基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初探金芪降糖片治療肥胖的作用機(jī)制

王瑾源 原茵 董夢(mèng)雪 譚雅文 呂萌 王洪武 鄭紡

〔摘要〕 目的 觀察金芪降糖片對(duì)C57BL/6肥胖模型小鼠的治療效果，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)金芪降糖片治療肥胖的相關(guān)機(jī)制。方法 選取30只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，分為正常組、模型組、金芪降糖片組。正常組飼喂正常飼料，模型組及金芪降糖片組飼喂高脂飼料，模型復(fù)制成功后給予藥物干預(yù)。檢測(cè)C57BL/6小鼠體質(zhì)量、血脂水平、體內(nèi)脂肪含量及肝臟、脂肪組織形態(tài)。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)與GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選金芪降糖片治療肥胖的活性成分及交集靶點(diǎn)；將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析靶點(diǎn)間的相互作用；通過(guò)Biocondoctor數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果，運(yùn)用Western blot驗(yàn)證關(guān)鍵信號(hào)通路的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與空白組相比，模型組小鼠體質(zhì)量及血清甘油三酯（triglyceride， TG）、總膽固醇（total cholesterol， TC）、低密度脂蛋白膽固醇（lipoprotein cholesterol， LDL-C）含量均升高（P<0.05），高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol， HDL-C）含量降低（P<0.05），肝臟組織中脂滴蓄積明顯增多，脂肪細(xì)胞數(shù)目增多、體積增大；與模型組相比，金芪降糖片組小鼠體質(zhì)量及血清TG、TC、LDL-C含量均降低（P<0.05），HDL-C含量升高（P<0.05），肝臟組織中脂滴蓄積情況改善，脂肪細(xì)胞數(shù)目減少、體積縮??；Micro-CT結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠體內(nèi)白色脂肪及棕色脂肪含量均明顯升高（P<0.01），而金芪降糖片可減少兩類脂肪含量（P<0.01）。同時(shí)，金芪降糖片也可改善肥胖小鼠肝臟與脂肪組織變性。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)得到金芪降糖片治療肥胖的55個(gè)共同靶點(diǎn)及其79條富集通路。KEGG富集分析得到金芪降糖片治療肥胖的作用機(jī)制可能與流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PPARγ信號(hào)通路等密切相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠脂肪組織中PPARγ信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白明顯上調(diào)；與模型組相比，金芪降糖片組小鼠脂肪組織中PPARγ信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白明顯下調(diào)。結(jié)論 金芪降糖片可有效減輕肥胖小鼠體重、改善血脂異常、降低體內(nèi)脂肪含量、改善肝臟組織中脂滴蓄積及脂肪組織中脂肪細(xì)胞數(shù)量及大小，其可能通過(guò)PPARγ信號(hào)通路治療肥胖。

〔關(guān)鍵詞〕 金芪降糖片；肥胖；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；PPARγ信號(hào)通路；實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.017

Mechanisms of Jinqi Jiangtang Tablet in treating obesity based on network pharmacology

WANG Jinyuan1， YUAN Yin1， DONG Mengxue1， TAN Yawen1， LV Meng2， WANG Hongwu3， ZHENG Fang1*

