白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯對糖尿病心肌病MKR小鼠心肌細胞焦亡的影響

史留陽 譚丹妮 劉秀 向琴 譚艷 喻嶸

〔摘要〕 目的 探究白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯對糖尿病心肌病模型MKR小鼠心肌細胞焦亡相關(guān)蛋白表達的影響。方法 造模成功后將MKR小鼠隨機分成模型組，中藥低、中、高劑量組，二甲雙胍組，同時設FVB鼠為正常組。給藥4周后觀察小鼠糖脂代謝變化；超聲成像平臺檢測小鼠心功能；HE染色及MASSON染色觀察心肌組織形態(tài)；ELISA法測定血清中白細胞介素-18（interleukin-18， IL-18）、白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）水平；Western blot法檢測小鼠心肌組織NOD樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptors 3， NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD， ASC）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1， Caspase-1）蛋白水平。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG）顯著升高（P<0.01），血清總膽固醇（serum total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）水平升高（P<0.05），高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol， HDL-C）水平降低（P<0.05），左室射血分數(shù)（rejection fraction， EF）、左室短軸縮短率（fractional shortening， FS）數(shù)值明顯降低（P<0.01）；細胞肥大變形，心肌纖維排列紊亂，紋理不齊，血清IL-1β、IL-18、TNF-α含量升高（P<0.01），心肌組織IL-1β、IL-18、TNF-α蛋白表達水平提升（P<0.01），心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均顯著增高（P<0.01）。與模型組比較，各用藥組小鼠FBG、TC、TG、LDL水平降低（P<0.05），HDL-C水平升高（P<0.05）， EF、FS值均有升高（P<0.05），小鼠心肌組織病理學損傷明顯改善，血清IL-1β、IL-18、TNF-α含量降低（P<0.05），NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均明顯降低（P<0.05），其中中藥高劑量組作用最為明顯。結(jié)論 白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯對心肌有保護作用，其機制可能與抑制NLRP3炎癥小體過度激活，減少心肌細胞焦亡，降低炎癥反應有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病心肌??；白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯；NOD樣受體蛋白3炎性小體；炎癥；細胞焦亡

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.003

Effects of Baihu Renshen Decoction combined with Zhishi Xiebai Guizhi Decoction on

myocardial pyroptosis in MKR diabetic cardiomyopathy mice

SHI Liuyang， TAN Danni， LIU Xiu， XIANG Qin， TAN Yan， YU Rong*

Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Baihu Renshen Decoction combined with Zhishi Xiebai Guizhi Decoction on the expression of pyroptosis-related protein in myocardial cells of MKR diabetic cardiomyopathy model mice. Methods After successful modeling， MKR mice were randomly divided into model group， low-， medium- and high- dose of Chinese medicine group， and metformin group. FVB mice were set as normal group. After 4 weeks of administration， the changes of glucose and lipid metabolism in mice were observed; the cardiac function of mice was checked by ultrasound imaging platform; the myocardial histomorphology was observed by HE staining and MASSON staining; the serum levels of interleukin-18 （IL-18）， interleukin-1β （IL-1β）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were measured by ELISA; the nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor 3 （NLRP3）， apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD （ASC）， and cysteinyl aspartate specific proteinase-1 （Caspase-1） protein levels in mouse myocardial tissue were measured by Western blot. Results Compared with the normal group， fasting blood glucose （FBG） was significantly higher （P<0.01）， serum total cholesterol （TC）， triglyceride （TG） and low density lipoprotein （LDL） levels increased （P<0.05），while high density lipoprotein cholesterol （HDL-C） levels decreased （P<0.05）， left ventricular ejection fraction （EF） and left ventricular fractional shortening （FS） values were significantly reduceed （P<0.01） in the model group; cell hypertrophy and deformation， myocardial fibers were disorganized， texture was irregular， serum IL-1β， IL-18 and TNF-α content increased， IL-1β， IL-18 and TNF-α protein expression levels in myocardial tissue increased， and NLRP3， ASC and Caspase-1 protein expression in myocardial tissue were significantly elevated （P<0.01）. Compared with the model group， in each treatment group， FBG， TC， TG and LDL levels decreased （P<0.05）， HDL-C level was higher （P<0.05）， EF and FS values increased （P<0.05）， myocardial histopathological damage was significantly alleviated， serum IL-1β， IL-18 and TNF-α content decreased （P<0.05）， and NLRP3， ASC and caspase-1 protein expressions significantly decreased （P<0.05）， with the most significant effect in the high dose group of Chinese medicine. Conclusion Baihu Renshen Decoction combined with Zhishi Xiebai Guizhi Decoction has protective effects on myocardium， and the mechanism may be related to the inhibition of NLRP3 inflammasome overactivation， the reduction of myocardial cell pyroptosis， and the reduction of inflammatory response.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 diabetic cardiomyopathy; Baihu Renshen Decoction combined with Zhishi Xiebai Guizhi; NOD-like receptor protein 3 inflammasome; inflammation; pyroptosis

