左歸降糖清脂方對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病MKR鼠Visfatin信號分子的影響

勾陽陽 楊嬌嬌 向琴 喻嶸 陳聰

〔摘要〕 目的 探討左歸降糖清脂方對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病MKR鼠內(nèi)脂素（Visfatin）信號分子的影響。方法 8周齡MKR小鼠，按性別、空腹血糖、體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、中藥組、陽性藥物組；同齡C57/BL/6小鼠作為正常組；每組16只。除正常組、空白組外，其余小鼠高脂飼養(yǎng)8周。中藥組予左歸降糖清脂方溶液29.6 g/kg，陽性藥物組（二甲雙胍和辛伐他汀組成，比例為50∶1，給藥67.6 mg/kg），其余組予等體積蒸餾水（體積同中藥組），灌胃治療8周。心臟采血處死各組小鼠，采用電化學法檢測空腹血糖；常規(guī)生化法檢測肝功能、血脂；電鏡及HE染色觀察肝組織形態(tài)結構及病理變化；實時熒光定量檢測肝臟脂肪組織分泌激素類代謝調(diào)節(jié)因子Visfatin、視黃醇結合蛋白4（retinol binding protein4， RBP4）的mRNA表達水平；酶聯(lián)免疫法檢測血清炎癥因子血清可溶性白細胞介素-2受體（soluble interleukin-2 receptor， SIL-2R）、成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor2， FGF2）含量的變化。結果 與正常組比較，模型組肝細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯損傷以及大量脂肪堆積；空腹血糖，谷丙轉氨酶（alanine transaminase， ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、血脂含量，RBP4和Visfatin的mRNA表達水平，炎癥因子SIL-2R、FGF-2含量均升高（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，中藥組與陽性藥物組細胞損傷明顯改善，空腹血糖濃度降低（P<0.01），ALT、AST、血脂含量明顯下降（P<0.01），RBP4和Visfatin的mRNA表達水平降低（P<0.01），炎癥因子SIL-2R、FGF-2含量明顯下降（P<0.01）。與中藥組比較，陽性藥物組空腹血糖濃度降低（P<0.05），其余指標無差異。結論 左歸降糖清脂方可能通過改善肝功能、降低血脂、降低肝組織Visfatin及RBP4的mRNA表達水平、降低血清炎癥因子SIL-2R及FGF-2的含量，從而改善2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病肝臟的病理損傷。

〔關鍵詞〕 左歸降糖清脂方；2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病；內(nèi)脂素/內(nèi)臟脂肪素；視黃醇結合蛋白4

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ?〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.04.002

Effects of Zuogui Jiangtang Qingzhi Formula on the signaling molecules of visfatin of MKR mice with type 2 diabetes complicated with non-alcoholic fatty liver disease