1. Integrated Chinese and Western Medicine College， Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 301617， China;

2. Shunrong Pharmaceutical Factory， Da Rentang Group Co.， LTD. Tianjin 300457， China; 3. Chinese Medicine College，

Tianjin University of Chinese Medicine， Tianjin 301617， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the therapeutic effects of Jinqi Jiangtang Tablet on C57BL/6 obese mice， and predict the related mechanism of Jinqi Jiangtang Tablet in treating obesity based on network pharmacology. Methods The total of 30 SPF male C57BL/6 mice were selected and divided into normal group， model group and Jinqi Jiangtang Tablet group. Normal group was fed normal diet， model group and Jinqi Jiangtang Tablet group were fed high-fat diet， and drug intervention was given after successful model replication. Body weight， lipid level， fat content， liver and adipose tissue morphology of C57BL/6 mice were determined. The active ingredients and intersection targets of Jinqi Jiangtang Tablet in treating obesity were screened by TCMSP and GeneCards databases. The intersection targets were imported into STRING database to analyze the interaction between targets. GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed with Biocondoctor database. The protein expression of key signaling pathways was verified with Western blot based on the prediction results of network pharmacology. Results Compared with control group， the body weight and serum content of triglyceride （TG）， total cholesterol （TC） and low density lipoprotein cholesterol （LDL-C） in model group were higher （P<0.05） while high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） content was lower （P<0.05）. The lipid droplet accumulation in liver tissue increased significantly， and the number and volume of adipose cells increased. Compared with model group， the body weight and serum content of TG， TC and LDL-C in Jinqi Jiangtang Tablet group were lower （P<0.05）， while HDL-C content was higher （P<0.05）. The accumulation of lipid droplets in liver tissue was improved， and the number and volume of adipose cells decreased. Micro-CT showed that compared with control group， the content of white fat and brown fat in model group were significantly higher （P<0.01）， while Jinqi Jiangtang Tablet could reduce the content of two kinds of fat （P<0.01）. Meanwhile， Jinqi Jiangtang Tablet could improve liver and adipose tissue degeneration in obese mice. The total of 55 common targets and 79 enrichment pathways of Jinqi Jiangtang Tablet for obesity were predicted by network pharmacology. KEGG enrichment analysis showed that the mechanism of action of Jinqi Jiangtang Tablet in the treatment of obesity may be closely related to fluid shear stress and AGE-RAGE signaling pathway， TNF signaling pathway and PPARγ signaling pathway in arteriosclerosis and diabetes complications. Western blot showed that compared with control group， the key proteins of PPARγ signaling pathway in adipose tissue of mice in model group were significantly up-regulated. Compared with model group， the key proteins of PPARγ signaling pathway in adipose tissue of mice in Jinqi Jiangtang Tablet group were significantly down-regulated. Conclusion Jinqi Jiangtang Tablet can effectively reduce the weight of obese mice， improve dyslipidemia， decrease the body fat content， and improve the accumulation of fat drops in liver tissue and the number and size of fat cells in adipose tissue. It may take effects in treating obesity through PPARγ signaling pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Jinqi Jiangtang Tablet; obesity; network pharmacology; PPARγ signaling pathway; experimental verification

肥胖是影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題，根據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)肥胖的發(fā)病率逐年上升，到2030年全球肥胖人數(shù)預(yù)計(jì)將達(dá)到11.2億[1]，已被世界衛(wèi)生組織列為影響人類健康的第五大危險(xiǎn)因素。肥胖是一種以體內(nèi)脂肪細(xì)胞數(shù)目和體積過(guò)度增加，導(dǎo)致體脂率異常增高并伴有局部脂肪組織沉積為特點(diǎn)的慢性代謝性疾病，也是糖尿病、冠心病、高脂血癥等多種疾病的共同危險(xiǎn)因素[2-4]。因此，肥胖及其引起的一系列疾病逐漸引起了廣泛重視。

目前，西醫(yī)治療肥胖的主要方法為減少食物攝入、增加能量消耗、藥物干預(yù)或手術(shù)等，其毒副作用難以避免[5]。中醫(yī)理論認(rèn)為水濕、痰濁是肥胖的重要病機(jī)，因而，多采用祛痰化濁、利水滲濕法治療。中藥復(fù)方金芪降糖片是依據(jù)《備急千金要方》中的復(fù)方黃連丸，結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研發(fā)的中成藥，由黃芪、黃連、金銀花組成，具有清熱益氣、祛痰化濁、利水滲濕之功效，多用以治療2型糖尿病合并血脂異常[6]，但其治療肥胖的效果及作用機(jī)制尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)擬在明確金芪降糖片治療肥胖的藥效學(xué)作用基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其治療肥胖的作用機(jī)制進(jìn)行分析，為金芪降糖片治療肥胖的臨床應(yīng)用及今后的藥物研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 ?實(shí)驗(yàn)藥物

