基于Ca²⁺濃度及線粒體氧化應(yīng)激探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)脊髓損傷大鼠受損紅核神經(jīng)元的保護(hù)作用

盧青青 范婷婷 萬(wàn)彩云 張偉 謝夢(mèng)洲 李亮

〔摘要〕 目的 從Ca2+濃度及線粒體氧化應(yīng)激的角度探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）對(duì)脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）氣虛血瘀證紅核神經(jīng)元的影響。方法 將大鼠隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組、BYHWD低劑量組（BL組）、BYHWD中劑量組（BM組）和BYHWD高劑量組（BH組）。除對(duì)照組外，其余4組均采用游泳力竭法聯(lián)合紅核脊髓束（rubrospinal tract， RST）橫斷術(shù)制備SCI氣虛血瘀證模型。BL組、BM組、BH組大鼠分別以BYHWD生藥12.825、25.650、51.300 g/kg的劑量灌胃，對(duì)照組和模型組以生理鹽水灌胃。采用斜板實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)功能，血液流變學(xué)檢測(cè)血液的狀態(tài)，氧化應(yīng)激和抗氧化能力檢測(cè)紅核超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量，原子分光光度法測(cè)定紅核Ca2+濃度，透射電子顯微鏡觀察紅核線粒體的狀態(tài)。結(jié)果 術(shù)后第1、第14、第28天，模型組斜板實(shí)驗(yàn)角度均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。術(shù)后第14、第28天，BL組、BM組、BH組斜板實(shí)驗(yàn)角度均明顯高于模型組（P＜0.01）；BL組斜板實(shí)驗(yàn)角度明顯低于BH組（P＜0.01）。與術(shù)后第1天比較，術(shù)后第14、第28天BL組、BM組、BH組斜板實(shí)驗(yàn)角度均明顯升高（P＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度、MDA含量和Ca2+濃度均明顯升高（P＜0.01），SOD含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，BL組、BM組、BH組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度和Ca2+濃度均明顯降低（P＜0.01），BM組、BH組MDA含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），BH組SOD含量明顯升高（P＜0.05）。與BH組比較，BL組、BM組卡松黏度均明顯升高（P＜0.05）。模型組出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂、染色質(zhì)邊集的典型凋亡現(xiàn)象。BL組、BM組、BH組線粒體結(jié)構(gòu)變得清晰，數(shù)目增多，染色質(zhì)邊集現(xiàn)象改善，其中，BH組改善最為明顯。結(jié)論 BYHWD對(duì)SCI氣虛血瘀證大鼠受損紅核神經(jīng)元有保護(hù)作用，促進(jìn)肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與BYHWD調(diào)節(jié)血液微循環(huán)，改變線粒體形態(tài)，增強(qiáng)線粒體抗氧化應(yīng)激能力，降低Ca2+濃度有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 脊髓損傷；補(bǔ)陽(yáng)還五湯；Ca2+；線粒體；氧化應(yīng)激；紅核神經(jīng)元；氣虛血瘀證

〔中圖分類號(hào)〕R274.9 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.004

Protective effects of Buyang Huanwu Decoction on damaged rubrospinal neurons in rats after

spinal cord injury based on Ca2+ concentration and mitochondrial oxidative stress

LU Qingqing1，2， FAN Tingting1，2， WAN Caiyun1，2， ZHANG Wei3， XIE Mengzhou1，2， LI Liang1，2*

1. Provincial Key Laboratory of TCM Diagnostics， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Key Laboratory of TCM Heart and Lung Syndrome Differentiation & Medicated Diet and Dietotherapy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. College of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan

University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To discuss the effects of Buyang Huanwu Decoction （BYHWD） on rubrospinal neurons after spinal cord injury （SCI） of qi deficiency and blood stasis pattern from Ca2+ concentration and mitochondrial oxidative stress. Methods The rats were randomly divided into 5 groups： control， model， low-dose BYHWD （BL） group， medium-dose BYHWD （BM） group and high-dose BYHWD （BH） group. The SCI models of qi deficiency and blood stasis pattern were established in model， BL， BM and BH groups with swimming exhaustion method combined with rubrospinal tract （RST） transection， except for the control group. The BL， BM and BH groups were intragastrically perfused with crude BYHWD 12.825， 25.650， 51.300 g per kilogram of bodyweight， respectively. The control and model groups were given normal saline. The motor function of limbs was determined by inclined plate test， the blood state was tested by hemorheology， the superoxide dismutase （SOD） activity and malondialdehyde （MDA） level in nucleus ruber was measured by oxidative stress and antioxidative ability， and the Ca2+ concentration in rubrospinal neurons was determined by atomic spectrophotometry. The morphological changes of mitochondria in nucleus ruber were observed by transmission electron microscope. Results On the 1st， 14th and 28th day after operation， the angle of inclined plate in model group was significantly lower than that in control group （P<0.01）. On the 14th and the 28th day after surgery， the angle of inclined plate in BL， BM and BH groups was significantly higher than that in model group （P<0.01）. The angle of inclined plate in BL group was significantly lower than that in the BH group （P<0.01）. Compared with the 1st day after surgery， the angle of inclined plate test in BL， BM and BH group was significantly higher on the 14th and 28th day after surgery （P<0.01）. Compared with control group， the whole blood low viscosity， whole blood middle viscosity， whole blood high viscosity， red blood cell aggregation index， Casson viscosity， MDA content and Ca2+ concentration were significantly higher in the model group （P<0.01）， while the SOD content was significantly lower （P<0.01）. Compared with model group， the whole blood low tangential viscosity， whole blood tangential viscosity， whole blood high tangential viscosity， red blood cell aggregation index， Casson viscosity and Ca2+ concentration in BL group， BM group and BH group were significantly lower （P<0.01）. MDA content in BM group and BH group was significantly lower （P<0.05 or P<0.01）. SOD content in BH group was significantly higher （P<0.05）. Compared with BH group， Casson viscosity in BL group and BM group was significantly higher （P<0.05）. The model group showed typical apoptotic phenomena of fuzzy mitochondrial structure， disordered arrangement and chromatin edge set. In BL， BM and BH groups， the mitochondrial structure was clear， the number increased， and the chromatin margination phenomenon improved. Among the three groups， BH group showed the most obvious improvement. Conclusion BYHWD has protective effects on damaged rubrospinal neurons of rats after SCI with qi deficiency and blood stasis pattern， and helps recover the limb motor function. The possible mechanism is that BYHWD can regulate blood microcirculation， change the morphology of mitochondria， improve its anti-oxidative stress capability and decrease Ca2+ concentration.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 spinal cord injury; Buyang Huanwu Decoction; Ca2+; mitochondria; oxidative stress; rubrospinal neurons; qi deficiency and blood stasis pattern

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）是常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病[1]。每年約有100萬(wàn)人遭受SCI，對(duì)患者、家庭和社會(huì)產(chǎn)生重大的心理、身體和社會(huì)經(jīng)濟(jì)后果[2]。SCI常表現(xiàn)為截癱或四肢癱，致殘率高且治愈率低[3]。目前的治療手段可以在一定程度上緩解脊髓受壓或損傷的狀況，但對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的作用仍然有限。因此，如何有效降低SCI后傷殘率，緩解疼痛，促進(jìn)其神經(jīng)功能快速恢復(fù)仍是巨大挑戰(zhàn)[4]。

SCI在中醫(yī)學(xué)屬于“痿證”范疇，常伴氣虛血瘀證[5]。SCI患者多長(zhǎng)期臥床，久臥傷氣。氣為血之帥，氣行則血行，氣傷則虛，氣虛則血行無(wú)力，從而病情經(jīng)久不愈，痿軟無(wú)力[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用游泳力竭法聯(lián)合紅核脊髓束（rubrospinal tract， RST）橫斷手術(shù)制備SCI氣虛血瘀證大鼠模型后，補(bǔ)陽(yáng)還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）可防止紅核神經(jīng)元發(fā)生逆行性潰變、促進(jìn)神經(jīng)元的再生，改善大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能[7-10]，但是其具體機(jī)制尚不完全清楚。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“氣”是維持人體生命活動(dòng)的精微物質(zhì)，包含生命活動(dòng)所需的物質(zhì)和能量等，而物質(zhì)能量代謝和呼吸作用的主要場(chǎng)所是線粒體[11]。線粒體參與機(jī)體氧化還原反應(yīng)，對(duì)保護(hù)神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元再生都有著至關(guān)重要的作用，細(xì)胞存活與否、狀態(tài)好壞都會(huì)隨著線粒體功能結(jié)構(gòu)的變化而受到影響[12]，而線粒體功能結(jié)構(gòu)的變化與Ca2+的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。因此，本課題組假設(shè)中醫(yī)學(xué)中的“氣虛”可能與線粒體功能下降相關(guān)，擬從紅核線粒體形態(tài)改變、Ca2+濃度變化的影響去闡釋BYHWD修復(fù)SCI的機(jī)制。