GOU Yangyang1， YANG Jiaojiao1， XIANG Qin2， YU Rong2*， CHEN Cong1*

1. Guizhou University of Chinese Medicine， Guiyang， Guizhou 550025， China; 2. Hunan University of

Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of Zuogui Jiangtang Qingzhi Formula （ZGJTQZF） on the signaling molecules of Visfatin in MKR mice with type 2 diabetes complicated with non-alcoholic fatty liver disease. Methods Eight-week-old MKR mice were randomly divided into blank group， model group， Chinese medicine （ZGJTQZF） group and positive drug group according to gender， fasting blood glucose and body weight. C57/BL/6 mice of the same age were set as normal group. Sixteen rats were included in each group. Except for normal group and blank group， the other mice were fed with high fat diets for 8 weeks. The Chinese medicine group was given ZGJTQZF （29.6 g/kg）， the positive drug group was given metformin and simvastatin （50∶1， 67.6 mg/kg）， and the other groups were given equal volume of distilled water （the same volume of the Chinese medicine group） for 8 weeks. The mice in each group were sacrificed by cardiac blood collection， and fasting blood glucose was measured by electrochemical method. Liver function and blood lipid were determined by routine biochemical method. The morphological structure and pathological changes of liver tissue were observed by electron microscope and HE staining. The mRNA expression levels of Visfatin and retinol binding protein 4 （RBP4） in liver adipose tissue were examined by real-time fluorescence quantitative detection. The levels of serum soluble interleukin-2 receptor （SIL-2R） and fibroblast growth factor 2 （FGF2） were checked by enzyme-linked immunosorbent assay. Results Compared with the normal group， the liver cells in model group showed obvious damage and a large amount of accumulated fat. Fasting blood glucose， alanine transaminase （ALT）、 aspartate aminotransferase （AST）， blood lipids， RBP4 and Visfatin mRNA expression levels， inflammatory factors SIL-2R， FGF-2 content all increased （P<0.05 or P<0.01）; compared with model group， the cell damage in the positive drug group and Chinese medicine group was significantly improved， fasting blood glucose concentration decreased （P<0.01）; ALT， AST and blood lipids decreased significantly （P<0.01）， RBP4 and Visfatin mRNA expression levels decreased （P<0.01）， and the content of inflammatory factors SIL-2R， FGF-2 decreased significantly （P<0.01）. Compared with the Chinese medicine group， the fasting blood glucose concentration in the positive drug group decreased （P<0.05）， and there was no statistical difference in other indicators. Conclusion ZGJTQZF may alleviate the pathological damage of liver in MKR mice with type 2 diabetes complicated with non-alcoholic fatty liver disease by improving liver function， reducing blood lipids， reducing the mRNA expression levels of visfatin and RBP4 in liver tissue， and down-regulating the content of serum inflammatory factors SIL-2R and FGF-2.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Zuogui Jiangtang Qingzhi Formula; type 2 diabetes complicated with non-alcoholic fatty liver disease; Visfatin; retinol binding protein 4

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）的一種較為常見的肝臟并發(fā)癥，其發(fā)病率高達70%或以上[1-3]。高糖環(huán)境和胰島素抵抗（insulin

resistance， IR）是糖尿病及其并發(fā)癥的主因，而這兩種因素引起的一系列改變也是導致肝細胞損傷的重要因素[4-5]。血糖升高及IR可以激活多種機制，這些機制在肝細胞損傷、纖維化過程中發(fā)揮關鍵作用，其中以脂代謝障礙[6]、炎癥反應[7]、氧化應激[8]等為主。近年研究發(fā)現(xiàn)，在NAFLD肥胖患者中，脂肪組織分泌激素類代謝調(diào)節(jié)因子內(nèi)脂素（Visfatin）、視黃醇結合蛋白4（retinol binding protein4， RBP4），通過旁分泌作用參與胰島素抵抗的形成[9-10]。本課題組前期相關研究發(fā)現(xiàn)，滋陰益氣、活血解毒的左歸降糖清脂方能顯著降低MKR鼠血糖、改善糖耐量、改善胰島素抵抗，從而改善高脂MKR鼠肝功能損害，降低其血脂水平，調(diào)控胰島外周組織（脂肪、骨骼肌、肝臟等）中核因子過氧化物酶體增殖物激活受體α等的表達[11]。本文繼續(xù)探討左歸降糖清脂方對高脂飲食MKR鼠肝臟Visfatin、RBP4的mRNA表達水平及血清可溶性白細胞介素-2受體（soluble interleukin-2 receptor， SIL-2R）、成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor， FGF2）含量的影響，以期為中醫(yī)藥對T2DM合并NAFLD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?動物 ?骨骼肌特異性胰島素樣生長因子-1受體功能缺失鼠（MKR鼠），由美國國立衛(wèi)生研究院糖尿病研究中心提供的純合子MKR小鼠，由本課題組配種后繁殖的后代用于實驗研究。同齡健康SPF級C57/BL/6小鼠，購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK（湘）2014-0011，MKR鼠許可證號：SYXK（湘）2015-0003，飼養(yǎng)場地均為貴州中醫(yī)藥大學SPF級實驗動物中心，飼養(yǎng)籠具、飼料、飲水均符合SPF級要求，倫理審核編號：20200003。

1.1.2 ?高脂飼料 ?普通飼料加15%豬油、1%膽固醇組成。

1.1.3 ?主要試劑 ?熒光定量PCR試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，批號：H1021780）；小鼠SIL-2R、IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：12/2020、01/2020）。