金芪降糖片由黃芪、黃連、金銀花3味中藥組成，藥物由津藥達(dá)仁堂集團(tuán)股份有限公司隆順榕制藥廠提供，國(guó)藥準(zhǔn)字Z10920027。

1.2 ?動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，4～5周齡，體質(zhì)量（20.1±1.2） g。小鼠購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持室溫（22±3） ℃，相對(duì)濕度45%～55%，12 h光照（07：00～19：00）。實(shí)驗(yàn)經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，審批號(hào)：TCM-LAEC2021269。

1.3 ?主要試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transferase， ALT）（批號(hào)：C010-1-1）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase， AST）（批號(hào)：C009-1-1）、甘油三酯（triglyceride， TG）（批號(hào)：A110-1-1）、總膽固醇（total cholesterol， TC）（批號(hào)：A111-1-1）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A112-1-1）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipo？鄄

protein cholesterol， LDL-C）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A113-1-1）、尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：C013-2），均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；二甲苯、無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇均購(gòu)買于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；切片石蠟（熔點(diǎn)48～50 ℃）（批號(hào)：YA0010）、切片石蠟（熔點(diǎn)60～62 ℃）（批號(hào)：YA0014）、中性樹(shù)膠（批號(hào)：G8950）、高效RIPA裂解液（批號(hào)：R0010）均購(gòu)買于北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE上樣緩沖液（還原，5×）（批號(hào)：CW0027S）購(gòu)買于康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。PPARγ（C26H12） Rabbit mAb（批號(hào)：#2435）、C/EBPα（D56F10） XP■ Rabbit mAb（批號(hào)：#8178）均購(gòu)買于美國(guó)SCT公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（批號(hào)：A0208）購(gòu)買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 ?主要儀器

Latheta LCT-200型Micro-CT（日立ALOKA公司）；HistoCore Arcadia H型石蠟包埋機(jī)（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；RM2235型手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BH-2型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；H1210型攤片（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；LT-DBX-220F型精密可編程熱風(fēng)循環(huán)烘箱（立德泰勀科學(xué)儀器有限公司）；1658033蛋白電泳系統(tǒng)垂直電泳儀、1645050基礎(chǔ)電泳儀（美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)）。

1.5 ?數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

所用數(shù)據(jù)庫(kù)包括：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）：http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，GeneCards：https：//www.genecards.org、韋恩Venny 2.1.0：http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/、String蛋白質(zhì)相互作用分析平臺(tái)：https：//string-db.org、DAVID 6.8 GO功能和KEGG通路富集分析平臺(tái)：https：//david.ncifcrf.gov；所用軟件包括：Cytoscape 3.7.1、R×64 3.6.3、PERL。

1.6 ?方法

1.6.1 ?動(dòng)物分組及藥物干預(yù) ?C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常組、模型組、金芪降糖片組，每組10只。金芪降糖片給藥劑量按照人體表面積換算法計(jì)算，70 kg成年人一日用藥劑量為11.76～16.80 g，小鼠等效藥物劑量為人體的9.1倍，則小鼠每日灌胃劑量為1.53～2.16 g/kg。稱取20 g金芪降糖片藥粉溶于40 mL蒸餾水中，得到濃度為0.5 g/mL的金芪降糖片藥液。正常組小鼠每日給予正常飼料喂養(yǎng)，模型組及金芪降糖片組給予高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制肥胖模型[7]，每周稱量小鼠體重，12周造模期滿后，以模型組小鼠體重高于正常組小鼠體重20%作為肥胖模型復(fù)制成功的標(biāo)志。肥胖模型復(fù)制成功后金芪降糖片組每日給予金芪降糖片藥液0.2 mL灌胃，正常組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)12周。

