鰻鱺圓環(huán)病毒SYBR Green I qPCR檢測方法的建立與應(yīng)用

林而舒

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州 350000)

鰻鱺(Anguillaapp.)是我國淡水養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟品種，因其具有營養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮美等特點，深受消費者喜愛[1]。但是隨著集約化養(yǎng)殖模式的不斷發(fā)展，鰻鱺養(yǎng)殖過程中的病害種類越來越多，危害也日趨嚴重。其中以鰻鱺病毒性疾病危害特別嚴重，具有發(fā)病急、病程短和死亡率高等特點，給養(yǎng)鰻業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]。鰻鱺病毒性病原主要包括：鰻鱺皰疹病毒(Anguillidherpesvirus)[3]、鰻鱺圓環(huán)病毒(Eelcircovirus，EeCV)[4]、鰻鱺雙RNA病毒(Eelviruseuropean)[5]等。

EeCV是引起鰻鱺圓環(huán)病毒病的主要病原，患病病鰻呈現(xiàn)紅頭、爛鰓后“開窗”、喉部囊腫等癥狀。EeCV為小型的、裸露的環(huán)狀單鏈DNA病毒，其結(jié)構(gòu)為二十面體病毒粒子，直徑大小為12～26 nm，衣殼僅由1種結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白)組成。EeCV基因組大小在1.7～2.3 kb之間[6，7]，有一個雙義的基因組，包含兩個主要的開放閱讀框(ORF)，以相反的方向排列，編碼復(fù)制啟動蛋白和衣殼蛋白。在主要ORF的5′端之間有一個非常保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)位，在病毒復(fù)制中起著重要作用[7]。在過去的研究中，只有禽類和豬被認為是圓環(huán)病毒的常見宿主，但近幾年隨著檢測技術(shù)的不斷進步，發(fā)現(xiàn)圓環(huán)病毒的脊椎動物宿主譜已經(jīng)擴大至魚類和兩棲動物[8-11]。

國內(nèi)外關(guān)于EeCV的研究均處于起步階段[12，13]，關(guān)于EeCV檢測方法的報道則更少，李苗苗[4]在2018年報道過EeCV PCR檢測方法的建立與應(yīng)用，BORZK等[12]利用巢式PCR技術(shù)對EeCV進行檢測。本研究設(shè)計了多對qPCR引物，篩選出一對能夠高效且特異擴增EeCV復(fù)制相關(guān)蛋白基因(replication-associated protein，RAP)部分序列的引物，基于該基因序列建立了EeCV SYBR Green I qPCR檢測方法，以期為準確、快速地定量檢測鰻鱺圓環(huán)病毒提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

具有鰻鱺圓環(huán)病毒病典型特征的患病魚取自福建省大田、邵武、福清、光澤和江西武寧、吉安等地區(qū)的鰻鱺養(yǎng)殖場。將病鰻裝在塑料袋中充氧，2～3 h內(nèi)運達實驗室，迅速活殺，取病魚的血液、粘液、鰓、心、肝、脾、腸、腎組織等保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑

Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion2.0plus dye)試劑盒、TBGreen?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；海洋動物基因組DNA提取試劑盒、血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；ONE-4-ALL基因組DNA小量提取試劑盒和MightyScript第一鏈cDNA合成Master Mix試劑盒購于BBI生命科學(xué)有限公司；pUCm-T載體PCR產(chǎn)物快速連接試劑盒、DNA Marker、DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。豬圓環(huán)病毒(Porcinecircovirus)FN毒株DNA由福建農(nóng)林大學(xué)動科院饋贈，鴨圓環(huán)病毒(Duckcircovirus)FJ毒株DNA由福建省農(nóng)科院饋贈，鰻鱺皰疹病毒(Anguillidherpesvirus)AnHV毒株DNA和羅非魚湖病毒(Tilapia lake virus)TiLV毒株RNA由福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站饋贈，維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)、遲鈍愛德華菌(Edwardsiellatarda)和鰻鱺(Anguillajaponica)基因組由實驗室自行分離提取，-80 ℃保存。

