雜交鱘源溫和氣單胞菌的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究

彭小倩，任朝穎，鄧雪玥，劉曉云，詹澤玉，張雪揚(yáng)，鄭永華，朱成科

(1.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，重慶 402460；2.西南大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 402460)

雜交鱘(Acipenserbaerii♀ ×A.schrencki♂)作為一種名優(yōu)亞冷水魚類，肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛。其對(duì)水溫變化的適應(yīng)能力較強(qiáng)，屬雜食性魚類，養(yǎng)殖難度較低。隨著我國(guó)雜交鱘養(yǎng)殖技術(shù)的日益成熟，其養(yǎng)殖范圍和養(yǎng)殖規(guī)模均日益擴(kuò)大。根據(jù)2022年中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒[1]，2021年我國(guó)鱘養(yǎng)殖年總產(chǎn)量為1.219×105t，其中雜交鱘的養(yǎng)殖年總產(chǎn)量占鱘年養(yǎng)殖量的80以上。隨著雜交鱘大規(guī)模和工廠化養(yǎng)殖的發(fā)展，病毒性、細(xì)菌性、真菌性以及寄生蟲疾病等各種疾病時(shí)有發(fā)生，其中細(xì)菌性疾病是造成養(yǎng)殖過程中雜交鱘大規(guī)模死亡的主要原因，給養(yǎng)殖戶帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了雜交鱘健康養(yǎng)殖的發(fā)展。近十年來國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的引發(fā)鱘細(xì)菌性疾病的病原菌主要有維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[2]、魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)[3]、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)[4]、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[5]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[6]、嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)[7]等。但溫和氣單胞菌感染雜交鱘的案例還未曾被報(bào)道過。

溫和氣單胞菌(A.sobria)作為一種條件致病菌，在水溫升高、水質(zhì)惡化的條件下不僅可引發(fā)魚類大規(guī)模死亡，而且還可與其他病原體混合感染水生動(dòng)物引發(fā)疾病。溫和氣單胞菌作為人-獸-魚共患病病原菌，其感染人類后會(huì)引發(fā)壞死性筋膜炎等疾病[8，9]，嚴(yán)重危害人類健康。近年來發(fā)生多起水產(chǎn)動(dòng)物感染溫和氣單胞菌患病死亡的案例，如：草魚(Ctenopharyngodonidella)肝胰臟病變死亡[10]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)內(nèi)臟充血死亡[11]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)患“腹水癥”死亡[12]。

2022年8月，重慶市彭水縣某養(yǎng)殖場(chǎng)雜交鱘出現(xiàn)行動(dòng)緩慢、體表及內(nèi)臟充血等癥狀，引發(fā)大量死亡，累計(jì)死亡率達(dá)10%～15%。本研究從患病的雜交鱘體內(nèi)分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌株，并對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，探究了其生長(zhǎng)曲線、耐受性、毒力基因、藥物敏感性等生物學(xué)特性，以期探明雜交鱘的患病原因，為該病的防治提供理論基礎(chǔ)，也為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病防治積累研究資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

本實(shí)驗(yàn)患病的雜交鱘來自重慶市彭水縣某鱘養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖水體水溫20.6～22.1 ℃，溶氧5.9～6.8 mg/L，pH為7.4～7.8；體長(zhǎng)29.4～42.2 cm，體質(zhì)量88.2～230.5 g。用于人工回歸感染的健康雜交鱘從四川省成都市四川潤(rùn)兆漁業(yè)有限公司購(gòu)入，體質(zhì)量(56.65±8.13)g，體長(zhǎng)(20.65±2.1)cm；于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)14 d，養(yǎng)殖水溫20.5～22.1 ℃，溶解氧5.5～7.2 mg/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

PCR試劑盒購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，基因組DNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，LB培養(yǎng)基和MH培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物有限公司，細(xì)菌微量生化反應(yīng)管和藥敏紙片購(gòu)于杭州微生物科技有限公司。

1.3 病原菌的分離純化

在無菌條件下將瀕臨死亡的患病雜交鱘體表消毒后解剖，觀察病灶組織。用無菌接種環(huán)蘸取腹水及內(nèi)臟病灶組織處，于LB培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢(shì)菌落純化培養(yǎng)3次后，將菌液與甘油以6∶4的比例混勻后置于-80 ℃保存。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)及生理生化鑒定

將分離得到的優(yōu)勢(shì)菌株接種于LB培養(yǎng)基平板和綿羊血平板中，觀察菌落形態(tài)及溶血性。挑取24 h培養(yǎng)的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，將菌液接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中，置于28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定麥芽糖、甘露醇、吲哚等17項(xiàng)生理生化指標(biāo)，結(jié)果參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定