1.6.2 ?肝腎功能、體質(zhì)量、血脂水平檢測(cè) ?每周記錄一次體質(zhì)量。取材前小鼠禁食12 h，稱重，麻醉后目?jī)?nèi)眥取血，全血靜置30 min，3000×g離心15 min，分離上層血清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、BUN水平。

1.6.3 ?Micro-CT檢測(cè)小鼠體內(nèi)脂肪重量 ?Micro-CT可根據(jù)CT值判斷組織的性質(zhì)，結(jié)合軟件的處理算法可準(zhǔn)確計(jì)算出脂肪參數(shù)，為肥胖的診斷提供準(zhǔn)確依據(jù)[8]。將小鼠麻醉后置于Micro-CT體模中，掃描檢測(cè)小鼠肌肉量、白色脂肪及棕色脂肪總量、皮下脂肪總量、內(nèi)臟脂肪總量、脂肪率。

1.6.4 ?HE染色觀察小鼠肝臟和脂肪組織形態(tài) ?取小鼠肝臟和脂肪組織，用4%多聚甲醛溶液固定48 h以上，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切片，厚度為5 μm，將石蠟切片置于65 ℃電熱干燥箱中烘烤30 min以上，常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片，晾干后顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟和脂肪組織病理學(xué)特征。

1.6.5 ?金芪降糖片活性成分及靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)的收集 ?將黃芪、黃連、金銀花分別輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，類藥性（drug likeness， DL）≥0.18作為指標(biāo)，篩選金芪降糖片的活性成分，建立活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）中檢索“obesity”關(guān)鍵詞，獲得肥胖的疾病靶點(diǎn)。

1.6.6 ?中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖的建立 ? 利用R3.5.3軟件（https：//www.r-project.org）篩選金芪降糖片和肥胖的交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，獲得“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6.7 ?蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 ?將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入功能蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫(kù)（String，https：//string-db.org），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中出現(xiàn)的斷開(kāi)節(jié)點(diǎn)，將最低互作分?jǐn)?shù)設(shè)為0.4，獲得靶點(diǎn)間的互作關(guān)系，構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白可視化互作網(wǎng)絡(luò)并導(dǎo)出。

1.6.8 ?GO富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析 ?使用Biocondoctor數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.bioconductor.org/）及R軟件將篩選出的核心靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)化為基因ID，進(jìn)一步行GO富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析，獲得相關(guān)生物學(xué)過(guò)程及通路，利用R軟件繪制條形圖。

1.6.9 ?Western blot檢測(cè)小鼠脂肪組織中關(guān)鍵信號(hào)通路的蛋白表達(dá) ?取小鼠附睪白色脂肪組織50 mg，加入200 μL蛋白裂解液（由99%RIPA和1% PMSF配成）裂解，超聲研磨1 min后，將組織置于冰上裂解15 min，12 000×g離心15 min；取上清液，BCA定量，加入loading bufffer于95 ℃水浴鍋中變性10 min后，置于4 ℃冰箱備用，用于后續(xù)電泳。電泳條件：80 V 30 min，待蛋白跑出濃縮膠后將電壓調(diào)至120 V直到電泳結(jié)束；轉(zhuǎn)膜條件：250 mA 60 min。

1.7 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用作圖法表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，圖中數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，運(yùn)用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠的藥效學(xué)作用

2.1.1 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠肝腎功能的影響 ?與正常組相比，模型組及金芪降糖片組C57BL/6小鼠血清AST、ALT、BUN水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果提示，金芪降糖片對(duì)小鼠無(wú)肝腎毒性。詳見(jiàn)圖1。

2.1.2 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠體質(zhì)量的影響 ?藥物干預(yù)第12周，與正常組比較，模型組C57BL/6小鼠體質(zhì)量明顯上升（P<0.01）；與模型組比較，金芪降糖片組小鼠體質(zhì)量明顯降低（P<0.01）。詳見(jiàn)圖2。