1.3 主要儀器

普通PCR儀(T100TMThermal Cycler，BIO-RAD)、qPCR儀(7500 Real Time PCR System，ABI)、超微量紫外可見分光光度計(BioDrop μlite+，BioDrop)、凝膠成像分析系統(tǒng)(Gel DocTM XR+，BIO-RAD)等。

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中鰻鱺圓環(huán)病毒參考株(KU951579.1)的基因組序列設(shè)計特異性擴增RAP序列的普通PCR引物對RAP-F/R，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計優(yōu)選SYBR Green I qPCR引物對qF/R(表1)。Lmm-F/R參考文獻[4]。

表1 引物列表Tab.1 Primer list

1.5 質(zhì)粒標準品的制備

取肝、腎、脾和鰓等混合組織病料20 mg，使用海洋動物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。用引物RAP-F/RAP-R對總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；厥占兓康钠魏螅缮虾Ｉす具M行測序驗證。

將目的片段克隆至pUCm-T載體，用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA后，進行測序鑒定，獲得質(zhì)粒pUCm-T-RAP，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；用超微量紫外分光光度計測定其濃度和純度，并計算單位體積(μL)DNA樣品中質(zhì)粒的拷貝數(shù)，計算方式參考文獻[2]。

1.6 qPCR檢測方法的建立

1.6.1 建立標準曲線

10倍比稀釋質(zhì)粒pUCm-T-RAP DNA至1.0×108～100個拷貝數(shù)/μL作為模板，共計9個濃度梯度。使用TBGreen?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒進行qPCR擴增，引物為qF/qR，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)，陰性對照用ddH2O代替模板，制作標準曲線。qPCR反應(yīng)體系總量為20 μL：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，Dye II 0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.6.2 靈敏性檢測

將pUCm-T-RAP質(zhì)粒DNA梯度稀釋作為模板，分別進行qPCR和普通PCR擴增，qPCR方法使用的引物為qF/qR，普通PCR法使用的引物為Lmm-F/R，以便分析2種方法所能檢測的最低EeCV拷貝數(shù)。

普通PCR反應(yīng)體系總量為20 μL：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃再延伸10 min。

1.6.3 特異性檢測

將鰻鱺皰疹病毒、豬圓環(huán)病毒、鴨圓環(huán)病毒、羅非魚湖病毒、鰻鱺、遲鈍愛德華菌和維氏氣單胞菌的基因組作為模板進行qPCR擴增，評價檢測方法的特異性。其中羅非魚魚湖病毒為RNA病毒，需將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA再進行qPCR，反轉(zhuǎn)錄體系總量為20 μL：2×Mix 10 μL，模板6 μL，ddH2O 4 μL；反轉(zhuǎn)錄程序為：25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.6.4 重復(fù)性檢測

取1.0×106、1.0×105、1.0×104個拷貝數(shù)/μL的pUCm-T-RAP質(zhì)粒DNA和臨床樣品作為模板進行qPCR擴增，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，根據(jù)閾值循環(huán)數(shù)(Cycle threshold value，Ct值)的變異系數(shù)分析該方法的組內(nèi)重復(fù)性；實驗重復(fù)3次，分析組間重復(fù)性。

1.7 qPCR檢測方法在臨床樣品的應(yīng)用

選取8尾患圓環(huán)病毒病的美洲鰻鱺，分別收集其皮膚黏液、鰭、鰓、肝臟、腎臟、脾臟、腸道和心臟等重要組織，用海洋動物基因組DNA提取試劑盒總DNA作為模板，用建立的qPCR方法分別檢測不同病鰻不同組織部位的圓環(huán)病毒載量，分析病毒在不同組織的分布狀況。實驗數(shù)據(jù)使用Excel進行統(tǒng)計和整理，用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行差異顯著性分析。

