黃鱔細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白3基因的克隆及其在性逆轉(zhuǎn)中的功能分析

連子童，夏雪平，李 忠，田海峰，蔣欽楊，胡喬木

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

黃鱔(Monopterusalbus)隸屬硬骨魚(yú)綱(Osteichthyes)輻鰭亞綱(Actinopteryii)合鰓目(Synbranchiformes)合鰓亞目(Synaphobranchoidei)合鰓科(Synbranchidae)黃鱔屬(Monopterus)，屬于溫?zé)釒У~(yú)類(lèi)，廣泛分布于亞洲東部和南部，在國(guó)內(nèi)盛產(chǎn)于長(zhǎng)江流域的湖北、江西、湖南和四川等地[1]。黃鱔為先雌后雄型雌雄同體魚(yú)類(lèi)，在性腺發(fā)育中存在性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象[2-4]，第一次產(chǎn)卵后，卵巢結(jié)構(gòu)逐漸退化精巢結(jié)構(gòu)逐漸出現(xiàn)[5]。原始精原細(xì)胞開(kāi)始發(fā)育形成精小囊，此時(shí)性腺內(nèi)存在未退化卵巢結(jié)構(gòu)與發(fā)育階段精巢結(jié)構(gòu)，該發(fā)育時(shí)期為間性發(fā)育階段[6-8]。近年來(lái)隨著黃鱔人工繁育技術(shù)的突破，解決了以捕捉野生苗種進(jìn)行養(yǎng)殖的問(wèn)題，穩(wěn)定優(yōu)質(zhì)的種苗輸出使黃鱔成為長(zhǎng)江流域重要的養(yǎng)殖特優(yōu)水產(chǎn)品之一。由于黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的逐步發(fā)展壯大，對(duì)其親本的培育顯得尤為重要。在集約化養(yǎng)殖中，2年齡黃鱔作為母本，每尾平均懷卵約800枚，產(chǎn)卵后發(fā)生性逆轉(zhuǎn)，在一定程度上限制了黃鱔產(chǎn)卵量。對(duì)黃鱔性逆轉(zhuǎn)基因的研究，解析性逆轉(zhuǎn)機(jī)制，為培育不發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的雌鱔奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白是一種微管運(yùn)動(dòng)蛋白，包括兩類(lèi)：dynein-1和dynein-2，dynein-1是一種蛋白復(fù)合物，參與有絲分裂過(guò)程中的膜運(yùn)輸、細(xì)胞器動(dòng)力學(xué)和染色體分離過(guò)程[9]，dynein-1包括2條重鏈、2～3條中間鏈、兩個(gè)輕中間鏈以及一些輕鏈亞基，包括dynein輕鏈(dynll1)，roadblock(dynlrb1和dynlrb2)和Tctex家族(dynlt1，dynlt3)[10]。dynlt3與性腺發(fā)育及多種功能有關(guān)，包括有絲分裂、精子運(yùn)動(dòng)、染色體分離及mRNA胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)萚11]。近期研究表明，dynlt3具有組織表達(dá)特異性[12]，DIBELLA等[13]對(duì)dynlt3在哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂中作用研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，dynlt3在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體對(duì)齊和同源染色體分離發(fā)揮重要作用。

動(dòng)力蛋白輕鏈Tctex-type 3(dynlt3)基因最初在T單倍型的小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)[14-15]，dynlt3在精子尾部鞭毛動(dòng)力蛋白和胞質(zhì)動(dòng)力蛋白中均有存在[16-17]。dynlt3在染色體分離過(guò)程中具有重要作用，人類(lèi)細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，dynlt3參與染色體聚集過(guò)程；小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中，染色體對(duì)齊過(guò)程同樣需要dynlt3參與。KING等[18]使用靶向破壞，在小鼠中滅活了dynlt3基因，缺陷型雄鼠表現(xiàn)出精子發(fā)生異常、精子活力下降、由子宮進(jìn)入輸卵管的能力下降，推測(cè)dynlt3基因可能在雄性性腺發(fā)育及精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)以雌、雄、間性發(fā)育黃鱔為研究對(duì)象，分析不同組織、不同發(fā)育時(shí)期性腺、甲基睪丸酮處理性腺及Zebularine處理性腺原代細(xì)胞后dynlt3基因表達(dá)模式變化，為黃鱔性逆轉(zhuǎn)機(jī)制解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃鱔取自湖北省仙桃市忠善黃鱔苗種繁育專(zhuān)業(yè)合作社，取樣前饑餓處理24 h，麻醉劑MS-222(500 mg/L，5 min)麻醉實(shí)驗(yàn)黃鱔，分別采集雌、間、雄性黃鱔性腺各3組，每組3～4尾。采集肝、脾、腸、腦、肌肉、皮膚、腎臟、心臟組織于RNAstore Reagent中，每組采集1齡黃鱔3～4尾，用于RNA提取。