使用DNA提取試劑盒獲得該菌株的基因組樣本，以該樣本為模板擴(kuò)增16SrDNA基因和gyrB基因，擴(kuò)增引物信息如表1所示。PCR反應(yīng)體系：基因組模板1 μL、rTaq酶0.5 μL、上下游引物各1 μL、dNTPs 2 μL，10×Buffer 2 μL、ddH2O 17.5 μL；PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性30 s、退火溫度分別為56 ℃和60 ℃持續(xù)30 s、72 ℃延伸80 s，循環(huán)35次，72 ℃終止延伸10 min，4 ℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%凝膠電泳檢測(cè)合格后，送至華大基因生物公司進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)，最后使用MEGA 10.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 擴(kuò)增菌株A20基因組管家基因及毒力基因引物Tab.1 Primers of housekeeping genes and virulence genes of strain A20

1.5 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參照王家川等[14]的方法，通過調(diào)節(jié)過夜培養(yǎng)的待測(cè)菌液濃度，使其在600 nm處吸光度值為0.5，將調(diào)節(jié)濃度后的菌液以1%的含量接種于LB液體培養(yǎng)基中，置于180 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，連續(xù)24 h每隔1 h測(cè)定菌液在600 nm處吸光度值。

1.6 耐受性實(shí)驗(yàn)

1.6.1 pH耐受

調(diào)節(jié)過夜培養(yǎng)的待測(cè)菌液濃度，使其在600 nm處吸光度值為0.5，將菌液以1%的含量接種于pH分別為3、5、7、9、11的LB液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、18、24 h后測(cè)定菌液在600 nm處吸光度值。

1.6.2 鹽度耐受

將調(diào)節(jié)好濃度的菌液以1%的含量接種于NaCl含量分別為0、1%、2%、4%、8%的LB液體培養(yǎng)基中于180 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、18、24 h后測(cè)定菌液在600 nm處吸光度值。

1.6.3 溫度耐受

將調(diào)節(jié)好濃度的菌液以1%的含量接種于LB液體培養(yǎng)基中，分別置于14、21、28、35、42 ℃恒溫?fù)u床中，180 r/min培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12、18、24 h后測(cè)定菌液在600 nm處吸光度值。

1.7 毒力基因檢測(cè)

以該菌株基因組DNA為模板，擴(kuò)增已報(bào)道的溫和氣單胞菌毒力基因：外膜蛋白基因(ompA)、溶血素基因(hlyA)、細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)、細(xì)胞毒性腸毒素基因(act)、氣溶素基因(aerA)[2，15]。引物詳細(xì)信息如表1所示，PCR反應(yīng)體系及程序參照1.4.2，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%凝膠電泳檢測(cè)目的基因。

1.8 人工感染實(shí)驗(yàn)

將接種于LB固體培養(yǎng)基上的待測(cè)菌株置于28 ℃培養(yǎng)24 h，無菌條件挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)好的菌液4 000 r/min、4 ℃離心5 min，倒掉上清液，使用0.65%無菌生理鹽水洗脫細(xì)菌。通過麥?zhǔn)媳葷岱ê推桨逵?jì)數(shù)法調(diào)節(jié)菌液濃度為1.3×106、1.3×107、1.3×108、1.3×109CFU/mL，分別注射15尾健康雜交鱘幼魚，每尾注射200 μL，連續(xù)7 d觀察記錄實(shí)驗(yàn)魚情況，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.9 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法檢測(cè)該菌株對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、青霉素等24種抗生素的藥物敏感性，調(diào)節(jié)過夜培養(yǎng)的待測(cè)菌液濃度為1.3×108CFU/mL，取100 μL菌液均勻涂布于MH培養(yǎng)基平板上，將藥敏紙片貼于平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(CLSI-M100-S19)判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病魚癥狀

患病雜交鱘游泳能力下降，行動(dòng)遲緩，攝食降低，離群獨(dú)游；鏡檢鰓絲和皮膚體表無寄生蟲附著；體表分泌粘液增多，腹部和吻部出血，體表及鰭條基部充血(圖1a)；腹腔內(nèi)有腹水、內(nèi)臟充血，腸道出血，后腸嚴(yán)重充血、紅腫壞死(圖1b)。

圖1 患病雜交鱘臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms of diseased hybrid sturgeon