1 材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠90只，8～10周齡，SPF級(jí)，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。本實(shí)驗(yàn)由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：LL2021030503。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在環(huán)境清潔、溫度為（21±2） ℃、相對(duì)濕度為30%～70%的飼養(yǎng)環(huán)境中分籠喂養(yǎng)，按時(shí)等量供給高溫高壓滅菌的飼料和水。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作均遵循湖南中醫(yī)藥大學(xué)制定的科研動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)室使用規(guī)范。

1.2 ?主要試劑、藥品

電子顯微鏡固定液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20170727）；BCA蛋白定量試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：23227）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：A003-1-2）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；鈣標(biāo)準(zhǔn)貯備液（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，批號(hào)：20A034-5）；苯巴比妥鈉注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1906061，0.1 g/mL）；阿莫西林膠囊（海南先聲藥業(yè)有限公司，批號(hào)：02-190503）。

1.3 ?主要儀器

強(qiáng)迫游泳桶（型號(hào)：Smart 3.0）、手術(shù)顯微鏡（型號(hào)：77002）均購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；血液流變儀（北京賽科希德科技股份有限公司，型號(hào)：SA-6600）；透射電子顯微鏡（北京捷歐路科貿(mào)有限公司，型號(hào)：JEM1230）；原子吸收光譜儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：ICE3000）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 ?實(shí)驗(yàn)藥物制備

BYHWD處方：黃芪120 g，當(dāng)歸尾6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g。以上中藥飲片均購(gòu)于湖南三湘中藥飲片有限公司，請(qǐng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院專家鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典》[13]要求。在湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，將每種藥物飲片用電子天平進(jìn)行精確稱量，每份BYHWD處方均加自身重量的10倍量水浸泡30 min，用武火煮至藥液沸騰后改為文火保持30 min，再用無(wú)菌紗布過(guò)濾藥液，將所得藥液用濾紙過(guò)濾得濾液備用。繼續(xù)向第1次煎煮過(guò)藥液的藥渣加入8倍量水，進(jìn)行相同步驟得第2次濾液。將兩次濾液合并一同放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，濃縮至濃度為生藥2 g/g的膏劑，待冷卻后放入滅菌玻璃罐中，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。后續(xù)使用時(shí)用蒸餾水稀釋成濃度為生藥2 g/mL的藥液。

2.2 ?動(dòng)物模型制備

采用游泳力竭法聯(lián)合RST橫斷術(shù)[14]進(jìn)行SCI氣虛血瘀證大鼠模型制備。水溫22～25 ℃，將大鼠分組依次進(jìn)行游泳，直到出現(xiàn)身體無(wú)法支撐、搖晃欲倒等，表明游泳導(dǎo)致力竭。連續(xù)游泳21 d，建立氣虛狀態(tài)模型。在21 d的強(qiáng)迫游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，注射苯巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，將大鼠固定于鼠臺(tái)，在手術(shù)顯微鏡下逐層分離大鼠頸背部肌肉組織，暴露第3、第4頸椎之間的脊髓，用手術(shù)刀的尖端迅速橫斷右側(cè)RST，建立局部“血瘀”狀態(tài)，逐層縫合，涂阿莫西林以預(yù)防感染。大鼠蘇醒后，可見(jiàn)右側(cè)前肢呈屈曲無(wú)力狀，且右前爪無(wú)法自由伸展，表明SCI氣虛血瘀證大鼠模型制備成功[14]。術(shù)后注意護(hù)理清潔大鼠，保持干爽，每日更換墊料。

2.3 ?動(dòng)物分組與干預(yù)

將90只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、BYHWD低劑量組（BL組）、BYHWD中劑量組（BM組）、BYHWD高劑量組（BH組），每組18只。除對(duì)照組外，其余4組均進(jìn)行游泳力竭法聯(lián)合RST橫斷術(shù)制備SCI氣虛血瘀證模型。BL組、BM組、BH組大鼠分別以BYHWD生藥12.825、25.650、51.300 g/kg的劑量（按照體表面積藥物劑量換算公式[15]計(jì)算，分別相當(dāng)于70 kg成人劑量的1、2、4倍）進(jìn)行灌胃干預(yù)，對(duì)照組和模型組以生理鹽水灌胃，均1次/d，持續(xù)干預(yù)28 d后進(jìn)行取材。