60日齡黃鱔幼苗100尾隨機(jī)分為四組，在室溫下分別飼養(yǎng)于(230 mm×165 mm×80 mm)水箱中，水箱中注水量為2 000 mL，每日換水兩次并投喂紅蟲(chóng)漿餌料。甲基睪酮(methyltestosterone，MT)經(jīng)無(wú)水乙醇溶解至500、1 000、1 500 mg/L，每次換水后添加400 μL MT至終濃度為100、200、300 μg/L，處理2個(gè)月。取樣前暫停處理24 h，MS-222(500 mg/L)麻醉處理5 min后采集性腺，性腺樣品分為兩份，一份保存于4%多聚甲醛(pH 7.5)用于制作組織切片，另一份保存于RNAstore Reagent用于RNA提取。

1.2 生物信息學(xué)分析

將擴(kuò)增得到的dynlt3基因cDNA片段測(cè)序驗(yàn)證，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中在線軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi；www.ncbi.nlm.nih.gov/structure)預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框和保守區(qū)。利用在線工具ProtParam(https：//www.expasy.org/resources/protparam)對(duì)黃鱔DYNLT3蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)；利用在線工具PSIPRED(http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/SMART)分析DYNLT3的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用在線工具SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)DYNLT3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用MEGA 7.0軟件采用NJ法(neighbor-joining method)構(gòu)建黃鱔與其它物種的DYNLT3氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。使用在線工具WebLogo3、MEME(http：//weblogo.threeplusone.com/；https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)預(yù)測(cè)氨基酸保守序列，比對(duì)黃鱔與其它脊椎動(dòng)物的DYNLT3氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。

1.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

取40 mg組織于PBS中沖洗，剪碎組織樣品，按TRIzol Reagent說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并檢測(cè)RNA濃度，瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)，對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 Zebularine處理原代性腺細(xì)胞

收集1齡左右黃鱔卵巢組織，用PBS(含10%雙抗)沖洗性腺。將性腺剪碎，至組織塊大小為1～2 mm3左右，將處理后的組織塊用70目細(xì)胞篩過(guò)篩處理為原代單細(xì)胞。將原代單細(xì)胞懸液隨機(jī)分置四組，于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，加入完全培養(yǎng)基(10%雙抗，10%胎牛血清，DMEM高糖培養(yǎng)基)27 ℃貼壁6～12 h。將Zebularine用DMSO稀釋至100 μmol/L，實(shí)驗(yàn)組分別加入50、100、200 mg Zebularine稀釋液，對(duì)照組加入10 μL DMSO，27 ℃孵育12 h，收集原代細(xì)胞。用細(xì)胞、組織RNA柱式提取試劑盒(諾唯贊)提取細(xì)胞RNA。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

選EF-1α作內(nèi)參基因，cDNA作模板，每組3個(gè)重復(fù)。遵照2×T5 Fast qPCR Mix的使用說(shuō)明，配成10 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)在Quant Studio 5實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行，2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量；所得數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan′s法多重比較分析。

1.6 切片原位雜交

設(shè)計(jì)引物(表1)以cDNA為模板通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)探針片段進(jìn)行擴(kuò)增，按膠回收試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，檢測(cè)RNA完整性與濃度，通過(guò)T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Scientific)制備探針。

