酚后的樹脂洗滌2～3次，加入60%乙醇洗脫液100 mL，在25 ℃、150 r/min條件下振蕩4 h，解吸被吸附的多酚。

采用福林-酚法分別測定吸附處理后的粗提液以及60%乙醇洗脫液中總多酚的含量。采用上述靜態(tài)吸附試驗方法分別考察大孔樹脂的吸附容量和解吸率，比較兩種指標(biāo)的測定結(jié)果，選擇吸附容量大、解吸率高的大孔樹脂用于后續(xù)多酚的分離純化。根據(jù)式（2）、式（3）、式（4）分別計算大孔樹脂的吸附容量、吸附率、解吸率：

吸附容量=C0－C1。（2）

吸附率=C0－C1/C0×100%。（3）

解吸率=解吸液中多酚含量吸附容量。（4）

式中：C0為吸附前原液多酚含量，μg/mL；C1為吸附后原液多酚含量，μg/mL。

1.3.5.3 松露多酚的純化

采用SP-700大孔樹脂濕法裝柱，將松露多酚粗提液過柱進(jìn)行分離純化。按照純水、20%乙醇-水、40%乙醇-水、60%乙醇-水、80%乙醇-水梯度洗脫，流速為2 mL/min，直至餾分不含松露多酚為止。根據(jù)式（5）計算松露多酚純度：

純度=純化后的多酚含量粗提液干燥后的多酚含量×100%。（5）

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過GraphPad Prism 8.0軟件繪圖，差異分析中，“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對多酚提取率的影響

不同料液比對多酚提取率的影響結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著料液比的增加，提取液中多酚的含量明顯增加，當(dāng)料液比為1∶25時，松露多酚的提取率最高，為4.47 mg/g，但當(dāng)料液比超過1∶25時，提取液中多酚的含量開始降低。原因可能是溶劑量較低時，樣品和溶劑的接觸不充分，導(dǎo)致提取不完全，適當(dāng)?shù)卦黾尤軇┝坑欣谔崛〉倪M(jìn)行[22-23]。當(dāng)溶劑量過高時，松露中其他醇溶性雜質(zhì)的溶出會增加，從而降低了提取液中多酚的含量。因此，選擇1∶25、1∶30、1∶35 （g/mL）進(jìn)行正交試驗以確定最佳的料液比。

2.1.2 提取時間對多酚提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)提取時間從20 min增加到50 min時，溶液中多酚的含量明顯增加，但提取時間超過50 min時，提取液中多酚的含量明顯下降，原因可能是提取時間過長，提取液中的多酚可能會被氧化，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇30，40，50 min進(jìn)行正交試驗以確定最佳的提取時間。

2.1.3 提取溫度對多酚提取率的影響

由圖3可知，提取溫度由50 ℃上升至60 ℃時，多酚含量明顯上升，并在60 ℃時提取率最大，為4.53 mg/g。當(dāng)溫度超過60 ℃后，松露多酚的提取率逐漸緩慢下降，但提取率明顯高于55 ℃和50 ℃時的提取率?？赡苁窃谳^低溫度下，多酚溶出速率較慢，適當(dāng)提高溫度增加了多酚的溶出速率；而當(dāng)溫度增加到60 ℃以上時，可能由于較高的溫度使多酚發(fā)生氧化或分解，因而多酚得率降低。因此，選擇60，65，70 ℃進(jìn)行正交試驗以確定最佳的提取溫度。

2.1.4 乙醇濃度對多酚提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)提取劑中乙醇濃度從60%增加到65%時，提取液中多酚含量明顯增加，達(dá)到最高，為5.28 mg/g。當(dāng)提取劑中乙醇濃度繼續(xù)增加后，提取液中多酚含量開始逐漸下降。出現(xiàn)這種情況可能是因為適當(dāng)增加乙醇濃度會促進(jìn)多酚物質(zhì)的溶出，但當(dāng)乙醇濃度過高時對多酚物質(zhì)的溶出會產(chǎn)生不利的影響。因此，選擇60%、65%、70%進(jìn)行正交試驗以確定提取劑中乙醇的最佳濃度。

2.2 正交試驗結(jié)果

對料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）和乙醇濃度（D）進(jìn)行正交試驗分析。由表2可知，4個因素對提取液多酚含量影響的主次順序為提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度＞料液比。最佳提取條件是A2B2C3D1，即料液比為1∶30（g/mL），提取時間為40 min，提取溫度為70 ℃，乙醇濃度為60%，此時多酚提取率為6.17 mg/g，與郭坦等[24]通過乙醇回流提取得到的粗多酚提取率7.5%相近。

2.3 大孔樹脂篩選結(jié)果

由表4可知，進(jìn)行篩選的5種大孔樹脂中D-101與S-8的解吸率雖然很高，但是吸附容量卻只有另外3種樹脂的1/3左右，根據(jù)文獻(xiàn)報道得知[25]，為了使粗提液的純化具有較好的效果，選擇的樹脂應(yīng)當(dāng)具有較大的吸附容量和較高的解吸率，因此選擇SP-700進(jìn)行后續(xù)的多酚純化試驗。

2.4 大孔樹脂純化結(jié)果

由圖5可知，測定吸光度值時，確定其多酚含量為38.23 mg，經(jīng)干燥后得到的總質(zhì)量為80.33 mg，純化后多酚的純度為47.59%，純度提高了4.27倍。

3 結(jié)論

本研究對超聲提取松露多酚的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最佳提取工藝為料液比1∶30 （g/mL）、提取時間40 min、提取溫度70 ℃、乙醇濃度為60%，在最佳提取條件下，松露多酚得率最大，為6.17 mg/g。同時對5種大孔吸附樹脂的吸附率和解吸率進(jìn)行比較，最終選擇SP-700對提取的粗多酚進(jìn)行純化，經(jīng)過SP-700大孔樹脂的處理，多酚純度由11.13%提升到了47.59%。本文得到的超聲輔助提取松露多酚的工藝具有提取時間短、工藝簡單、提取率較高的優(yōu)點，為后續(xù)松露多酚的提取、分離及純化奠定了理論基礎(chǔ)，為松露多酚進(jìn)一步的開發(fā)利用提供了相應(yīng)的試驗依據(jù)。

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