2.4 ?動(dòng)物樣本采集與制備

每組先隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行取血，將大鼠稱量麻醉后，打開(kāi)大鼠的腹腔，使用一次性采血針刺入腹主動(dòng)脈采集5 mL血液，在4 h內(nèi)完成血液流變學(xué)檢測(cè)。采完血后的大鼠，用止血鉗緩慢地將大鼠顱骨撥開(kāi)，暴露大腦組織，定位中腦紅核組織所在區(qū)域，紅核位于腦橋上丘的腹側(cè)，用鑷子將紅核組織完整地分離，將紅核組織樣本放置在潔凈的EP管中并立即投入液氮中，轉(zhuǎn)存至-80 ℃冰箱。每組再隨機(jī)選取6只大鼠，以上同方式取紅核組織轉(zhuǎn)存至

-80 ℃冰箱。這12個(gè)紅核組織樣本中，6個(gè)樣本用于后續(xù)的線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)檢測(cè)，其余6個(gè)樣本用于Ca2+濃度檢測(cè)。

每組其余6只大鼠以上述方式取完整中腦放入含電子顯微鏡固定液的EP管中，暫時(shí)置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)切片染色進(jìn)行電子顯微鏡檢測(cè)。

2.5 ?指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 ?宏觀表征觀察 ?術(shù)后第28天，在自然光線下觀察每組大鼠精神狀態(tài)、爪甲黏膜和舌色，并記錄。

2.5.2 ?行為學(xué)檢測(cè) ?每組隨機(jī)抽取6只大鼠，在RST橫斷術(shù)前和術(shù)后第1、第14、第28天進(jìn)行斜板實(shí)驗(yàn)。將大鼠身體軸線與斜板縱軸垂直放置，檢測(cè)大鼠能夠停留的最大角度。從水平開(kāi)始增加斜板角度，每次升高5°，檢測(cè)能夠持續(xù)停留5 s而不下滑的最大角度，每只實(shí)驗(yàn)大鼠測(cè)量3次，取其平均值為其運(yùn)動(dòng)功能值[16]。

2.5.3 ?血液流變學(xué)檢測(cè) ?使用血液流變儀進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定全血高切黏度、全血中切黏度、全血低切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度，了解血液流變學(xué)情況。

2.5.4 ?氧化應(yīng)激水平和抗氧化能力的檢測(cè) ?從-80 ℃冰箱中取出新鮮紅核組織樣本等待其恢復(fù)至室溫，10%的樣品溶液，4000 r/min、半徑11 cm在高速離心機(jī)中持續(xù)離心10 min，取出離心管，取上清液備用。用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，且嚴(yán)格按照SOD、MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明，配制反應(yīng)體系，制備測(cè)試管、對(duì)照管、測(cè)定管。放置在37 ℃水浴箱中水浴40 min，然后分別加入顯色劑400 μL，混勻，室溫放置10 min。將可見(jiàn)光分光光度計(jì)分別調(diào)至550 nm和532 nm處，測(cè)定各管吸光度值，按照試劑盒說(shuō)明所提供公式計(jì)算紅核組織樣本SOD活力、MDA含量。

2.5.5 ?原子分光光度法測(cè)定Ca2+濃度 ?將紅核組織樣品放置在50 mL坩堝內(nèi)，加入硝酸8 mL、高氯酸2 mL，浸泡放置一夜，蓋上坩堝蓋，在電熱板上加熱60 min，打開(kāi)蓋子，繼續(xù)加熱至紅棕色蒸氣揮發(fā)干凈，冷卻再加蒸餾水轉(zhuǎn)入離心管中，稀釋至50 mL，混勻。制備鈣標(biāo)準(zhǔn)貯備液，取鈣標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用2%硝酸溶液不同Ca2+濃度下溶液的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法測(cè)定待測(cè)樣品中Ca2+的濃度。