近年來，隨著人民生活水平的提高及生活習慣改變，糖尿病及其并發(fā)癥在我國發(fā)病率逐年升高[1]。糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy， DCM）是最常見的糖尿病并發(fā)癥之一，可導致心律失常、心力衰竭，甚至引發(fā)猝死，是DM患者心力衰竭發(fā)生率和死亡率較高的主要原因[2]。DCM發(fā)病機制復雜，當前研究認為高血糖、胰島素抵抗、高甘油三酯等因素可導致氧化應激和炎癥反應的發(fā)生，引起心肌細胞壞死、凋亡、纖維化等改變，最終引起心肌結(jié)構(gòu)、功能改變[3]。炎癥反應在在DCM的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[4]，焦亡被稱為細胞炎性壞死，是一種炎癥性較高的細胞程序性死亡[5]，具有細胞凋亡與壞死的共同獨特特征。NOD樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptors 3， NLRP3）炎性小體可激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1， Caspase-1），有活性的Caspase-1可使白細胞介素-18（interleukin-18， IL-18）和白細胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）活化，引起下游炎癥反應[6]，提示心肌細胞焦亡在DCM的發(fā)生、發(fā)展過程中起到促進作用。

本研究所使用的2型糖尿病動物模型MKR小鼠為良好的T2DM模型鼠，具有發(fā)病快、死亡率低等特點[7]。課題組前期已成功制備DCM模型[8]，本研究沿用課題組前期方法，采用鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）干預加速成模、高脂飼料持續(xù)喂養(yǎng)MKR小鼠的方法制備DCM模型，以探討白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯對MKR小鼠DCM的治療作用，并且進一步闡述該方對炎癥、對心肌細胞細胞焦亡的影響，為DCM治療及中藥合方的臨床應用提供了新思路。

1 材料

1.1 ?實驗動物

MKR小鼠是由美國國立衛(wèi)生研究院糖尿病研究中心LeRoith D提供的純合子MKR小鼠，本課題組將自然交配后繁殖的后代用于實驗研究（倫理審批編號：ZYFY20210728），飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心[動物合格證號：SYXK（湘）2013-0005]；FVB鼠（FVB鼠與MKR鼠源自同一遺傳背景作為正常組）購自斯貝福（北京）動物技術(shù)有限公司[動物許可證號：SCXK（京）2019-0010，動物質(zhì)量合格證號：No.110324221102357848]。

1.2 ?主要藥物

白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯組成：石膏50 g，知母18 g，甘草6 g，粳米9 g，人參10 g，枳實12 g，厚樸12 g，瓜蔞12 g，薤白9 g，桂枝6 g。粳米于市面購買，其余藥物飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院門診中藥藥房，由湖南中醫(yī)藥大學藥學院吳勇軍副教授鑒定為正品。按比例稱取上述藥材，先蒸餾水浸泡30 min，后煎煮2次，合并煎液后紗布過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至含生藥量2 g/mL后，置于4 ℃冰箱備用。

鹽酸二甲雙胍片（浙江亞太藥業(yè)股份有限公司，批號：H33020106，0.25 g/片）；葡萄糖溶液（湖南科倫制藥有限公司，批號：H20058338，規(guī)格10 g/20 mL），均購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院門診西藥藥房。

