黃顙魚源溫和氣單胞菌的分離鑒定及中草藥體外抑菌效果研究

侯廷龍，劉惠茹，李春濤，王慶容

(1.遵義師范學院生物與農業(yè)科技學院，貴州遵義 563000；2.天津農學院水產學院天津市水產生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300392；3.暨南大學水生生物研究中心，廣州 510632)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)廣泛分布在我國各大干支流及附屬水體中，在江河、湖泊、池塘中均有棲息[1，2]。其肉質鮮嫩細膩、味道鮮美，有著較高的營養(yǎng)價值和經濟價值，深受消費者的喜愛[3]。近年來，隨著養(yǎng)殖集約化程度大幅度提高，出現(xiàn)養(yǎng)殖環(huán)境逐步惡化、苗種質量下降、病原耐藥性增強等，致使黃顙魚養(yǎng)殖病害頻發(fā)，溫和氣單胞菌是其主要的致病菌[4]。

溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)是弧菌科(Vibrionaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)的一種重要的條件致病菌，普遍存在于淡水、土壤、淤泥等環(huán)境中，在世界各地均有分布[5]。溫和氣單胞菌是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一，能引發(fā)魚類、爬行類、兩棲類等的出血性敗血癥[6]。據(jù)報道，該菌可以感染青魚(Mylopharyngodonpiceus)、細鱗魚(Brachymystaxlenok)、南方大口鯰(SilurussoldatovimeridionalisChen)、鯽(Carassiusauratus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和長絲裂腹魚(Schizothoraxdolichonema)、中華鱉(TrionyxSinensis)以及大鯢(Andriasdavidianus)等并引起大量死亡[6-10]。該菌也是重要的人畜共患病的病原菌，能引發(fā)腹瀉、傷口感染和敗血癥等癥狀[11]。研究顯示，溫和氣單胞菌其主要致病因子是溫和氣單胞菌產生的多種溶血素和腸毒素，這些毒素具有多種生物活性，可引起動物體發(fā)生復雜的病理變化[12]。

目前，在我國水產養(yǎng)殖魚類細菌疾病的治療中，抗生素藥物仍為治療首選，但長期使用易導致耐藥性和藥物殘留問題[13，14]。中草藥是天然藥物，資源豐富；提取的中草藥活性成分屬次級代謝物，易降解，可有效避免藥物殘留，毒副作用少，安全性高，不易引起藥源性疾病和產生耐藥性，對環(huán)境污染少；中草藥還有促進生長、調節(jié)免疫力和提高機體抗病力等作用[15，16]。已有研究表明，黃芪(Astragalusmembranaceus)、黃連(Coptischinensis)、番石榴(Psidiumguajava)、龍須菜(Gracilarialemaneiformis)、腫柄菊(Tithoniadiversifolia)、蔞葉(PiperbetleL.)等中草藥對嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)和哈氏弧菌(Vibrioharveyi)等都有較好的抑菌和殺菌效果[17，18]，中草藥代替抗生素是水產病害防治的研究熱點，研究中草藥對致病菌的作用效果、抑制殺滅機理等對中草藥防治水產動物疾病有著極其重要的意義。

本研究患病黃顙魚脾臟、肝臟等內部器官充血，腹部腫大，并有腹水現(xiàn)象。通過人工感染健康黃顙魚，證實其致病性，經生理生化實驗和16S rDNA基因序列分析鑒定病原菌為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。采用乙醇提取法獲得了30種中草藥提取物，測定了30種中草藥提取物對分離菌株的體外抑菌效果，篩選出能有效抑制溫和氣單胞菌的中草藥，為進一步開展黃顙魚因溫和氣單胞菌感染的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗用魚：患病黃顙魚[體質量(38.3 ± 5.4)g]及健康魚[體質量(25.7 ± 3.8)g]來自遵義金鼎鎮(zhèn)合江源養(yǎng)殖場。