2.5.6 ?紅核區(qū)透射電子顯微鏡觀察 ?將電子顯微鏡固定液中的中腦組織用0.1 mol磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min。紅核組織浸泡于1%鋨酸溶液中，4 ℃固定2 h。雙蒸水沖洗3次，每次15 min。依次浸泡于50%、70%、90%乙醇中各15 min；100%無(wú)水乙醇和環(huán)氧丙烷各浸泡3次，每次15 min，進(jìn)行梯度脫水。在環(huán)氧丙烷和包埋液中進(jìn)行包埋滲透。純包埋劑包埋紅核組織后置于包埋模板內(nèi)，電熱恒溫干燥箱內(nèi)進(jìn)行聚合。超薄切片機(jī)切片，片厚70 nm，定位選取紅核組織區(qū)域，用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙染色，使用透射電子顯微鏡觀察記錄并拍片。

2.6 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)以“ｘ±s”表示，滿足正態(tài)性和方差齊性后，多組間比較采用單因素方差分析，不滿足正態(tài)性采用Kruskal-Wallis法，不符合方差齊性則采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?宏觀表征觀察結(jié)果

對(duì)照組精神狀態(tài)良好、活潑好動(dòng)，爪甲淡紅、毛發(fā)有光澤，舌質(zhì)淡紅柔軟；模型組大鼠精神萎靡、不愛(ài)活動(dòng)，且爪甲呈深紅或紫紅狀，舌質(zhì)深紅，毛發(fā)黯淡。與模型組比較，BL組、BM組、BH組出現(xiàn)氣虛血瘀癥狀的程度較輕，部分大鼠爪甲呈深紅狀，部分無(wú)爪甲改變，可自由活動(dòng)，且BH組氣虛血瘀癥狀程度最輕。在游泳聯(lián)合手術(shù)造模以及給藥干預(yù)過(guò)程中均無(wú)大鼠死亡。

3.2 ?各組大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

術(shù)前各組間斜板實(shí)驗(yàn)角度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。術(shù)后第1、第14、第28天，模型組斜板實(shí)驗(yàn)角度均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。術(shù)后第14、第28天，BL組、BM組、BH組斜板實(shí)驗(yàn)角度均明顯高于模型組（P＜0.01）；BL組斜板實(shí)驗(yàn)角度明顯低于BH組（P＜0.01）。與術(shù)后第1天比較，術(shù)后第14、第28天BL組、BM組、BH組斜板實(shí)驗(yàn)角度均明顯升高（P＜0.01）。模型組斜板實(shí)驗(yàn)角度術(shù)后第14、第28天與術(shù)后第1天比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

3.3 ?血液流變學(xué)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，BL組、BM組、BH組全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度均明顯降低（P＜0.01）。與BH組比較，BL組、BM組卡松黏度均明顯升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.4 ?紅核氧化應(yīng)激和抗氧化檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組MDA含量明顯升高（P＜0.01），SOD含量明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，BM組、BH組MDA含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），BH組SOD含量明顯升高（P＜0.05）。BL組與模型組間MDA含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。BL組、BM組與模型組間SOD含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3。

3.5 ?紅核Ca2+濃度檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較，模型組Ca2+濃度明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，BL組、BM組、BH組Ca2+濃度明顯降低（P＜0.01）。詳見(jiàn)表4。

3.6 ?紅核透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

對(duì)照組紅核組織中線粒體為橢圓形或卵圓形，線粒體結(jié)構(gòu)清晰完整，線粒體嵴排列有序緊密，核膜完整且細(xì)胞核呈飽滿圓形；模型組紅核組織中線粒體結(jié)構(gòu)模糊呈腫脹空泡狀，線粒體嵴碎裂溶解狀，伴有髓樣化改變且數(shù)目減少，核膜內(nèi)陷變形且有明顯的染色質(zhì)凝結(jié)邊集現(xiàn)象，為典型的凋亡現(xiàn)象；BL組紅核組織中線粒體空泡現(xiàn)象減少，腫脹減輕，可以看到卵圓形線粒體結(jié)構(gòu)和少量線粒體嵴排列，核膜變形減輕且染色質(zhì)邊集程度減輕；BM組線粒體結(jié)構(gòu)和線粒體嵴更加清晰，染色質(zhì)邊集現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)；BH組改善最為明顯，有橢圓形和卵圓形線粒體，結(jié)構(gòu)清晰，嵴的數(shù)量增多，核膜附近基本無(wú)染色質(zhì)邊集。詳見(jiàn)圖1。