2.2 細(xì)菌形態(tài)及理化特征

從患病雜交鱘腹水中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌株，命名為A20，該菌株在LB固體培養(yǎng)基上呈中間凸起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的白色或淡黃色不透明菌落(圖2a)。革蘭氏染色結(jié)果表明，菌株A20為革蘭氏陰性菌，菌體呈紅色短桿狀。溶血性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株A20周圍出現(xiàn)透明溶血圈，具有β溶血性(圖2b)。生理生化實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果如表2所示，除鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)株不符外，其余各項(xiàng)結(jié)果基本符合溫和氣單胞菌的特征，初步鑒定菌株A20為氣單胞菌屬(Aeromonaspp.)溫和氣單胞菌(A.sobria)。

圖2 菌株A20菌落形態(tài)(a)及溶血性(b)Fig.2 Colony morphology(a)and hemolysis(b)of strain A20

表2 菌株A20生理生化特征Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain A20

2.3 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株A20的16SrDNA基因及gyrB基因測(cè)序結(jié)果與Blast基因庫(kù)比對(duì)，結(jié)果表明菌株A20與已知溫和氣單胞菌序列16SrDNA基因序列(MT730019.1)相似性為99.57%和與已知gyrB基因序列(MG263557.1)相似性為99.77%。菌株A20的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明菌株A20為溫和氣單胞菌。

圖3 基于菌株A20 16S rDNA基因序列(A)、gyrB基因序列(B)分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Construction of phylogenetic tree based on the 16S rDNA gene sequence(A)and gyrB gene sequence(B)of strain A20

2.4 生長(zhǎng)曲線

菌株A20生長(zhǎng)狀況如圖4。在培養(yǎng)0～3 h時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，4～7 h時(shí)菌株A20處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，7 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，從18 h開始菌株A20進(jìn)入衰亡期。

圖4 菌株A20在24 h內(nèi)生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of strain A20 within 24 h

2.5 耐受性

菌株A20在不同pH條件下生長(zhǎng)情況如圖5。菌株A20在pH為7的環(huán)境中生長(zhǎng)狀況良好，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境pH為3、5、9、11時(shí)，生長(zhǎng)24 h后600 nm處吸光度值均小于0.2，此時(shí)菌株A20生長(zhǎng)極為緩慢。

圖5 菌株A20在不同pH條件下在600 nm處吸光度值Fig.5 Absorbance values of strain A20 at 600 nm under different pH conditions

菌株A20在不同鹽度條件下生長(zhǎng)情況如圖6所示，總體上隨著NaCl濃度的升高，菌株A20 的吸光度值逐漸降低；NaCl濃度為4%時(shí)，OD600 nm明顯下降，此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)被抑制；當(dāng)NaCl濃度為8%時(shí)，OD600 nm均小于0.2，此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)極為緩慢。

圖6 菌株A20在不同膽鹽濃度條件下在600 nm處吸光度值Fig.6 Absorbance values of strain A20 at 600 nm under different bile salt concentration conditions

菌株A20在不同溫度條件下生長(zhǎng)情況如圖7。當(dāng)溫度在28 ℃和35 ℃時(shí)，菌株A20生長(zhǎng)狀況良好；當(dāng)在21 ℃和42 ℃條件下，OD600 nm略微有所下降；當(dāng)在14 ℃條件下，OD600 nm明顯降低，細(xì)菌生長(zhǎng)明顯減緩。

圖7 菌株A20在不同溫度條件下在600 nm處吸光度值Fig.7 Absorbance values of strain A20 at 600 nm under different temperature conditions

2.6 毒力基因

根據(jù)已知毒力基因引物(表1)擴(kuò)增菌株A20基因組，經(jīng)電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果如圖8，電泳結(jié)果顯示PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增出基因片段，且片段長(zhǎng)度分別與目標(biāo)基因片段大小相符合。毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明菌株A20含有hlyA、ompA、alt、aer 4種毒力基因。

圖8 菌株A20 4個(gè)毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 PCR amplification results of four virulence genes of strain A20M：Marker DL2000；1：hlyA；2：ompA；3：alt；4：aer；N：陰性對(duì)照。

2.7 人工感染實(shí)驗(yàn)