中草藥：蛇床子(Cnidiummonnieri)、牡丹皮(Paeoniasuffruticosa)、黃芪(Astragalusmembranaceus)、陳皮(CitrusreticulataBlanco)、藿香(Agastacherugosa)、豬苓(Polyporusumbellatus)、黃柏(PhellodendronchinenseSchneid)、苦參(SophoraflavescensAlt.)、肉桂(CinnamomumcassiaPresl)、煙葉(NicotianatabacumL.)、烏梅(DarkPlumFruit)、樟葉(C.glanduliferum)、夾竹桃(NeriumoleanderL.)、訶子(TerminaliachebulaRetz.)、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、黃連(CoptischinensisFranch.)、大黃(RheumpalmatumL.)、桑白皮(MorusalbaL.)、石榴皮(PunicagranatumL.)、大青葉(IsatisindigoticaFortune)、蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)、雞血藤(SpatholobussuberectusDun)、虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)、龍膽草(Adenophoracapillaris)、青蒿(ArtemisiacarvifoliaBuch.)、金銀花(LonicerajaponicaThunb.)、敗醬草(SonchusarvensisL.)、地榆(SanguisorbaofficinalisL.)、杜仲(EucommiaulmoidesOliver)、板藍根(IsatisindigoticaFort.)、厚樸(Houpoeaofficinalis)、穿心蓮(Andrographispaniculata)30種中草藥購自遵義市百姓大藥房。

中草藥提取液制備：將30種中草藥烘干并用粉碎機粉碎經0.3 mm過濾網后各稱取20 g，再加入500 mL 95%的乙醇浸泡24 h后，在旋轉蒸發(fā)儀中進行提取，重復2次；所得浸膏置于55 ℃烘箱中干燥至恒重。稱取2 g浸膏配成2 000 mg/mL的藥物原液，儲存于4℃冰箱備用。

細菌培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基為蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL，pH調至7.0～7.2。固體培養(yǎng)基為每1 000 mL液體培養(yǎng)基加入18 g瓊脂。

1.2 病原菌初步分離純化

無菌條件下，取患病黃顙魚肝、脾、腎的組織直接接種于固體培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)10～16 h，挑取形態(tài)、大小一致的單個優(yōu)勢菌落，純化2次獲得純培養(yǎng)，接種液體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗

將分離得到的菌株接種到固體培養(yǎng)基平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，挑取單一菌落接種于500 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h。用無菌生理鹽水配制細菌密度分別為1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104cfu/mL。然后把健康的黃顙魚按照每尾0.2 mL的不同密度的菌液腹腔注射進行人工感染，對照組魚注射0.2 mL 0.65%的無菌生理鹽水，每一組均注射20尾魚，每組三個平行。每天投喂以及充氣換水，攻毒后每日觀察試驗魚的發(fā)病死亡情況，出現(xiàn)與自然發(fā)病魚癥狀一致，對死亡魚及時進行剖檢和細菌的再次分離。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 生理生化特征檢測

觀察分離菌的菌落形態(tài)，革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)。挑取單個菌落接種于試管中，37 ℃培養(yǎng)，并按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株進行初步鑒定。

1.4.2 病原菌16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌基因組DNA。用16S rDNA的通用引物，上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物；5′-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。PCR產物經過電泳檢測條帶大小正常然后導入到pMD18-T載體并轉化到DH5α之中，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。把測序得到的16S rDNA序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對，用DNA star和MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 抑菌作用的測定

用移液器吸100 μL溫和氣單胞菌的菌懸液分別均勻涂布在直徑9 cm的普通營養(yǎng)瓊脂平板上，晾干后用直徑6 mm的打孔器在每個固體培養(yǎng)基平板上均勻打4個孔。向孔中滴加供試中草藥原液，每孔30 μL，用封口膜封口后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后觀察并用游標卡尺測量抑菌圈的直徑大小。

1.6 最小抑菌濃度(MIC)測定

根據(jù)抑菌作用的測定結果，選取有效抑菌的中草藥，采用對倍稀釋法測定抑菌濃度。取15支試管分別加入1 000 μL液體培養(yǎng)基，向1號試管加入1 000 μL藥液，采用倍比稀釋后使藥液終濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24 mg/mL，各試管中分別加入100 μL的菌液，14號試管是加入等量培養(yǎng)基和菌液但不加藥液的陽性對照組，15號試管加入等量培養(yǎng)基不加菌液作為陰性對照，最后混勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，無菌生長試管中的最低藥物濃度即為MIC。

