黃顙魚養(yǎng)殖群體遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析

李燕平,覃川杰,呂云云,龔 全,王 均,頡 江,文正勇

(1.內(nèi)江師范學(xué)院,長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室,四川內(nèi)江 641112;2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所,成都 611730)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)隸屬于鯰形目(Siluriformes)鲿科(Bagridae),廣泛分布于長江、黃河、珠江、沅江及黑龍江等各水域[1,2],是我國重要的經(jīng)濟魚類和主要養(yǎng)殖對象[3]。然而,因人工繁育隨意留種可能出現(xiàn)的近親繁殖、廣泛交易、增殖放流、自然逃逸等原因有可能使種群的遺傳多樣性水平降低。庫喜英等[4]以線粒體DNA為標記,對采自長江、珠江、遼河、閩江、富春江和韓江6個水系的21個采樣點的黃顙魚進行遺傳結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明黃顙魚的群體遺傳多樣性為中度多態(tài),群體間遺傳分化極小,已缺乏明顯的地理結(jié)構(gòu)。

微衛(wèi)星DNA即短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)或簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR),廣泛存在于真核生物基因組中。與傳統(tǒng)分子標記相比,它具有突變速率快、呈共顯性、穩(wěn)定性好、易檢測等優(yōu)勢,已被廣泛應(yīng)用于水生生物遺傳多樣性評估、種群遺傳結(jié)構(gòu)分析、物種分類、親緣關(guān)系分析、標記輔助育種以及遺傳圖譜構(gòu)建等[5-8]。李大宇等[9]利用微衛(wèi)星標記對6個群體(吉林省大安市月亮湖野生黃顙魚、四川野生黃顙魚、黑龍江省哈爾濱市松花江段黃顙魚、湖北省荊州市長湖野生黃顙魚親本以及子代和天津市換新國家級原良種場黃顙魚1號)的黃顙魚遺傳多樣性及親緣關(guān)系進行解析。胡玉婷等[10]采用微衛(wèi)星標記分析了長江、淮河兩水系安徽區(qū)段黃顙魚群體的遺傳多樣性。

目前,黃顙魚遺傳多樣性及群體親緣關(guān)系的研究主要集中在自然地理群體。隨著長江十年禁漁計劃的實施,天然水域親本采集的難度變大。因此,了解和掌握人工養(yǎng)殖群體的黃顙魚種群結(jié)構(gòu)、群體遺傳多樣性,有助于為黃顙魚良種選育、苗種繁育等提供理論依據(jù)。本實驗基于8對微衛(wèi)星標記對14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行評估,以期為黃顙魚家系建立,提高黃顙魚遺傳育種潛力、縮短育種年限和加快新品種的選育提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗室動物

本實驗所用黃顙魚取自四川省14個養(yǎng)殖群體,通過咨詢其親本來源,確定其親本群體來自于江蘇溧陽(HJ)、四川邛崍(HQ)、廣東佛山(LG)、安徽安慶(YB)、湖北仙桃(YH)、浙江德清(YZ)、湖南岳陽(DB)、湖北荊門(WH)、四川宜賓(XB)、湖北咸寧(XH)、江蘇鹽城(ZJ)、四川樂山(ZL)、浙江湖州(LZ)和廣西南寧(RB),每個親本群體的詳細信息見表1。其中,除HJ,YH和XH分別采集到17,13和14尾樣本外,其余11個群體每個群體的樣本數(shù)均為15尾,共采集209尾樣本。取部分尾鰭組織保存于95%乙醇中,置于-20℃冷藏備用。

表1 14個養(yǎng)殖黃顙魚群體的采樣信息Tab.1 Sampling information of 14 cultured populations of P.fulvidraco

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取和質(zhì)量檢測

對所有樣本采用酚氯仿抽提法獲得基因組DNA,具體DNA提取步驟參考文獻[11]。對提取出的DNA,首先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量,并使用Nanodrop 2000(賽默飛,美國)進一步檢測DNA的濃度和純度,滿足PCR擴增質(zhì)量要求的DNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多態(tài)性微衛(wèi)星篩選、擴增和分型檢測