1.1.4 ?主要儀器 ?PCR儀、實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司，型號：T100 thermal cycler、TL988-l）；石蠟切片機（金華惠友儀器有限公司，型號：HY1508）；酶標儀（美國Thermo Fisher儀器有限公司，型號：1510-01061C）。

1.1.5 ?藥物及制備 ?辛伐他汀片（山東魯抗醫(yī)藥集團賽特有限責任公司，批號：190202）；鹽酸二甲雙胍緩釋片（山東司邦德制藥有限公司，批號：190705）。左歸降糖清脂方由熟地黃12 g、黃芪18 g、山藥12 g、山茱萸12 g、黃連6 g、丹參9 g、茵陳15 g、虎杖12 g、郁金9 g、陳皮9 g組成。湯劑制備：經(jīng)水煎煮2次，混合過濾后，濃縮制備成含生藥濃度為2.96 g/mL的藥液，經(jīng)滅菌后置于4 ℃冰箱中備用。中藥均由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)王宇紅主任藥師鑒定均為正品。

1.2 ?方法

1.2.1 ?分組 ?選取8周齡的經(jīng)遺傳鑒定的MKR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（22±3） g，按性別、空腹血糖、體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、中藥組、陽性藥物組；同齡C57/BL/6小鼠為正常組，雌雄各半，體質(zhì)量（22±3） g。每組16只?？瞻捉M和正常組喂養(yǎng)普通飼料，造模組喂養(yǎng)高脂飼料。

1.2.2 ?造模 ?T2DM合并NAFLD模型用8周齡MKR鼠高脂喂養(yǎng)8周后可自發(fā)形成。本課題組采用MKR鼠高脂喂養(yǎng)形成T2DM合并NAFLD的模型，具有可行性和可重復性[11]。造模成功的標準：MKR鼠高脂飼養(yǎng)后，空腹血糖濃度升高、肝功能異常及血脂異常情況加?。挥^察肝臟病理損傷結構，MKR鼠肝組織炎癥細胞增多，肝細胞結構紊亂，符合T2DM合并NAFLD的病變特點。

1.2.3 ?給藥 ?用高脂飼料喂養(yǎng)達8周后，進行相應藥物灌胃。中藥組給藥為29.6 g/kg，濃度為2.96 g/mL，灌胃體積為0.1 mL/10 g。陽性藥物組：藥物由二甲雙胍和辛伐他汀組成，比例為50∶1，給藥67.6 mg/kg，濃度為6.76 mg/mL，灌胃體積為0.1 mL/10 g?？瞻捉M、模型組及正常組采用等體積蒸餾水進行灌胃，每24 h給藥1次，共給藥8周。

1.2.4 ?觀察項目與指標檢測 ?對小鼠行心臟采血，然后處死。對空腹血糖濃度進行測定，取血清，用常規(guī)生化法對肝功能中谷丙轉氨酶（alanine transaminase， ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase， AST）含量以及血脂中總膽固醇（total cholesterol， TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol， HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol， LDL-C）指標的含量進行檢測。分別取30～50 mg的肝組織，采用實時熒光定量法檢測Visfatin、RBP4；酶聯(lián)免疫法檢測血清炎癥因子（按照試劑盒說明書操作）；HE染色觀察各組小鼠肝組織的病理改變；取3 mm×3 mm×3 mm肝組織放于電鏡固定液中，電鏡觀察肝臟病理學改變。

1.2.5 ?實時熒光定量檢測 ?mRNA基因序列從NCBI網(wǎng)站搜索得到，由生工生物工程（上海）股份有限公司設計引物。詳見表1。采用Trizol法提取總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，將cDNA稀釋成3倍以備用。實時熒光定量反應中，設置4個Tm值的退火溫度梯度，分別為60、62、64、66 ℃，對于退火溫度先用梯度PCR反應測量，擴增用Real-time PCR。20 μL為反應體系，Real-time PCR反應程序：95 ℃，2 min，1×。95 ℃，15 s；58～62 ℃，1 min；40×。熔解的曲線：95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；溫度上升（20 min），95 ℃，15 s。