1.3 ?主要試劑和儀器

IL-18、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號分別為LOT20220607A、LOT20220607A、LOT20220607A）；NLRP3一抗、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein contain a CARD， ASC）一抗、Caspase-1一抗（美國Proteintech公司，貨號分別為19771-1-AP、10500-1-AP、22915-1-AP）。

GA-3型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；MB-530型多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；DYY-6C型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；H1650R型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.4 ?DCM小鼠造模、分組及給藥劑量

4周齡MKR小鼠30只，F(xiàn)VB小鼠6只。MKR小鼠采用高脂飼料喂養(yǎng)，F(xiàn)VB小鼠予以普通飼料喂養(yǎng)。4周后對MKR鼠進行STZ腹腔注射以加速成模，前一天禁食不禁水8 h，將STZ溶于0.1 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH4.0），按20 mg/kg劑量行腹腔注射，1次/d，連續(xù)3 d。STZ注射后第3天測小鼠空腹血糖，F(xiàn)BG≥11.1 mmol/L為成模條件。4周后采用超聲成像平臺檢測小鼠心功能，出現(xiàn)心功能減退，則證明DCM小鼠造模成功。造模成功后，將小鼠按性別、體質(zhì)量、空腹血糖隨機分為模型組，二甲雙胍組，白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯低劑量組、中劑量組、高劑量組（簡稱為中藥低、中、高劑量組）。共計5組，每組6只，F(xiàn)VB小鼠為正常組。

按人和動物體表面積的等效劑量系數(shù)折算法，選用70 kg成人用量換算，中藥中劑量組18.75 g/kg、中藥低劑量組9.37 g/kg、中藥高劑量組37.5 g/kg、二甲雙胍組0.065 g/kg予以灌胃。正常組、模型組則以等體積蒸餾水灌胃持續(xù)4周，灌胃容積為20 mL/kg，每天1次。

2 方法

2.1 ?血糖、血脂水平檢測

給藥第0天和第28天，檢測DCM小鼠血糖值（fasting blood glucose， FBG）變化，小鼠斷食不斷水8 h后測空腹血糖，用血糖儀尾末端采血，測量各小鼠FBG。血脂四項血清總膽固醇（serum total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein， LDL）由上海酶聯(lián)生物科技有限公司全自動生化法檢測。

2.2 ?超聲成像平臺檢測MKR小鼠心功能

糖尿病小鼠造模成功后，持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周，用超聲成像平臺檢測MKR小鼠心功能。若檢測到小鼠左室射血分數(shù)（ejection fraction， EF），左室短軸縮短率（fractional shortening， FS）值降低，說明DCM小鼠造模成功[9]。灌胃4周后，再次檢測MKR小鼠EF、FS值。

2.3 ?光鏡下觀察小鼠心肌組織病理形態(tài)

取心肌組織，多聚甲醛固定后脫水、石蠟包埋、切片、貼片，采用常規(guī)HE及MASSON染色，觀察心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.4 ?ELISA檢測炎癥因子相關(guān)指標

按照ELISA試劑盒說明書，將眼眶取血采集到的血清進行IL-1β、IL-18、TNF-α指標檢測。

2.5 ?Western blot法檢測心肌組織蛋白表達

取適量心肌組織標本提取總蛋白，根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，于第一孔點入marker 2 μL，其他每孔上樣10 μL已變性蛋白；開始電泳，電泳恒定電壓75 V，時間為130 min，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳；電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜），4 ℃封閉過夜，封閉后加入NLRP3（1∶300）、Caspase-1（1∶500）、ASC（1∶1000）一抗，室溫孵育90 min。再加入HRP標記的山羊抗鼠IgG（1∶5000）、山羊抗兔IgG（1∶5000）二抗，室溫孵育90 min。使用ECL化學發(fā)光液與膜孵育1 min，在暗盒內(nèi)與X射線膠片曝光20 min，顯影沖洗。以Tubulin蛋白表達量校正，用Quantity One專業(yè)灰度分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2.6 ?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，計量資料以“ｘ±s”表示，多組計量資料符合正態(tài)性、方差齊性采用單因素方差分析，組間比較采用最小顯著性差異法（LSD法）；若不滿足方差齊性采用Dunnett-T3檢驗；不滿足正態(tài)性時，用秩和檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 ?中藥對DCM小鼠血糖、血脂的影響