2.1.3 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠血脂水平的影響 ?與正常組相比，模型組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高（P<0.05），HDL-C水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，金芪降糖片組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著降低（P<0.05），HDL-C水平顯著提高（P<0.05）。詳見(jiàn)圖3。

2.1.4 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠體內(nèi)脂肪重量的影響

藥物干預(yù)第12周，使用Micro-CT掃描小鼠腹部及肩胛部，掃描圖詳見(jiàn)圖4—5，圖中顯示紅色為內(nèi)臟脂肪，黃色為皮下脂肪。與正常組相比，模型組小鼠腹部總白色脂肪量、內(nèi)臟白色脂肪量、皮下白色脂肪量、白色脂肪率以及肩胛部總棕色脂肪量、內(nèi)臟棕色脂肪量、皮下棕色脂肪量、棕色脂肪率均顯著上調(diào)（P<0.05，P<0.01）；與模型組相比，金芪降糖片組小鼠腹部總白色脂肪量、內(nèi)臟白色脂肪量、皮下白色脂肪量、白色脂肪率以及肩胛部總棕色脂肪量、內(nèi)臟棕色脂肪量、皮下棕色脂肪量、棕色脂肪率顯著下調(diào)（P<0.01），提示金芪降糖片能夠減少小鼠體內(nèi)白色及棕色脂肪累積，降低小鼠體內(nèi)白色及棕色脂肪率，詳見(jiàn)圖6—7。

2.1.5 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠體內(nèi)脂肪形態(tài)的影響

與正常組比較，模型組小鼠白色脂肪細(xì)胞體積變大；與模型組比較，金芪降糖片組小鼠的白色脂肪細(xì)胞體積變小。結(jié)果顯示，金芪降糖片可改善肥胖小鼠白色脂肪組織形態(tài)異常。詳見(jiàn)圖8。

2.1.6 ?金芪降糖片對(duì)肥胖小鼠肝臟組織形態(tài)的影響 ? 正常組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)大小正常，無(wú)變性壞死，肝細(xì)胞內(nèi)未出現(xiàn)脂滴。與正常組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了大小、數(shù)量不等的脂滴空泡。與模型組相比，金芪降糖片組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴小空泡體積及數(shù)量均明顯減少，詳見(jiàn)圖9。

2.2 ?金芪降糖片-肥胖的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 ?金芪降糖片活性成分、靶點(diǎn)及藥物靶點(diǎn)分析

通過(guò)TCMSP共收集到金芪降糖片中黃芪、黃連、金銀花3味藥物的58個(gè)有效活性成分。通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）檢索關(guān)鍵詞“Obesity”，得到肥胖相關(guān)靶點(diǎn)1228個(gè)。詳見(jiàn)表1。

2.2.2 ?金芪降糖片治療肥胖的靶點(diǎn) ?利用PERL腳本將TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到的121個(gè)靶基因，與GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘到的1228個(gè)肥胖的靶基因進(jìn)行篩選去重，獲得55個(gè)交集靶點(diǎn)，使用R 3.6.3軟件繪制韋恩圖（見(jiàn)圖10）。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape

3.7.1軟件中，獲得中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)圖11）。

2.2.3 ?金芪降糖片和肥胖的共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 ?對(duì)金芪降糖片和肥胖的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，該網(wǎng)絡(luò)由55個(gè)節(jié)點(diǎn)和392條邊組成。詳見(jiàn)圖12。

2.2.4 ?GO富集分析與KEGG信號(hào)通路富集分析 ?GO富集分析包括生物過(guò)程（biological process， BP）、分子功能（molecular， MF）及細(xì)胞組件（cellular component， CC），設(shè)定閾值為P<0.05。潛在靶點(diǎn)顯著富集在膜筏、細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜區(qū)、突觸下膜、轉(zhuǎn)錄復(fù)合體等位置；交集靶點(diǎn)與類固醇激素調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、氧水平的調(diào)節(jié)等生物過(guò)程相關(guān)。BP 880個(gè)，CC 52個(gè)，MF 62個(gè)，將其每個(gè)結(jié)果前10的條目可視化為條形圖。詳見(jiàn)圖13。