1.2.6 ?統(tǒng)計學分析 ?數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件處理，結果以“ｘ±s”表示。多個總體均值比較，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性，采用單因素方差分析；多個樣本均數(shù)的兩兩比較，滿足方差齊性檢驗者采用LSD檢驗，若不滿足則采用Dunnett T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?各組小鼠肝組織病理結構變化

正常組肝細胞結構排列整齊，炎性細胞較少甚至沒有；空白組肝細胞結構不整齊，存在變性；模型組肝細胞結構不整齊，變性增多，有壞死細胞，炎性細胞增多，細胞核減少，組織結構改變，肝組織纖維化；中藥組及陽性藥物組炎性細胞明顯減少，腫脹及纖維化不同程度減輕。詳見圖1。

2.2 ?各組小鼠肝組織超微結構的變化

電鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)正常組肝細胞內(nèi)少量的脂肪堆積，溶酶體周圍少量或者無脂肪顆粒；空白組脂肪顆粒增加，溶酶體周圍有少量脂肪顆粒；模型組內(nèi)大量脂肪堆積，溶酶體周圍大量脂肪顆粒；中藥組和陽性藥物組脂肪堆積明顯減少，溶酶體周圍少量或者無脂肪顆粒。詳見圖2。

2.3 ?各組小鼠空腹血糖濃度比較

與正常組比較，其余各組空腹血糖濃度升高（P<0.01）；與空白組比較，模型組空腹血糖濃度升高（P<0.01），中藥組、陽性藥物組空腹血糖濃度均降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組空腹血糖濃度均降低（P<0.01）；與中藥組比較，陽性藥物組空腹血糖濃度降低（P<0.05）。詳見表2。

2.4 ?各組小鼠血清ALT、AST含量比較

與正常組比較，其余各組ALT、AST含量均升高（P<0.05或P<0.01）；與空白組比較，模型組ALT、AST均升高（P<0.01），中藥組、陽性藥物組AST均降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組ALT、AST均降低（P<0.01）。中藥組與陽性藥物組ALT、AST比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表3。

2.5 ?各組小鼠血脂水平比較

與正常組比較，空白組和模型組TG、TC、LDL-C、HDL-C含量均升高（P<0.01），中藥組和陽性藥物組TC、LDL-C、HDL-C含量均升高（P<0.01）；與空白組比較，模型組、中藥組和陽性藥物組TG降低，TC、LDL-C、HDL-C含量均升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥組和陽性藥物組TG、TC、LDL-C下降，HDL-C升高（P<0.01）。中藥組與陽性藥物組TG、TC、LDL-C、HDL-C比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表4。2.6 ?各組小鼠肝組織RBP4、Visfatin的mRNA表達水平比較

與正常組比較，其余各組RBP4、Visfatin的mRNA表達水平均升高（P<0.01）；與空白組比較，模型組RBP4、Visfatin的mRNA表達水平均升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組RBP4、Visfatin的mRNA表達水平均降低（P<0.01）。中藥組與陽性藥物組RBP4、Visfatin的mRNA比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表5。

2.7 ?各組小鼠血清SIL-2R、FGF-2含量比較

與正常組比較，其余各組SIL-2R、FGF-2的含量均升高（P<0.01）；與空白組比較，模型組SIL-2R、FGF-2的含量均升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥組、陽性藥物組SIL-2R、FGF-2的含量均降低（P<0.01）。中藥組與陽性藥物組SIL-2R、FGF-2含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。詳見表6。