本研究參考文獻[9]隨機挑選11對引物用于本研究的黃顙魚養(yǎng)殖群體的多態(tài)性初篩。隨機挑選的11對引物的具體信息見表2。經(jīng)過在14個群體,每個群體挑選8個個體進行預(yù)實驗,結(jié)果顯示有3對引物(SS37,SS81和SS89)在本研究的樣本中擴增失敗或呈單態(tài),最終確定8對引物用于本研究,并在這8對引物的正向5′端加上FAM熒光標記,方便后續(xù)進行毛細管電泳分型。本實驗所用的引物及熒光染料由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表2 用于本研究14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的引物序列情況Tab.2 Microsatellite marker sequences used in 14 cultured populations of P.fulvidraco

PCR擴增體系為:20 μL反應(yīng)體系包含2 μL 10×Pfu Buffer(含有Mg2+),10 μmol/L正反向引物各0.8 μL,0.8 μL dNTP(10 μmol/L),1.5 μL基因組DNA(20 ng/μL)和0.4 μL Taq酶,最終用去離子水補到20 μL。采用降落PCR擴增,具體反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共10個循環(huán)(每個循環(huán)退火溫度降低0.2 ℃);95變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共32個循環(huán)(每個循環(huán)退火溫度降低0.1 ℃);72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)進行微衛(wèi)星位點多態(tài)性檢測,在6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行。非變性聚丙烯酰胺凝膠制作的標準步驟參照《分子克隆實驗指南》進行[12]。將1.5 μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后依次加樣于凝膠的加樣孔內(nèi),于220 V恒定電壓下電泳1.5～2.5 h。電泳結(jié)束后,用EB染色,并在紫外凝膠成像系統(tǒng)中掃描、保存。通過pBR322 DNA/MspI分子質(zhì)量標準對比初步確定等位基因大小。將檢測到目的條帶的產(chǎn)物上樣于ABI3730xl分析儀(蘇州金唯智生物科技有限公司)進行毛細管電泳,檢測產(chǎn)物片段大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)14個群體在8個微衛(wèi)星位點的基因分型數(shù)據(jù),首先使用CONVERT 1.3將其轉(zhuǎn)化為STRUCTURE,POPGENE以及ARLEQUIN等軟件能夠識別的格式[13],再利用POPGENE 1.3.1[14]計算14個群體各個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Na)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Hardy-Weinberg平衡遺傳偏離指數(shù)和Nei′s標準遺傳距離等參數(shù);利用CERVUS 3.0.3計算多態(tài)信息含量(PIC)[15];使用ARLEQUIN 3.5計算兩兩群體之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)并進行分子方差分析(analasis of molecular variation,AMOVA)[16];使用MEGA 7軟件基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹[17];最后利用STRUCTURE 2.3.4中的貝葉斯聚類[18],基于混合模型找到聚類值(K值),MCMC鏈長設(shè)置為20 000,每次運行舍棄的樣本數(shù)設(shè)置為2 000,遺傳分組K值設(shè)置為1～14,每次分析重復(fù)運行10次,將運行的結(jié)果提交到Structure Harvester確定最佳的K值[19],再用CLUMPP 1.1.2軟件進行重復(fù)聚類分析[20],最后利用DISTRUCT 1.1軟件將CLUMPP的結(jié)果進行可視化[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析

8個位點在14個群體中的等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù),以及各個群體的平均值見表3。14個黃顙魚養(yǎng)殖群體中,平均觀測雜合度在0.633～0.717之間,其中HQ和WH群體最低,最高的為XB和LZ群體;平均期望雜合度在0.358～0.749之間,最低群體為RB,最高群體為LG;平均多態(tài)信息含量在0.893～0.681之間,多態(tài)信息含量最低的為WH群體,最高的為YB群體,14個群體的平均多態(tài)信息含量均大于0.5,說明14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均處于高度多態(tài)的水平;平均有效等位基因數(shù)在5.160～6.882之間,RB群體最低,DB群體最高(表3)。