4 討論

根據(jù)中醫(yī)理論“勞則氣耗”理論，本課題組選擇游泳力竭法模擬建立“氣虛”狀態(tài)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，紅核通過(guò)RST將小腦和大腦皮質(zhì)等處的沖動(dòng)傳遞到脊髓前角神經(jīng)元，在調(diào)節(jié)體態(tài)和維持運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)上具有重要作用[17]。為保證造模方式簡(jiǎn)便有效，選擇橫斷第3、第4頸椎之間的脊髓右側(cè)RST進(jìn)行造模，此方式損傷范圍小，部位較為精確，易于術(shù)后護(hù)理，可達(dá)到模擬SCI后運(yùn)動(dòng)功能受損明顯又不威脅生命安全的良好效果。除此以外，氣為血之帥，血為氣之母，橫斷處的局部血瘀亦可導(dǎo)致氣運(yùn)不利。因此，游泳力竭法聯(lián)合RST橫斷術(shù)的造模方式都可以較好模擬SCI氣虛血瘀證。

斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，術(shù)前各組斜板實(shí)驗(yàn)角度無(wú)差異，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前運(yùn)動(dòng)功能水平相同。而模型制備術(shù)后第1天，模型組、BL組、BM組和BH組的斜板實(shí)驗(yàn)角度均大幅下降，說(shuō)明造模大鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯受損，造模成功。術(shù)后第14、第28天，與模型組比較，BL組、BM組和BH組的斜板角度均明顯上升，且在第2天，BH組的斜板實(shí)驗(yàn)角度大于BL組，其運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)接近對(duì)照組水平，說(shuō)明BYHWD對(duì)SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能有明顯的改善作用，且BH組的療效優(yōu)于BL組，提示療效可能與治療時(shí)間成正比。宏觀表征觀察結(jié)果顯示，模型組氣虛血瘀癥狀最為明顯，大多表現(xiàn)為爪甲深紅或紫紅、精神萎靡，BL組、BM組大鼠爪甲顏色轉(zhuǎn)淡，但精神狀態(tài)一般，而B(niǎo)H組大鼠爪甲血呈粉色，精神狀態(tài)良好，說(shuō)明BYHWD可改善SCI大鼠氣虛血瘀癥狀且BH組效果最好，與斜板實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，故BYHWD可以改善SCI氣虛血瘀證的表現(xiàn)，體現(xiàn)其益氣養(yǎng)血的功效。

SCI后血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和組織水腫形成了缺血缺氧的微環(huán)境，不利于神經(jīng)元的存活，故改善SCI后微循環(huán)障礙有助于脊髓修復(fù)[18]。血液流變學(xué)檢測(cè)血液中的細(xì)胞變形性和血漿流動(dòng)性，這些指標(biāo)可反映血液循環(huán)的狀態(tài)。本研究采用血液流變學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)BYHWD對(duì)SCI后血液微循環(huán)的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組不同切變率下的全血黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松黏度明顯升高（P<0.01），而這些指標(biāo)的值越高，說(shuō)明全血的流動(dòng)性越差，更易發(fā)生高黏滯血癥，而B(niǎo)YHWD治療組各指標(biāo)值均明顯下降，說(shuō)明BYHWD可減輕血液微循環(huán)障礙，緩解血瘀狀態(tài)，且BH組的卡松黏度明顯低于BL組和BM組（P<0.05），說(shuō)明BH組的血液微循環(huán)改善效果優(yōu)于BL組與BM組，提示一定劑量范圍內(nèi)，血液微循環(huán)的改善可能與BYHWD的劑量具有正相關(guān)性。

上述血液流變學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，SCI后易導(dǎo)致血液微循環(huán)障礙，增加缺血缺氧的發(fā)生概率，而神經(jīng)系統(tǒng)具有高耗氧量、高代謝的特點(diǎn)[19]，神經(jīng)元在缺血缺氧狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生和釋放大量氧自由基，這些產(chǎn)物可破壞細(xì)胞膜，造成細(xì)胞損傷從而影響神經(jīng)細(xì)胞的功能[20-22]，且神經(jīng)系統(tǒng)在處于缺血缺氧的微環(huán)境時(shí)，易發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化終產(chǎn)物為MDA。MDA可影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及相關(guān)酶活性，加劇細(xì)胞膜和細(xì)胞器的損傷，是反映自由基對(duì)細(xì)胞損害程度的重要標(biāo)志[23]。自由基損傷作用最早的靶點(diǎn)為線粒體，SOD為氧自由基清除劑，代表機(jī)體清除自由基的能力[24]，故MDA含量與SOD活力可反映組織線粒體氧化應(yīng)激與抗氧化能力的變化。因此，維持線粒體氧化應(yīng)激-抗氧化軸的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)抑制細(xì)胞的氧化損傷有著重要意義。紅核MDA與SOD檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組的MDA含量上升（P<0.01），SOD含量下降（P<0.01），提示SCI后出現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，紅核抗氧化能力減弱，細(xì)胞過(guò)氧化損傷程度較重；與模型組比較，BM組、BH組的MDA含量下降（P<0.01），BH組的SOD含量上升（P<0.05），說(shuō)明BYHWD可改善紅核線粒體氧化應(yīng)激水平，增抗氧化能力，降低自由基對(duì)細(xì)胞過(guò)氧化的損傷程度，且BH組效果最好。