依據(jù)P值統(tǒng)計(jì)核心條目，預(yù)測(cè)分析金芪降糖片對(duì)肥胖可能產(chǎn)生作用的相關(guān)通路為79條，將其中富集相關(guān)性位列前20的通路可視化為條形圖，KEGG富集分析預(yù)測(cè)到金芪降糖片治療肥胖與流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PPARγ信號(hào)通路等密切相關(guān)。詳見(jiàn)圖14。

2.2.5 ?金芪降糖片對(duì)PPARγ信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白的影響 ?與正常組比較，模型組小鼠附睪白色脂肪中PPARγ表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），C/EBPα明顯上調(diào)（P<0.05）；與模型組比較，金芪降糖片組小鼠的附睪白色脂肪中PPARγ、C/EBPα表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.01）。詳見(jiàn)圖15。

3 討論

中醫(yī)文獻(xiàn)對(duì)肥胖的記載始于《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》將肥胖人群分為“脂人”“膏人”“肉人”3類。李東垣的《脾胃論》中載“脾胃俱旺，能食而肥”[9]，指出了患者最初常常由于食欲旺盛、飲食攝入過(guò)多而引起肥胖[10]。清代《石室秘錄》中載“肥人多痰，乃氣虛也，虛則氣不運(yùn)行，故痰生之”[11]，提出“氣虛、水濕、痰濁”是肥胖的重要病機(jī)。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為肥胖的發(fā)生多與飲食不節(jié)、情志失調(diào)、勞逸失度有關(guān)，而肥胖易產(chǎn)生水濕、痰濁、食積、氣滯等病理因素，進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)膏脂聚集，郁久則可化熱[12]。因而，中醫(yī)根據(jù)肥胖的不同證型進(jìn)行辨證論治，多采用清熱益氣健脾、祛痰化濁、利水滲濕法予以治療[13]。

中藥復(fù)方金芪降糖片組成為黃芪、黃連和金銀花。金銀花，性寒，味甘、苦，能清熱解毒；黃芪有補(bǔ)氣健脾、恢復(fù)脾運(yùn)的功效，脾主運(yùn)化，脾氣健運(yùn)才能升清降濁，黃芪性溫，溫能散郁，郁消則氣機(jī)條達(dá)，則氣血精液及水谷精微才能正常代謝；黃連，性寒，味苦，有燥濕瀉熱之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，黃連有調(diào)節(jié)肥胖引起的全身慢性炎癥反應(yīng)的作用，有防治肥胖和延緩糖尿病并發(fā)癥的積極療效[14]；《藥性賦》中記載黃芪“味甘，氣溫，無(wú)毒。升也，陽(yáng)也”，三藥合用具有清熱益氣健脾、燥濕化濁之功效。有研究證明，金芪降糖片對(duì)2型糖尿病脂代謝紊亂大鼠體內(nèi)的差異代謝物有一定的回調(diào)作用[15]。但是，目前關(guān)于該方的臨床應(yīng)用多集中在治療輕、中度2型糖尿病及改善胰島素抵抗等方面[16]，缺少對(duì)于肥胖治療的相關(guān)實(shí)驗(yàn)或者臨床研究證據(jù)。

本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金芪降糖片能顯著降低肥胖小鼠的體質(zhì)量及TG、TC、LDL-C水平，提高小鼠HDL-C水平，顯著減少肥胖小鼠體內(nèi)白色脂肪及棕色脂肪率，且能顯著減少肥胖小鼠肝臟組織中脂滴蓄積、脂肪細(xì)胞的數(shù)量及大小。綜合以上結(jié)果，說(shuō)明金芪降糖片有治療肥胖的作用。