用建立的qPCR方法和普通PCR法對44份疑似感染鰻鱺圓環(huán)病毒的鰻鱺組織樣品進行檢測。qPCR方法使用的引物為qF/qR，普通PCR法使用的引物為Lmm-F/R，比較兩種方法的檢出率。檢測實驗重復(fù)3次，并各抽取5份陽性檢測產(chǎn)物送往上海生工測序，其中qPCR陽性產(chǎn)物需先克隆至pUCm-T載體再進行測序。

2 結(jié)果

2.1 標準質(zhì)粒的構(gòu)建

從感染鰻鱺圓環(huán)病毒的病料中提取總DNA作為模板，用引物對RAP-F/R進行擴增，得到861 bp的片段(圖1)。經(jīng)測序分析顯示，擴增獲得的EeCV-RAP與GenBank中的EeCV參考株(KU951579.1)replication-associated protein的序列完全一致。進一步將該片段克隆至載體，經(jīng)單酶切和測序鑒定，獲得重組質(zhì)粒pUCm-T-RAP。

圖1 EeCV RAP的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of EeCV RAPM：DL2000 DNA marker，1：EeCV-RAP，2：陰性對照。

2.2 EeCV SYBR Green I qPCR 標準曲線的建立

10倍比稀釋質(zhì)粒pUCm-T-RAP DNA至為1.0×108～102拷貝數(shù)/μL作為模板，進行qPCR擴增，繪制Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的lg對數(shù)之間的標準曲線。Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的lg對數(shù)的線性關(guān)系為y=-2.853 6x+31.999，相關(guān)系數(shù)R2為0.995 1(圖2)，表明該qPCR方法的Ct值與1.0×108～102拷貝數(shù)/μL標準質(zhì)粒有較好的線性關(guān)系。1.0×108～102/μL標準質(zhì)粒的熔解曲線均只有一個熔解峰，熔解溫度區(qū)間為82.24～83.15 ℃(圖3)，表明qPCR反應(yīng)產(chǎn)物均為圓環(huán)病毒的特異性擴增產(chǎn)物，并無非特異性擴增或引物二聚體產(chǎn)生。

圖2 EeCV SYBR Green I qPCR檢測的標準曲線Fig.2 Standard curve plot of the EeCV SYBR Green I qPCR assay

圖3 EeCV SYBR Green I qPCR檢測的熔解曲線Fig.3 Metting curve of the EeCV SYBR Green I qPCR assay

2.3 EeCV SYBR Green I qPCR的靈敏性、特異性和重復(fù)性檢測

將pUCm-T-RAP梯度稀釋至1.0×108～100拷貝數(shù)/μL作為模板，分別進行SYBR Green I qPCR和普通PCR擴增。結(jié)果顯示，普通PCR的最低檢出拷貝數(shù)為1 000拷貝數(shù)/μL(圖4a)，1.0×102～100拷貝數(shù)/μL無法擴增；而SYBR Green I qPCR的最低檢出拷貝數(shù)可達100拷貝數(shù)/μL，1.0×101～100拷貝數(shù)/μL無法擴增(圖4b)；SYBR Green I qPCR法比普通PCR法的靈敏性高10倍。

圖4 普通PCR和SYBR Green I qPCR檢測靈敏度Fig.4 Sensitivity of conventional PCR assay and SYBR Green I qPCR assay in detection of EeCVa：EeCV普通PCR的檢測靈敏性，M：DL2000 DNA marker，1～9：108～100個拷貝的重組質(zhì)粒，10：陰性對照；b：EeCV SYBR Green I qPCR的檢測靈敏性，1～9：108～100個拷貝的重組質(zhì)粒，10：陰性對照。