細(xì)胞線粒體氧化磷酸化受阻，將會(huì)導(dǎo)致ATP合成受阻，從而使細(xì)胞膜上依賴ATP的鈣泵功能受損，繼而影響Ca2+穩(wěn)態(tài)[25]。本研究中Ca2+濃度檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組的Ca2+濃度明顯上升（P<0.01），說(shuō)明SCI后，線粒體形態(tài)發(fā)生改變，影響氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起Ca2+濃度上升。Ca2+濃度上升一方面可加速自由基的生成，加重對(duì)線粒體的損傷，另一方面還可影響膜的流動(dòng)性，使線粒體膜形態(tài)發(fā)生改變，形成惡性循環(huán)，加重SCI癥狀。而與模型組比較，BL組、BM組與BH組的Ca2+濃度均下降（P<0.01），說(shuō)明BYHWD可以抑制Ca2+濃度上升，維持Ca2+平衡，防止形成惡性循環(huán)來(lái)保護(hù)線粒體。本研究中透射電子顯微鏡結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，電子顯微鏡下對(duì)照組紅核神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)非常清晰，胞核形態(tài)飽滿，核膜清晰，線粒體嵴排列整齊均勻，結(jié)構(gòu)清晰，數(shù)量較多；而模型組的紅核神經(jīng)元胞核出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，線粒體嵴腫脹且排列散亂，伴空泡化，數(shù)量明顯減少，染色質(zhì)邊集明顯，說(shuō)明Ca2+濃度增加后，線粒體膜結(jié)構(gòu)明顯受到影響。與模型組比較，BL組、BM組與BH組電子顯微鏡下紅核神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，胞核凝集現(xiàn)象減輕，核膜變形減輕，線粒體形態(tài)逐漸恢復(fù)，且BH組恢復(fù)情況最好，說(shuō)明BYHWD可以保護(hù)線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且BH組優(yōu)于BL組、BM組。

綜上所述，通過(guò)游泳力竭法聯(lián)合RST橫斷術(shù)制備大鼠氣虛血瘀證模型后應(yīng)用BYHWD進(jìn)行治療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了BYHWD對(duì)SCI氣虛血瘀證大鼠的神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，有利于SCI氣虛血瘀證大鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能與BYHWD調(diào)節(jié)血液微循環(huán)、增強(qiáng)線粒體抗氧化能力、降低Ca2+濃度有關(guān)，提示我們可以從保護(hù)紅核神經(jīng)元、改善線粒體抗氧化能力和調(diào)節(jié)Ca2+濃度等方面尋求更為有效的SCI治療策略。然而，關(guān)于BYHWD調(diào)節(jié)線粒體氧化應(yīng)激的蛋白通道和Ca2+的具體分子機(jī)制，有待進(jìn)一步研究，以便更加完善地闡述其作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] LIU X Y， ZHANG Y W， WANG Y T， et al. Inflammatory response to spinal cord injury and its treatment[J]. World Neurosurgery， 2021， 155： 19-31.

[2] WILES M D. Airway management in patients with suspected or confirmed traumatic spinal cord injury： A narrative review of current evidence[J]. Anaesthesia， 2022， 77（10）： 1120-1128.

[3] 田 ?婷，李曉光.脊髓損傷再生修復(fù)中的問(wèn)題與挑戰(zhàn)[J].中國(guó)組織工程研究，2021，25（19）：3039-3048.

[4] CHEN X K， WANG Y Y， ZHOU G， et al. The combination of nanoscaffolds and stem cell transplantation： Paving a promising road for spinal cord injury regeneration[J]. Biomedecine and Pharmacotherapie， 2021， 143： 112233.

[5] 宋漢秋.補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療急性缺血性腦梗塞46例[J].陜西中醫(yī)，2013，34（2）：158-160.