不同濃度的菌株A20腹腔注射健康的雜交鱘幼魚，累積死亡率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖9所示。人工感染溫和氣單胞菌7 d后，1.3×109CFU/mL濃度注射組第2 d雜交鱘出現(xiàn)死亡，第3天全部死亡；1.3×108CFU/mL濃度注射組3天出現(xiàn)死亡，第6天全部死亡；1.3×107CFU/mL濃度注射組第3天開始出現(xiàn)死亡，7 d累積死亡率為46.66%；1.3×106CFU/mL濃度注射組第4 d開始死亡，7 d累積死亡率為13.33%；對(duì)照組累積死亡率為0。注射菌株A20后感染死亡的雜交鱘幼魚出現(xiàn)與患病雜交鱘相同的癥狀，體表、鰭條基部出血，內(nèi)臟出血等。從發(fā)病瀕死的雜交鱘體內(nèi)重新劃線培養(yǎng)病原菌，分離純化后經(jīng)生理生化和分子生物學(xué)鑒定得到與菌株A20相同的菌株。以上結(jié)果結(jié)合改良寇氏法可知，菌株A20感染雜交鱘幼魚7 d半致死濃度為1.37×107CFU/mL。

圖9 菌株A20人工感染累積死亡率Fig.9 Cumulative mortality rate of artificial infection of strain A20

2.8 藥敏實(shí)驗(yàn)

菌株A20對(duì)氟苯尼考、頭孢他啶等24種抗菌藥物的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3。菌株A20對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、羧芐西林、呋喃妥因等15種抗菌藥物高度敏感；對(duì)頭孢氨芐、復(fù)方新諾明、新霉素3種抗生素中度敏感；對(duì)吉他霉素、麥迪霉素、青霉素、氨芐西林、磺胺異惡唑、鏈霉素6種抗生素具有耐藥性。

表3 菌株A20對(duì)24種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)Tab.3 Sensitivity test of strain A20 to 24 antibiotics.

3 討論

3.1 病原菌的分離鑒定

本研究從患病的雜交鱘體內(nèi)分離到菌株A20，該菌菌落形態(tài)特征、β溶血性以及其他生理生化特征與肖艷翼等[16]分離得到的溫和氣單胞菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。但溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌溫和型菌株的理化特性接近[17]，且本研究中菌株A20鳥氨酸脫羧酶反應(yīng)與和溫氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株不一致，僅通過以上形態(tài)學(xué)和理化性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法準(zhǔn)確鑒定菌株A20。目前，通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定細(xì)菌種類，具有更高的準(zhǔn)確性?；?6SrDNA基因?qū)?xì)菌進(jìn)行分類學(xué)鑒定已被廣泛運(yùn)用，但同屬細(xì)菌16SrDNA基因同源性較高，無法準(zhǔn)確區(qū)分；而gyrB基因作為蛋白編碼基因典型代表，在區(qū)分近緣種時(shí)具有較高準(zhǔn)確性[18]。因此通過分析菌株A20的管家基因16SrDNA和gyrB基因序列，進(jìn)行同源性鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)菌株A20與溫和氣單胞菌的同源性最高，兩種基因的序列相似性均大于99%，最終確認(rèn)菌株A20為溫和氣單胞菌[19]。

3.2 溫和氣單胞菌對(duì)雜交鱘的致病性

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，溫和氣單胞菌時(shí)常引起經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖動(dòng)物患多種病癥，如導(dǎo)致亞東鮭體表出血潰爛、內(nèi)臟出血、腹腔內(nèi)產(chǎn)生腹水[19]；導(dǎo)致草魚鰭條基部出血、肛門紅腫等[10]；引起鯽體表出現(xiàn)疥瘡型病變和出血、鱗片脫落、內(nèi)臟出血等癥狀[20]；引發(fā)俄羅斯鱘和西伯利亞鱘內(nèi)臟腫脹、腸道紅腫發(fā)炎、產(chǎn)生大量腹水[16]。本研究中溫和氣單胞菌引起雜交鱘體表和內(nèi)臟出血、肛門紅腫、腹水等癥狀與以上案例有較多相似點(diǎn)。

毒力基因檢驗(yàn)結(jié)果表明，菌株A20含有hlyA、ompA、alt、aer4種毒力基因。氣溶素、溶血素和腸毒素是細(xì)菌生長(zhǎng)過程中分泌的具有極強(qiáng)毒性的胞外可溶性蛋白，氣溶素可破壞細(xì)胞膜滲透性，引起細(xì)胞死亡、β溶血[21]；溶血素直接破壞宿主細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]；腸毒素具有溶血性和腸毒性，可引起宿主腸道炎癥[23]。外膜蛋白是重要的粘附因子和保護(hù)性抗原[24]。菌株A20攜帶ompA，其產(chǎn)生的外膜蛋白可以使溫和氣單胞菌快速粘附在雜交鱘體內(nèi)完成定植；攜帶的aer和hlyA分泌的氣溶素和溶血素引發(fā)雜交鱘溶血和機(jī)體細(xì)胞大量死亡，從而導(dǎo)致體表和內(nèi)臟出現(xiàn)大面積出血；分泌的alt引發(fā)雜交鱘腸道產(chǎn)生嚴(yán)重的紅腫、充血和壞死。