以鰻鱺皰疹病毒、豬圓環(huán)病毒、鴨圓環(huán)病毒、羅非魚湖病毒、鰻鱺、遲鈍愛德華菌和維氏氣單胞菌的基因組和pUCm-T-RAP為模板，進行SYBR Green I qPCR擴增的特異性檢測。pUCm-T-RAP有擴增曲線產(chǎn)生，而鰻鱺皰疹病毒、豬圓環(huán)病毒、鴨圓環(huán)病毒、羅非魚病毒和陰性對照均無擴增信號(圖5)，表明SYBR Green I qPCR擴增法具有良好的特異性。

圖5 EeCV SYBR Green I qPCR檢測特異性Fig.5 Detection specificity of the EeCV SYBR Green I qPCR assay1：EeCV，2：Anguillid herpesvirus，3：Duck circovirus，4：Tilapia lake virus，5：Porcine circovirus，6：Anguilla japonica，7：Edwardsiella tarda，8：Aeromonas veronii，9：陰性對照。

取3個不同濃度的pUCm-T-RAP標準品(1.0×106、1.0×105、1.0×104個拷貝數(shù)/μL)和1個臨床樣品作為模板進行qPCR擴增，檢測SYBR Green I qPCR方法的重復(fù)性。組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于3%，組內(nèi)變異系數(shù)分別為2.24%、1.66%、2.82%和0.41%；組間變異系數(shù)分別為2.66%、2.01%、2.39%和1.59%(表2)，表明SYBR Green I qPCR方法的檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和可靠性，重復(fù)效果好。

表2 EeCV SYBR Green I qPCR的重復(fù)性Tab.2 Detection repeatability of the EeCV SYBR Green I qPCR

2.4 EeCV SYBR Green I qPCR方法的應(yīng)用

用建立的EeCV SYBR Green I qPCR方法檢測感染圓環(huán)病毒的鰻鱺體內(nèi)不同組織的病毒載量差異，結(jié)果顯示，在鰻鱺的肝臟、皮膚黏液、腎臟、鰭、脾臟、腸道、心臟和鰓均可檢測到EeCV，并且在鰓部的EeCV含量顯著高于其他組織(圖6)。

圖6 EeCV感染鰻鱺主要組織內(nèi)EeCV的分布情況Fig.6 Distribution of EeCV in the primary tissues of eels infected with EeCV1：肝臟，2：皮膚黏液，3：腎臟，4：鰭，5：脾臟，6：腸道，7：心臟，8：鰓。

用普通PCR法和建立的EeCV SYBR Green I qPCR方法對實驗室收集的44份疑似鰻鱺病毒感染病料進行檢測。結(jié)果顯示，普通PCR法共檢出32份陽性樣品，陽性檢出率為73%；而SYBR Green I qPCR法檢出43份陽性樣品，陽性檢出率為98%。實驗重復(fù)3次，結(jié)果均一致，PCR法檢出的樣品，qPCR法都能檢出。并各抽取5份陽性檢測產(chǎn)物進行測序分析，其中qPCR陽性產(chǎn)物需先克隆至pUCm-T載體再進行測序。測序結(jié)果確為EeCV基因序列，排除假陽性干擾，表明SYBR Green I qPCR法比普通PCR法更為靈敏。

3 討論

圓環(huán)病毒最開始是從豬和鸚鵡體內(nèi)檢測到的[14，15]，后來隨著檢測技術(shù)的不斷進步，從低脊椎動物和無脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)大量和圓環(huán)病毒的相關(guān)序列[10，12，16]。ANDOR等[13]在2014年從歐洲鰻鱺身上分離得到的了一株新型圓環(huán)病毒，并進行全基因組測序，其臨床病變特征為頭部區(qū)域出現(xiàn)乳頭狀腫瘤。其實歐洲鰻鱺的這種病變早在20世紀初的北歐河流的支流地區(qū)就已經(jīng)出現(xiàn)過[17]。目前國內(nèi)養(yǎng)殖的鰻鱺品種感染圓環(huán)病毒的臨床癥狀與上述歐洲鰻鱺的臨床癥狀不盡相同，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為爛鰓后“開窗”、紅頭、喉部囊腫，發(fā)病癥狀酷似鰻鱺皰疹病毒感染出現(xiàn)的脫黏、敗血、紅頭等現(xiàn)象[18]。