與正常組比較，模型組的血清FBG、TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），血清HDL-C水平明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，中藥各劑量組及二甲雙胍組血清TC、TG、LDL-C水平明顯降低（P<0.05），血清HDL-C水平明顯增高（P<0.05）；與二甲雙胍組比較，中藥高劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與中藥低、中劑量組相比，中藥高劑量組血清TC、TG、LDL-C水平降低，血清HDL-C水平升高（P<0.05）。詳見表1。

3.2 ?中藥對DCM小鼠心功能的影響

中藥合方灌胃4周后，與正常組比較，模型組EF、FS值明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組及二甲雙胍組EF、FS值均有不同程度升高（P<0.05）；與二甲雙胍及中藥低、中劑量組比較，中藥高劑量組EF、FS值更高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。詳見圖1、表2。

3.3 ?中藥合方對DCM小鼠心肌組織病理形態(tài)的影響

HE染色、MASSON染色結(jié)果顯示，正常組小鼠心肌細胞形態(tài)正常，紋理整齊，心肌細胞間纖維較少，細胞核位于細胞正中，大小均勻；而模型組小鼠細胞變形、肥大，細胞質(zhì)、核分離，細胞之間間隙增大，可見到炎性浸潤，心肌纖維排列紊亂，紋理不齊。中藥各劑量組及二甲雙胍組與模型組相比較，小鼠細胞與心肌纖維均有不同程度改善，其中中藥高劑量組心肌改善相對明顯，細胞排列較整齊，纖維相對完整。詳見圖2—3。

3.4 ?中藥對各組小鼠IL-1β、IL-18、TNF-α炎癥因子表達的影響

與正常組相比，模型組中血清IL-1β、IL-18、TNF-α明顯升高（P<0.01）；中藥各劑量組及二甲雙胍組與模型組相比，血清IL-1β、IL-18、TNF-α水平降低（P<0.05）；中藥高劑量組與二甲雙胍組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且含量低于中藥低、中劑量組（P<0.05）。詳見表3。

3.5 ?中藥對DCM小鼠心肌組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組及二甲雙胍組心肌組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達均降低（P<0.05）；中藥高劑量組蛋白表達低于二甲雙胍和中藥低、中劑量組（P<0.05）。詳見圖4、表4。

4 討論

調(diào)查顯示，截至2017年，全球18歲以上人群中糖尿病患者約計4.51億人，預計2045年將達6.93億人[10]。DCM為糖尿病心血管并發(fā)癥，以心臟結(jié)構(gòu)改變和持續(xù)的收縮與舒張功能不全為特征，主要病理特征為心肌細胞壞死、心肌纖維化等心肌結(jié)構(gòu)變化[11]。目前仍缺乏有效的防治DCM手段。中醫(yī)藥有毒副作用小、成分多、多靶點作用等特點，因此，探討中醫(yī)藥在DCM的治療方面的作用有積極意義。DCM發(fā)病機制包括炎癥反應、代謝障礙、氧化應激等多種途徑，其中炎癥反應貫穿始終，促進DCM的發(fā)生發(fā)展[4，12]。炎癥通路的激活可介導細胞及細胞外損傷、心臟重塑，引起收縮和舒張功能障礙[13]。NLRP3炎性小體是近年來研究熱點，在DCM發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，抑制NLRP3炎性小體可有效減輕DCM炎癥反應，從而改善DCM心肌損傷和心肌纖維化等過程[14]。LUO等[15]發(fā)現(xiàn)在沉默NLRP3基因后，糖尿病大鼠心臟功能改善，心肌纖維化和心肌細胞焦亡顯著減少。ZHANG等[16]實驗研究表明高糖環(huán)境可間接介導NLRP3炎性小體的激活，導致新生大鼠心肌纖維化。NLRP3炎性小體復合物由NLRP3、ASC和pro-Caspase-1組成[17]，可通過炎癥反應、細胞焦亡、心肌纖維化多種方式促進DCM的發(fā)生發(fā)展[18]。NLRP3炎性小體可誘導pro-Caspase-1自我剪切產(chǎn)生有活性的Caspase-1。Caspase-1的活化將無活性的pro-IL-1β、pro-IL-18切割為有活性的IL-1β和IL-18，IL-1β為成熟的分泌因子，可通過激活下游信號通路誘發(fā)系列炎癥反應，研究表明促炎性細胞因子IL-1β、TNF-α的釋放增加會促進DCM的發(fā)展[19]；IL-18、IL-1β等炎癥產(chǎn)物還可刺激心肌成纖維細胞合成大量膠原，導致過度膠原堆積、心肌纖維化和心臟重構(gòu)[20-21]；同時，Caspase-1還可觸發(fā)gasdermin D（GSDMD）的N端寡聚化，誘發(fā)心肌細胞細胞焦亡，是細胞焦亡的經(jīng)典途徑[22]。