本研究進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了金芪降糖片治療肥胖的潛在機(jī)制，共獲得了金芪降糖片和肥胖的55個(gè)共同靶點(diǎn)及其79條富集通路。本研究中預(yù)測(cè)的途徑大致可分為3種：（1）調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝；（2）參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；（3）減輕脂肪組織炎癥。脂質(zhì)代謝是指體內(nèi)脂質(zhì)在相關(guān)酶的幫助下，進(jìn)行消化吸收、合成與分解的過(guò)程，加工成為機(jī)體所需要的物質(zhì)，對(duì)于生命活動(dòng)具有重要意義[17]。

金芪降糖片中直接參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的靶點(diǎn)蛋白有CAV-1、PPARγ等。研究表明，CAV-1是一種脂滴蛋白，參與脂質(zhì)代謝過(guò)程，協(xié)助細(xì)胞吸收和聚集游離脂肪酸，調(diào)控TG的合成，對(duì)于維持細(xì)胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)起著重要調(diào)節(jié)作用[18]。PPARγ在脂肪組織中高表達(dá)，是脂肪生成必不可少的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在PPARγ信號(hào)通路中，PPARγ與PPAR反應(yīng)元件（PPAR responsive element）結(jié)合后可增強(qiáng)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、脂肪酸結(jié)合蛋白、脂蛋白脂肪酶等脂肪酸合成基因的表達(dá)，并能抑制過(guò)氧化物酶體脂肪酸氧化酶系，脂酰CoA去飽和酶，腎上腺素能受體、瘦素等促脂解基因表達(dá)，分別調(diào)控脂肪的合成和分解。PPARγ通過(guò)調(diào)節(jié)影響脂質(zhì)累積的眾多基因的表達(dá)，影響脂肪生成[19]。PPARγ的缺失或突變，可引起肥胖、胰島素抵抗、血脂異常、代謝綜合征等疾病的發(fā)生[20-21]。在脂肪生成過(guò)程中，PPARγ除了在維持脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮至關(guān)重要的作用外，還與C/EBPα發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)作用。研究表明，在成纖維細(xì)胞中，PPARγ對(duì)C/EBPα誘導(dǎo)的脂肪生成是不可或缺的；而當(dāng)C/EBPα基因敲除后，PPARγ誘導(dǎo)的脂肪生成嚴(yán)重缺失。PPARγ能直接激活內(nèi)源性C/EBPα基因轉(zhuǎn)錄；而C/EBPα激活后又可與PPARγ結(jié)合，誘導(dǎo)并維持PPARγ在成熟脂肪細(xì)胞中的表達(dá)[22]。此外，金芪降糖片靶點(diǎn)中的細(xì)胞色素P450氧化還原酶（CYP3A4亞型），主要分布在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，作為一種末端加氧酶，參與了生物體內(nèi)的膽固醇合成等過(guò)程，并可將膽固醇代謝轉(zhuǎn)化為膽汁酸和類固醇激素等[23-24]。

本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了金芪降糖片治療肥胖的藥效學(xué)作用，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了金芪降糖片治療肥胖的作用機(jī)制，分析出PPARγ信號(hào)通路可能是金芪降糖片治療肥胖的潛在靶點(diǎn)通路，并對(duì)于小鼠附睪白色脂肪組織中PPARγ信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本研究團(tuán)隊(duì)將提取小鼠體內(nèi)附睪白色脂肪組織對(duì)肥胖相關(guān)的脂肪酸合成相關(guān)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為金芪降糖片的臨床應(yīng)用提供更好的理論支撐。

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〔收稿日期〕2022-11-02

〔基金項(xiàng)目〕天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2021ZD010）；天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（ZXYCXLX202019）。

〔第一作者〕王瑾源，女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治骨、脂代謝疾病的研究。

〔通信作者〕*鄭 ?紡，女，博士，教授，E-mail：zhengfang_1979@163.com。