[6] 趙繼榮，蔡 ?毅，陳 ?文，等.中藥治療脊髓損傷相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2021，39（8）：5-9.

[7] 周 ?彬，范瑜潔，聶 ?穎，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合BMSCs移植對(duì)脊髓損傷氣虛血瘀證紅核神經(jīng)元的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（5）：568-572.

[8] 聶 ?穎，范瑜潔，王梟冶，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷氣虛血瘀證的療效[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2021，16（12）：714-718.

[9] YANG P， CHEN A， QIN Y， et al. Buyang Huanwu Decoction combined with BMSCs transplantation promotes recovery after spinal cord injury by rescuing axotomized red nucleus neurons[J]. Journal of Ethnopharmacology， 2019， 228： 123-131.

[10] NIE Y， FAN Y J， ZHANG X， et al. Buyang Huanwu Decoction improves neural recovery after spinal cord injury in rats through the mTOR signaling pathway and autophagy[J]. The Journal of Spinal Cord Medicine， 2023， 46（1）： 99-106.

[11] 林 ?飛，郭麗麗，王 ?階.基于線粒體的功能闡釋中醫(yī)“氣”的作用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（8）：903-906.

[12] 范婷婷，萬(wàn)彩云，盧青青，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯改善脊髓損傷的抗氧化功能及作用機(jī)制[J].世界中醫(yī)藥，2021，16（12）：1818-1823.

[13] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020：42，127，139，165，315.

[14] LI L， LI F， YIN J， et al. Establishment and evaluation of a rat model of spinal cord injury with the pathopattern of qi-deficiency and blood-stasis in traditional Chinese medicine[J]. Digital Chinese Medicine， 2018， 1（1）： 102-112.

[15] 陳 ?安，張建偉，伍校瓊，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)紅核脊髓束橫斷后神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2007（6）：665-668.

[16] 陳 ?萌，馬 ?泉，鄭小影，等.大鼠脊髓橫斷模型的建立及米諾環(huán)素對(duì)膠質(zhì)纖維酸性蛋白表達(dá)的影響[J].解剖學(xué)雜志，2014，37（3）：352-355.

[17] MARTINEZ-LOPEZ J E， MORENO-BRAVO J A， MADRIGAL M P， et al. Red nucleus and rubrospinal tract disorganization in the absence of Pou4f1[J]. Frontiers in Neuroanatomy， 2015， 9： 8.

[18] FIGLEY S A， KHOSRAVI R， LEGASTO J M， et al. Characterization of vascular disruption and blood-spinal cord barrier permeability following traumatic spinal cord injury[J]. Journal of Neurotrauma， 2014， 31（6）： 541-552.

[19] 譚榮鎊，魏 ?波，李廣盛. Nrf2-ARE調(diào)控神經(jīng)-血管交互作用參與脊髓損傷后的神經(jīng)修復(fù)[J].中國(guó)組織工程研究，2021，25（35）：5694-5701.

[20] 郭志強(qiáng)，劉云峰，王 ?佳，等.安宮牛黃丸聯(lián)合亞低溫對(duì)心臟驟停心肺復(fù)蘇后患者腦氧代謝率及氧化應(yīng)激損傷的影響[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，24（5）：20-23.

[21] 肖玉煥，韓 ?麗，李浩然，等.靈芝多糖防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展[J].中草藥，2020，51（24）：6391-6395.

[22] 孫忠人，徐思禹，李 ?全，等.近5年中藥治療脊髓損傷相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2019，26（11）：132-135.

[23] 汪湛東，毛忠南，張 ?娜，等.基于氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)探討中風(fēng)康復(fù)膏對(duì)腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護(hù)作用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2022，31（16）：15-19，52.

[24] BUOSI P， BORGHI F A， LOPES A M， et al. Oxidative stress biomarkers in treatment-responsive and treatment-resistant schi？鄄zophrenia patients[J]. Trends in Psychiatry and Psychotherapy， 2021， 43（4）： 278-285.

[25] 金曉雪，焦 ?凱，劉德敏.線粒體功能障礙與血管平滑肌細(xì)胞鈣化[J].中華高血壓雜志，2022，30（7）：633-637.

〔收稿日期〕2022-11-07

〔基金項(xiàng)目〕湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2022JJ30435，2018JJ2289）。

〔第一作者〕盧青青，女，碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。

〔通信作者〕*李 ?亮，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：superliliang@126.com。