1.7 最小殺菌濃度(MBC)測定

吸取各藥物的MIC和高于MIC濃度的各個梯度培養(yǎng)混合液100 μL，涂布于固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察有無菌落形成，無菌落形成所對應試管中的最低藥物濃度即為最小殺菌濃度。

2 結果

2.1 生化鑒定結果

對病原菌MLT-1進行生理生化特征分析，菌落形狀圓形、表面光滑、邊緣整齊、略凸起，經革蘭氏染色鏡檢為陰性短桿狀(圖1)；產生吲哚；賴氨酸脫羧酶陽性；利用山梨醇；不利用檸檬酸鹽；D-葡萄糖不能產氣(表1)。病原菌MLT-1與標準菌株溫和氣單胞菌生理生化特性基本一致，初步判定為溫和氣單胞菌。

表1 分離菌株MLT-1的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strain MLT-1

圖1 MLT-1菌株的菌落形態(tài)(a)及菌體革蘭氏染色(b)Fig.1 Colony(a)and gram staining(b)of MLT-1 strain

2.2 16S rDNA結果和系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴增出16S rDNA片段產物，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示該片段大小約為1 500 bp(圖2a)。擴增產物經克隆后測序，其大小為1 530 bp。將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)與溫和氣單胞菌的16S rDNA相似度高達100%。系統(tǒng)進化樹分析也表明MLT-1與溫和氣單胞菌聚為一支(圖2b)。

圖2 MLT-1菌株16S rDNA PCR電泳圖片(a)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析(b)Fig.2 The electrophoresis picture of 16s rDNA(a)and analysis of phylogenetictree(b)of MLT-1 strain

2.3 人工感染試驗

從病魚脾臟內分離得到一株優(yōu)勢菌，命名為MLT-1，回歸感染健康黃顙魚結果見表2，1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104cfu/mL組的14 d累計死亡率分別是100%、100%、90%、75%、65%、25%、0%。人工感染魚病癥與自然感染魚病癥一致(圖1a)。

表2 MLT-1菌株的動物致病性試驗結果Tab.2 Pathogenicity test result of MLT-1 strain

2.4 中草藥提取物抑菌結果

測定的30種中草藥提取物抑菌效果見表3。結果顯示對溫和氣單胞菌MLT-1效果較好的中草藥物是訶子、大黃、煙葉、樟葉、桑白皮。

表3 30種中草藥對溫和氣單胞菌MLT-1的抑菌效果Tab.3 Antibacterial effects of 30 Chinese herbal medicines against A.sobria MLT-1

2.5 最低抑菌濃度和最小殺菌濃度

選取抑菌效果較好的5種中草藥醇提物，用二倍梯度稀釋方法對溫和氣單胞菌MLT-1測定MIC和MBC，結果如表4所示。訶子抑殺溫和氣單胞菌的效果最好，MIC和MBC均為0.49 mg/mL；大黃抑殺溫和氣單胞菌的效果次于訶子，其MIC為0.49 mg/mL，MBC為0.49 mg/mL；煙葉抑殺效果次于大黃，其MIC和MBC均為0.98 mg/mL；樟葉和桑白皮抑殺次于訶子、大黃、煙葉，其MIC均為1.95 mg/mL，MBC為3.91 mg/mL。

表4 5種中草藥醇提物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)Tab.4 MIC and MBC of 5 Chinese herbal medicines against A.sobria mg/mL

3 討論

本研究采集的黃顙魚病魚主要癥狀是身體鰭條充血、有腹水、反應遲鈍、游動緩慢等。類似的癥狀在自然感染溫和氣單胞菌的青魚(Mylopharyngodonpiceus)[9]、大鯢(Andriasdavidianus)[19]、長絲裂腹魚(Schizothoraxdolichonema)中也有發(fā)現(xiàn)[20]，表明溫和氣單胞菌在感染的不同物種中表現(xiàn)出了相似的病癥。