表3 14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性信息Tab.3 Information on genetic diversity in four-teen populations of P.fulvidraco

續(xù)表3

2.2 黃顙魚養(yǎng)殖群體遺傳分化關(guān)系

對14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示,3.69%的遺傳變異來自群體間,3.93%來自群體內(nèi)個體間,92.38%來自所有個體間,表明群體間的遺傳變異主要來自所有個體間(表4)。

表4 基于8個微衛(wèi)星標記的分子方差分析結(jié)果Tab.4 Result of AMOVA based on 8 microsatellite loci

14個黃顙魚群體的遺傳分化指數(shù)在-0.009～0.116之間,其中RB群體和WH群體的遺傳分化最大(Fst=0.116),ZL群體和XB群體的遺傳分化最小(Fst=-0.009)。根據(jù)WRIGHT[22]對遺傳分化指數(shù)(Fst)的劃分標準,當Fst<0.05時,表明群體間遺傳分化較小;當0.050.25時,表明群體間遺傳分化極大?？傮w看來,本研究14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的兩兩群體遺傳分化指數(shù)大部分均小于0.05,其余部分均在0.05～0.15之間,說明本研究的所有黃顙魚養(yǎng)殖群體均處于中等偏低的分化水平(表5)。

表5 14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)(Fst)Tab.5 Pair-wise Fst values calculated from eight microsatellite loci among 14 populations of P.fulvidraco

8個微衛(wèi)星位點的平均群體內(nèi)近交系數(shù)(Fis)和總近交系數(shù)(Fit)分別為0.007 1和0.072 0(表6),說明黃顙魚群體內(nèi)存在一定程度的近交現(xiàn)象。各基因座的基因交流均值為3.573。

表6 黃顙魚養(yǎng)殖群體8個微衛(wèi)星位點的F-統(tǒng)計檢驗Tab.6 F-statistics for P.fulvidraco populations at eight microsatellite loci

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析

14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳相似度和Nei′s遺傳距離的結(jié)果表明,群體間的Nei′s遺傳距離在0.055 0～0.431 4之間變化,遺傳相似度在0.649 6～0.946 0之間(表7)。其中,HJ和DB群體的遺傳距離最遠,遺傳相似度最低,而XB和ZL的遺傳距離最近,遺傳相似度最高。說明HJ和DB群體的遺傳分化最大,親緣關(guān)系最遠,而XB和ZL群體的親緣關(guān)系最近。

表7 14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳相似性系數(shù)(右上角)和Nei′s遺傳距離(左下角)Tab.7 Matrix of pair-wise genetic similarity coefficient(above diagonal)and Nei′s genetic distance(below diagonal)among 14 populations of P.fulvidraco

基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹結(jié)果顯示,HJ、YZ、YH、YB首先聚為一個分支,HQ和LG分別聚為一個分支,三個分支聚類后再與LZ和RB聚在一起,最后與余下的DB、ZJ、WH、XH、XB和ZL聚在一起,與遺傳距離的結(jié)果一致(圖1a)。在黃顙魚Structure群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中,Delta K隨著亞群數(shù)K的增加而變動,K=5時,Delta K出現(xiàn)最大的拐點(圖1b),表示K=5是最可能的模型,推測本研究的14個黃顙魚養(yǎng)殖群體分為5個亞群最合適(圖1c),與UPGMA聚類樹的結(jié)果一致。

圖1 黃顙魚群體的遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析Fig.1 Genetic clustering analysis among populations of P.fulvidraco(a)基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖;(b)Delta K值的變化曲線;(c)K=5時的structure聚類結(jié)果,不同顏色代表不同的簇。