3 討論

Visfatin作用廣泛，與肥胖、糖脂代謝紊亂、肝臟疾病的發(fā)展相關[12-13]。RBP4已被證實在T2DM中誘導胰島素抵抗[14]。Visfatin、RBP4含量升高與胰島素抵抗及脂代謝紊亂等情況關聯(lián)密切，研究發(fā)現(xiàn)，血清中Visfatin、RBP4與TG、LDL-C均呈正相關[15]。脂肪細胞釋放的脂肪因子，不僅參與細胞胰島素信號的傳導，也促進炎癥因子的合成與分泌，研究發(fā)現(xiàn)，Visfatin與RBP4呈正相關[16]。Visfatin可促進成纖維細胞生長因子FGF2的基因表達，Visfatin的升高與幾種促炎介質(zhì)的上調(diào)有關，如白細胞介素-1（interleukin-1， IL-1）、白細胞介素-6（interleukin-6， IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8， IL-8）等[17]。研究發(fā)現(xiàn)，T2DM合并骨關節(jié)炎患者血清FGF2高表達，參與糖尿病骨關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展，有望通過阻斷或抑制FGF2的生成，預防或治療糖尿病骨關節(jié)炎[18]。在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者血清中，SIL-2R、IL-6、IL-8等炎癥因子升高[19]。SIL-2R在重型肝炎合并肝腎綜合征患者血清中明顯升高[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MKR小鼠肝組織中Visfatin、RBP4的mRNA表達升高，伴隨炎癥因子（FGF2、SIL-2R）含量的增高，從而誘發(fā)慢性炎癥，造成嚴重的肝損傷，左歸降糖清脂方干預后，細胞損傷明顯改善，空腹血糖濃度，血清中AST、ALT含量和血脂含量，RBP4和Visfatin的mRNA表達水平，炎癥因子SIL-2R、FGF-2含量均下降，故左歸降糖清脂方能改善T2DM合并NAFLD的肝損傷，緩解肝臟脂肪性病變。

T2DM合并NAFLD屬中醫(yī)學“消渴”“肝癖”“脅痛”“積聚”“痞滿”等范疇。相關學者研究認為痰、濕、濁、瘀、熱等內(nèi)生之毒，涵蓋脂毒、糖毒等物質(zhì)基礎，膠結壅滯，阻于肝絡，最終“因毒致?lián)p”“毒損肝絡”[11，21-23]。本課題組前期文獻、臨床、實驗等研究認為，T2DM合并NAFLD的主要中醫(yī)病機為肝腎陰虛、脾氣虧虛（虛），濕熱內(nèi)蘊、痰瘀互結（毒、瘀），與“因毒致?lián)p”“毒損肝絡”的病機認識具有一致性[11，22-23]。課題組以扶正祛邪為治則，以滋陰益氣、活血解毒立法，選用左歸降糖清脂方治療。滋陰益氣、活血解毒的左歸降糖清脂方化裁于明代醫(yī)家張景岳的左歸丸，方含熟地黃、黃芪、山藥、山茱萸、黃連、丹參、茵陳、虎杖、郁金、陳皮。重用黃芪為君藥，益氣健脾、利水去濁；陳皮理氣健脾、燥濕化痰；熟地黃補血滋陰、補精益髓以填腎之真陰；山藥和山茱萸能補肝腎；黃連清熱燥濕、瀉火解毒；丹參活血化瘀；茵陳清濕熱；虎杖清熱解毒、祛風利濕、散瘀定痛；郁金行氣活血。諸藥合用，共奏滋陰益氣、清熱利濕、化痰消瘀之功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪與山藥配伍[24]、黃芪單味[25]、黃芪有效成分黃芪甲苷[26]等均有改善糖尿病及其并發(fā)癥病理損害的作用。左歸降糖清脂方具有滋陰益氣、活血解毒之效，從根本上降低炎癥反應及肝組織炎癥因子Visfatin、RBP4的mRNA表達水平及血清FGF2和SIL-2R含量，從而改善肝損傷，緩解肝臟脂肪性病變。但T2DM合并NAFLD的分子機制復雜，目前未完全闡明。左歸降糖清脂方對其他分子機制的影響，可在今后的研究中進一步探討。

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〔收稿日期〕2022-08-28

〔基金項目〕國家自然科學基金項目（81860818，82004185）；貴州省科學技術廳科技基金（黔科合基礎-ZK〔2021〕一般501）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學技術研究專項課題（QZYY-2022-010）；2021年貴州省衛(wèi)生健康委科學技術基金；貴州中醫(yī)藥大學糖脂代謝病研究中心資助。

〔第一作者〕勾陽陽，女，碩士研究生，研究方向：內(nèi)分泌疾病的中醫(yī)辨證規(guī)律及其防治研究。

〔通信作者〕*陳 ?聰，女，博士，副教授，碩士研究生導師，E-mail：781972863@qq.com；喻 ?嶸，女，博士，教授，博士研究生導師，E-mail：yurong8072@qq.com。