由于過往對鰻鱺圓環(huán)病毒病認識不深且診斷技術(shù)較為落后，該病毒性疾病未能被準確診斷，也未能引起重視，但近幾年隨著診斷技術(shù)的不斷提升，鰻鱺圓環(huán)病毒的檢出陽性率似乎在逐漸提高，如李苗苗[4]2018年在160份福建省鰻鱺樣品中陽性檢出率就高達40.6%。這也說明圓環(huán)病毒可能比之前預(yù)想的要廣泛存在。因此建立高效、準確的檢測手段對防控鰻鱺圓環(huán)病毒病有重要意義。SYBR Green I qPCR檢測方法廣泛應(yīng)用于病原檢測，目前圓環(huán)科中的鴿圓環(huán)病毒(Pigeoncircovirus)[19]、豬圓環(huán)病毒[20]、鴨圓環(huán)病毒[21]和犬圓環(huán)病毒(Caninecircovirus)[22]都已建立SYBR Green I qPCR方法，其中豬圓環(huán)病毒不僅1型[20]、2型[23]、3型[24]和4型[25]都分別建立了熒光定量PCR檢測法，甚至還拓展出了雙重?zé)晒舛縋CR法[26]和三重?zé)晒舛縋CR法[27]，大大提升了豬圓環(huán)病毒的陽性檢出率。

而鰻鱺圓環(huán)病毒目前僅建立了普通PCR檢測法，還存在無法準確定量、低拷貝病毒無法準確檢測等缺點[19]。為解決上述問題，本研究基于SYBR Green I qPCR檢測方法的快速、準確、操作簡單和易于實現(xiàn)的特點[2]，建立了EeCV SYBR Green I qPCR檢測方法。在該方法中，其標準曲線的相關(guān)系數(shù)可達0.995 1，線性范圍廣(1.0×108～102拷貝數(shù)/μL)，這與其它類別圓環(huán)病毒構(gòu)建的熒光定量法線性范圍類似，如豬圓環(huán)病毒4型檢測下限為5.64×102copies/μL[25]，犬圓環(huán)病毒的Ct值與標準品在6.18×109～6.18×102copise/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系[22]；重復(fù)性好，組內(nèi)和組間變異系數(shù)都小于3%；靈敏性高，是普通PCR法的10倍，在臨床應(yīng)用上的結(jié)果也表明qPCR方法對疑似EeCV樣品的陽性檢出率遠高于普通PCR法；特異性強，與其近緣DNA病毒(豬圓環(huán)病毒、鴨圓環(huán)病毒)無交叉擴增，和鰻鱺其它常見病毒(鰻鱺皰疹病毒)也無交叉擴增；在感染EeCV的鰻鱺重要組織中，鰓的病毒量顯著高于其他組織(P<0.05)，與鰻鱺圓環(huán)病毒病會出現(xiàn)爛鰓的主要臨床特征相吻合；對保存的44份疑似鰻鱺病毒性感染病料進行檢測，陽性檢出率為98%，也表明了該檢測方法具有較好的實際應(yīng)用效果。其它病毒建立的熒光定量方法也存在臨床樣品陽性檢出率高于普通PCR的情況，鴿圓環(huán)病毒熒光定量PCR方法對臨床樣品陽性率達75.7%，高于常規(guī)PCR方法的檢測陽性率(54.1%)[19]；鴨圓環(huán)病毒實時熒光定量PCR方法檢出率為26.4%，明顯優(yōu)于常規(guī)PCR檢測結(jié)果15.3%[21]。

綜上所述，EeCV SYBR Green I qPCR為準確、快速地定量檢測臨床樣品中的EeCV提供了新方法，可應(yīng)用于EeCV病的診斷和流行病學(xué)研究。