3 討論

3.1 黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性水平

物種間親緣關(guān)系越近,SSR引物的通用性越高。本研究選用11對前期通過磁珠富集法結(jié)合同位素雜交法在黃顙魚野生群體中開發(fā)出的微衛(wèi)星引物[9],檢測黃顙魚養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性,結(jié)果顯示8對多態(tài)性引物擴增成功且呈多態(tài),通用率為72.73%,表現(xiàn)出較為理想的擴增結(jié)果,說明野生黃顙魚群體中開發(fā)出的微衛(wèi)星位點可用于黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的評估、保護遺傳學(xué)研究。

生物群體的遺傳多樣性是評價物種資源狀況的一個重要依據(jù)。李大宇等[9]發(fā)現(xiàn)吉林、四川、黑龍江、湖北等省天然水系野生的6個黃顙魚群體的多態(tài)性指標均適中。王婷婷等[23]報道了湖州菱湖養(yǎng)殖場(取自太湖支流大海漾群體的后代)、蘇州澄湖、太湖和四川眉山養(yǎng)殖場的4個黃顙魚群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個群體的多態(tài)性指標處于中等水平,群體間遺傳分化不明顯,4個群體的親緣關(guān)系較近。目前有關(guān)黃顙魚遺傳多樣的研究主要集中在不同地理分布群體,有關(guān)人工養(yǎng)殖群體種質(zhì)資源評價的研究較少。黃顙魚已是中國廣泛養(yǎng)殖的小型名優(yōu)經(jīng)濟類,具有繁育場多、交易廣泛、逃逸和放流頻繁等特點。因此,探討人工養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性是持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提。

多態(tài)信息含量PIC用來描述微衛(wèi)星位點遺傳變異程度,含量的高低與變異程度成正比。根據(jù)BOTSTEIN等[24]對PIC的劃分標準,當PIC<0.25,該位點為低度多態(tài);當0.250.5,該位點為高度多態(tài)。本研究14個群體得到的平均多態(tài)信息含量為0.593-0.681,說明本研究的黃顙魚群體遺傳多樣性處于高度多態(tài)的水平,有較好的選育潛力,且YB群體的平均PIC值最大,說明良種選育潛力在YB群體中表現(xiàn)得尤為突出。李大宇等[9]對6個不同地理種群的遺傳多樣性分析結(jié)果(平均PIC為0.19～0.40)與本研究相比,本研究的黃顙魚遺傳多樣性相對較高,這可能是由于本研究中涉及的黃顙魚樣本總量更多的原因。與郭金峰等[25]對3個黃顙魚群體遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析所報道的相比(PIC=0.588 9),本研究所得的遺傳多樣性水平與之較接近。與鄭翔等[26]對近緣物種瓦氏黃顙魚的四個不同地區(qū)的遺傳多樣性相比(平均PIC=0.431～0.627),本研究的黃顙魚遺傳多樣性水平也與之接近。

基因雜合度也是衡量群體變異的最適參數(shù)之一,代表群體中雜合子在某個位點上的頻率,體現(xiàn)群體的進化程度[27]。TAKEZAKI等[28]通過微衛(wèi)星標記研究發(fā)現(xiàn),當期望雜合度和觀測雜合度大于0.3時,表明群體具有遺傳多樣性的基礎(chǔ)。本研究14個群體的平均期望雜合度Ho在0.633～0.717之間,平均觀測雜合度He在0.358～0.749,表明14個養(yǎng)殖黃顙魚群體具有較高的遺傳多樣性,有較好的選育潛力。14個黃顙魚養(yǎng)殖群體有12個群體(HJ、HQ、LG、YB、YH、YZ、DB、WH、XB、XH、ZL和LZ)的平均觀測雜合度低于平均期望雜合度,推測可能是由于普遍存在近交情況而使得群體發(fā)生純合,進而導(dǎo)致雜合度降低。其余2個群體(ZJ和RB)的觀測雜合度大于期望雜合度,其中,ZJ群體觀測雜合度超出期望雜合度的程度較小,說明該群體的遺傳性較為穩(wěn)定;相反,RB群體的觀測雜合度超出期望雜合度的程度較大,可能是由于該群體摻雜了野生群體或其他群體中的放流個體,這些個體與RB群體雜交導(dǎo)致遺傳平衡遭到破壞。建議在考慮RB群體繁殖選育過程中應(yīng)該盡量擴大選育的范圍,同時也要防止養(yǎng)殖個體的放流逃逸,避免具有同樣群體遺傳背景的個體之間交配,增加人工選育的難度。