有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)氣單胞菌攜帶hlyA和aer兩種或兩種以上外毒素基因時(shí)，不論菌株來源，該菌株均為強(qiáng)毒株[25]。龍?zhí)K等[15]也發(fā)現(xiàn)高致病性溫和氣單胞菌相較于低致病性菌株會(huì)多攜帶hlyA、aer、alt基因。病原菌的致病性是多種毒力基因共同作用的結(jié)果[14，26]。本研究中菌株A20所攜帶4種毒力基因，4種毒力基因的共同作用使菌株A20對(duì)雜交鱘具有較強(qiáng)的致病性。

本研究中溫和氣單胞菌對(duì)雜交鱘的半致死濃度為1.37×107CFU/mL，這與斑點(diǎn)叉尾鮰LD50為2.0×108CFU/mL[12]、長(zhǎng)絲裂腹魚LD50為1.002×107CFU/mL[27]存在差異，所以宿主種類和規(guī)格以及病原菌來源均會(huì)影響病原菌的致病性。

3.3 溫和氣單胞菌的防治

溫和氣單胞菌主要暴發(fā)時(shí)間為4-9月，暴發(fā)時(shí)水溫為13～27 ℃[11，19，28，29]，本研究中菌株A20所暴發(fā)的時(shí)間和水溫與上述范圍一致。本研究結(jié)果表明菌株A20在21～35 ℃時(shí)均能正常生長(zhǎng)，這與嗜水氣單胞菌[7]對(duì)溫度的耐受結(jié)果相似，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了冬季低溫條件下溫和氣單胞菌鮮少暴發(fā)的現(xiàn)象。菌株A20對(duì)pH的耐受能力較弱，僅在pH為7左右的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，過酸或者過堿均會(huì)嚴(yán)重抑制其生長(zhǎng)；該菌對(duì)鹽度的耐受能力較強(qiáng)(圖6)，在NaCl含量為0%～3%的環(huán)境中可正常生長(zhǎng)，當(dāng)濃度高于4%時(shí)對(duì)其生長(zhǎng)具有抑制作用。以上結(jié)果表明菌株A20除對(duì)環(huán)境中的pH有較強(qiáng)的敏感性外，對(duì)鹽度和溫度有較強(qiáng)適應(yīng)能力，這也為該病的防治帶來一定的困難。

藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株A20對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星、呋喃唑酮、羧芐西林、呋喃妥因等15種抗生素高度敏感；對(duì)吉他霉素、麥迪霉素、青霉素、氨芐西林、磺胺異惡唑、鏈霉素6種抗生素具有耐藥性。有研究發(fā)現(xiàn)耐藥性的產(chǎn)生與耐藥基因相關(guān)，但病原菌攜帶相關(guān)耐藥基因有時(shí)卻不一定表現(xiàn)出相應(yīng)的耐藥性[19]，這可能與耐藥基因是否表達(dá)和表達(dá)量等復(fù)雜的作用機(jī)制有關(guān)。本研究中菌株A20與大麻哈魚[11]、亞東鮭[19]和長(zhǎng)絲裂腹魚[27]中發(fā)現(xiàn)的溫和氣單胞菌均具有不同的耐藥譜，這可能是由于所處的不同藥物環(huán)境造成的差異[19]，這種差異也可能是由于不同的地理環(huán)境、不同的感染宿主和所攜帶耐藥基因的差異引起的。

抗生素的合理合法使用是保證水產(chǎn)動(dòng)物健康生長(zhǎng)不受病原體侵蝕的有效途徑[30]。參考農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2022年發(fā)布的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2022年1、2號(hào)》文件，結(jié)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可使用氟苯尼考、恩諾沙星等藥物對(duì)溫和氣單胞菌進(jìn)行防治。然而溫和氣單胞菌常與殺鮭氣單胞菌、維氏氣單胞菌等病原菌混合感染水產(chǎn)動(dòng)物[14，19，28]，引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物大規(guī)?；疾∷劳?，造成更嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，使疾病的防治難度加大，所以在養(yǎng)殖過程中要更加注重疾病的預(yù)防，日常精細(xì)化管理和積極采取預(yù)防措施。