中醫(yī)學中并無“糖尿病心肌病”病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)，當將其歸于“消渴”并發(fā)“胸痹”“心痛”等范疇。古代醫(yī)家認為陰虛內(nèi)熱是消渴病的主要病機[23]。消渴病久，氣陰兩虛，心脈失養(yǎng)，或陰虛燥熱煉液成痰，痰濁閉阻心脈，從而引發(fā)DCM[24]?，F(xiàn)代研究證明，中醫(yī)藥有良好的降血糖、保護心肌等功能，可有效緩解DCM不適癥狀[25]。白虎人參湯與枳實薤白桂枝湯均出自東漢·張仲景《傷寒雜病論》。白虎人參湯為治療消渴病的經(jīng)典名方，具有益氣、養(yǎng)陰功效；枳實薤白桂枝湯可祛痰、散結(jié)。兩者合用，共奏益氣、養(yǎng)陰、化痰之功，可針對DCM氣陰兩傷、痰阻心脈之病機。

本實驗研究根據(jù)課題組前期造模方法，予以4周齡MKR小鼠腹腔注射STZ聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)的方式成功制備DCM模型。研究結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血糖、血脂升高；超聲心動顯示小鼠EF、FS值均有下降，說明心臟功能減退；HE染色及MASSON染色顯示心肌細胞肥大、變性壞死，可見炎性浸潤，心肌纖維化，提示DCM模型成功；血清中TNF-α、IL-1β、IL-18水平明顯上升，心肌組織NLRP3、ASC、Caspse-1蛋白表達顯著增加，提示小鼠存在炎癥反應、細胞焦亡、心肌組織中NLRP3炎癥小體活化過度的情況，加速了DCM的病情進展。中藥各組干預4周后，DCM小鼠FBG、TC、TG、LDL下調(diào)，HDL升高，表明白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯可改善DCM大鼠血糖、血脂水平；EF、FS值均有不同程度上升；HE及MASSON染色心肌組織形態(tài)則較模型組有不同程度改善；ELISA檢測血清中TNF-α、IL-1β、IL-18含量降低；Western blot結(jié)果表明DCM小鼠心肌組織NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達降低，表明中藥各組可抑制NLRP3炎癥小體活化、減輕焦亡、降低炎癥因子水平、減輕炎癥反應，其中高劑量組效果最好。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯可有效抑制NLRP3炎癥小體活化水平，降低DCM小鼠炎癥反應，改善心肌纖維化，延緩DCM病程進展。同時，在實驗中白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯劑量越高，其抗炎、保護心肌作用就越明顯。研究表明，NLRP3炎癥小體是治療DCM的潛在靶點，為白虎人參湯合枳實薤白桂枝湯治療DCM提供理論依據(jù)，豐富了中藥合方治療DCM的臨床策略。但關(guān)于該方的最佳用藥劑量尚不明確，有待進一步研究。

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〔收稿日期〕2022-11-01

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（82074400，U21A20411，82004185）；湖南省教育廳創(chuàng)新平臺開放基金項目（20K094）；湖南省科學廳重點研發(fā)計劃項目（2020SK2101）；湖南省教育廳科技計劃青年項目（20B450）。

〔第一作者〕史留陽，男，碩士，研究方向：仲景雜病證治及經(jīng)方應用基礎研究。

〔通信作者〕*喻 ?嶸，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：yuron@21.cn.com。