3.2 黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳分化

本研究14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳分化指數(shù)在-0.009～0.116之間波動,其中在兩兩群體比較的組別中,有64組的Fst小于等于0.05,其余27組的Fst均在0.05～0.15之間。當Fst<0.05時,表明群體間遺傳分化較弱;當0.050.25時,則表明群體間的遺傳分化極大[22]。根據(jù)該標準,說明這14個黃顙魚群體總體處于中等偏低的遺傳分化水平,這與分子方差結(jié)果一致,其遺傳變異的92.38%均來自個體變異,而非群體;從群體間兩兩比較結(jié)果來看,大部分群體之間的遺傳分化程度較弱,其余群體的遺傳分化處于中等水平,較前者遺傳分化強。

本研究黃顙魚養(yǎng)殖群體間的基因交流是引起其群體間遺傳分化程度低的重要因素。本研究中群體間基因流的均值(Nm)為3.573。研究表明,當Nm大于1時,基因流引起群體間遺傳分化大于來自于遺傳漂變的影響;而當Nm小于1時,遺傳漂變對群體間遺傳分化的影響要大于基因流的作用[29]。本研究中,在對14個黃顙魚養(yǎng)殖群體8對多態(tài)性微衛(wèi)星分析結(jié)果中,只有一對引物SS9的基因流小于1,其余7對引物的基因流均大于1,表明黃顙魚養(yǎng)殖群體間有明顯的基因流存在,導(dǎo)致各群體間未有明顯的遺傳分化。

3.3 黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)

本研究基于Nei′s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹與Structure分析中的結(jié)果表現(xiàn)出較強的一致性,通過Structure軟件對黃顙魚群體進行種群遺傳結(jié)構(gòu)檢測,采用ΔK推測K=5是最可能的模型,即14個黃顙魚養(yǎng)殖群體可以分為5個亞群。此外,聚類的先后順序可以反映出種群之間親緣關(guān)系的遠近?；诒狙芯康木垲惤Y(jié)果可以看出,XB和ZL的遺傳相似度最高,親緣關(guān)系最近;而HJ和DB的遺傳相似度最小,親緣關(guān)系最遠,這個結(jié)果與遺傳距離的結(jié)果也是一致的,即XB和ZL的遺傳距離最小,而HJ和DB的遺傳距離最大。XB和ZL的親緣關(guān)系最近的原因可能是由于這兩個群體的親本都來自四川,而HJ和DB兩個群體的遺傳相似度最低,親緣關(guān)系最遠的原因可能是由于這兩個群體的親本來源相差大造成的,HJ群體的親本來自江蘇、而DB群體的親本來自四川。此外,盡管通過Structure分析把14個黃顙魚群體分為5個亞群,但是各亞群之間基因交流頻繁,這和14個黃顙魚養(yǎng)殖群體處于中等偏低的遺傳分化水平吻合。

綜上所述,基于微衛(wèi)星標記對14個黃顙魚養(yǎng)殖群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明,14個黃顙魚群體之間存在中等偏低的遺傳分化水平,且變異來源主要來自個體間。14個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性均處于高度多態(tài)的水平,遺傳多樣性豐富,可作為家系選育的基礎(chǔ)群體。在今后的育種工作中,可以利用不同群體不同個體間的遺傳距離以及聚類關(guān)系圖進行輔助繁殖配組,指導(dǎo)家系建立和群體選育?？苫谶z傳距離的結(jié)果,把親緣關(guān)系較遠的群體建立繁育群組,最大限度地避免近親交配,同時也保持群體的遺傳多樣性,這對提高黃顙魚遺傳育種潛力、縮短育種年限和加快新品種的選育具有重要的指導(dǎo)意義。