本研究從實驗結果中篩選出對病原菌有顯著抑殺效果的中草藥訶子MBC為0.49 mg/mL、大黃MBC為0.49 mg/mL、煙葉MBC為0.98 mg/mL、樟葉MBC為3.91 mg/mL、桑白皮MBC為3.91 mg/mL。劉騰飛等[21]報道訶子水提物濃度0.625 mg/mL時在體外具有很強的抗淋球菌的作用。喻運珍等[22]報道訶子濃度0.12 mg/mL對嗜水氣單胞菌有較強抑菌作用。以上研究表明同一中草藥對不同菌的抑菌效果也存在著較大的差異，可能是藥物的成分對不同菌作用機理不同所致。石洪玥等[23]研究了黃芩水提物濃度6.25 mg/mL對嗜水氣單胞菌有抑菌效果。張海賓等[24]用大黃濃度50 μg/mL對嗜水氣單胞菌進行實驗，發(fā)現(xiàn)有較大的抑菌圈。上述研究中不同中草藥對同一細菌的殺菌效果有明顯差異，其原因主要可能是因為不同中草藥所含的有效成分不同所致。

不同研究者使用同種中草藥對溫和氣單胞菌進行試驗，其結果也有差異。白富瑾等[19，25]用訶子分別測得MIC為15.6 mg/mL、25.0 mg/mL，而本研究為0.49 mg/mL。何愛華等[26，27]用大黃分別測得MIC為8 mg/mL、0.49 mg/mL，本研究為0.49 mg/mL。上述已有的研究結果與本實驗測得結果也存在一定差異。存在這樣的差異可能是由于提取方式的不同，本研究主要是乙醇提取物，而其他研究者是水提物，對中草藥的有效成分采取不同的提取工藝，引起藥效存在明顯的差別。提取過程中溫度過高，也會導致藥液中有效成分失活。中草藥所含的活性成分同樣受生長環(huán)境地區(qū)的不同、季節(jié)的不同、植物部位的不同從而影響藥效作用。同種中草藥對不同菌株的抑制效果也不同，表明不同菌株之間也存在較大差異。

本研究表明訶子、大黃、桑白皮、香樟、煙草對溫和氣單胞菌有較好的抑菌作用。其抑菌作用可能與中草藥中的某些化學物質有關。孟祥鋒[28]的研究表明訶子的抑菌活性成分為鞣質類物質，主要是沒食子酸及訶子酸等。大黃提取物對嗜水氣單胞菌的抑菌活性隨著蒽醌含量的增加而提高[29]。桑白皮中的酚類化合物具有抗金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌活性[30]。桑白皮中的桑辛素可以通過破壞細胞膜結構和抑制金黃色葡萄球菌的磷脂酸生物合成途徑而發(fā)揮抗菌作用[31]。香樟精油和樟腦可使睡茄軟腐病菌菌絲溶解和細胞質凝固，從而可以有效的抑制該致病菌的生長[32]。煙草中煙堿濃度達10 mmol/L時大腸桿菌的生長受到完全抑制[33]。上述的研究表明不同中草藥發(fā)揮作用的抑菌成分不同，而在本研究中這些中草藥對于同一株病原菌都有較好的抑菌效果，可能表明這些活性成分具有破壞細胞的作用。中草藥植物含有抗菌活性成分復雜，不同的化學成分抑菌機理也是各不相同。目前報道的關于中草藥抑菌的作用機理主要是破壞細胞膜的滲透壓，使機體內的酶類和代謝產物溢出導致死亡；抑制病原菌的酶系統(tǒng)活性，破環(huán)其新陳代謝；抑制生物大分子的合成等[34]。

中草藥具有綠色環(huán)保、易降解、不殘留等優(yōu)點，可以被開發(fā)為綠色生態(tài)漁藥，具有較好的應用前景。本文通過30種中草藥的體外抑菌試驗，探究了抑制溫和氣單胞菌的不同中草藥效果，為篩選出有效抑制魚類溫和氣單胞菌感染的中草藥提供了重要的參考資料。