表1 引物序列Tab.1 primers sequences

雌、間、雄性黃鱔性腺切片各兩組，使用二甲苯、各濃度梯度乙醇溶液對(duì)切片進(jìn)行脫蠟處理；對(duì)脫蠟后的切片進(jìn)行4% PFA-PBS固定、HCl處理、10 μg/mL蛋白酶K消化處理。加入預(yù)雜交液(含tRNA、肝素)，70 ℃預(yù)雜交2～5 h；加入預(yù)雜交液(含反義RNA探針100～200 ng)，70 ℃過(guò)夜；50%預(yù)雜交液(無(wú)tRNA和肝素)，50% 2×SSC，70 ℃，15 min；0.2×SSC，70 ℃，2×30 min；1×MAB(100 mmol/L馬來(lái)酸，150 mmol/L NaCl，pH 7.5)室溫5 min。室溫用Blocking Buffer(10%山羊血清，2% BMB，1×MAB)封閉4 h。抗體雜交：加Blocking Buffer 500倍稀釋的抗體(Roche Applied Science，Germany)，4 ℃過(guò)夜，PBST室溫沖洗樣品。按照BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色處理；顯色理想后PBS沖洗終止顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔dynlt3基因序列分析

采用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得dynlt3全長(zhǎng)1 082 bp，5′UTR 119 bp，3′UTR 609 bp，開(kāi)放閱讀框354 bp，編碼117 aa(圖1A)。利用在線工具ProtParam對(duì)黃鱔DYNLT3蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示DYNLT3分子式為C656H1011N177O216S11，相對(duì)分子質(zhì)量為15 169，理論等電點(diǎn)為4.53，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞、酵母以及大腸桿菌體內(nèi)的半衰期分別為30 h、>20 h、>10 h，不穩(wěn)定系數(shù)為39.81，脂肪系數(shù)為71.82，總平均親水性為-0.253，屬于不穩(wěn)定親水蛋白。利用在線工具CD-Search分析DYNLT3蛋白在第23至第114位氨基酸區(qū)域?yàn)閯?dòng)力蛋白輕鏈(DLC)類(lèi)域超家族保守域[dynein light chain(DLC)-like domain superfamily，cl41776]，利用在線工具SWISS-MODEL預(yù)測(cè)DLC蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1A)。

圖1 黃鱔dynlt3基因cDNA序列與氨基酸序列及其蛋白結(jié)構(gòu)域分析與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of dynlt3 gene in M.albus；DYNLT3 protein domain analysis and tertiary structure prediction of M.albusA：dynlt3基因cDNA序列與推導(dǎo)的氨基酸序列。黃線代表5′UTR與3′UTR區(qū)域，紫色區(qū)域?yàn)槠渚幋a的氨基酸序列；B：黃鱔DYNLT3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖；C、D：DYNLT3蛋白3D視圖。

PSIPRED在線工具預(yù)測(cè)結(jié)果顯示蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包含37.96%的α-螺旋，29.20%的β-折疊，32.85%的無(wú)規(guī)則卷曲(圖1B)，利用在線工具SWISS-MODEL通過(guò)同源建模法預(yù)測(cè)DYNLT3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1C、D)，GMQE估計(jì)分?jǐn)?shù)為0.56(在0到1之間)表明預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型準(zhǔn)確性較高，可以作為DYNLT3蛋白結(jié)構(gòu)模型參考；QMEAN估計(jì)分值為-3.56(在0～4之間)表明該模型結(jié)構(gòu)具有良好的一致性，一致度達(dá)到54.63%即模型的準(zhǔn)確度可以達(dá)到95%以上，參考性較高。

2.2 黃鱔DYNLT3氨基酸序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)分析

使用在線工具WebLogo3對(duì)DYNLT3氨基酸序列與其他物種氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比預(yù)測(cè)氨基酸保守序列，DYNLT3相對(duì)保守，其編碼蛋白序列在第32-114 aa存在保守區(qū)域，與在線工具CD-Search分析相同(圖2A)。利用在線工具M(jìn)EME比對(duì)黃鱔與其它脊椎動(dòng)物DYNLT3氨基酸序列同源性分析，得出排名前三氨基酸序列及其所在氨基酸序列相對(duì)位置，且該結(jié)構(gòu)域在黃鱔與其它脊椎動(dòng)物的氨基酸序列中僅存在幾個(gè)氨基酸的差異(圖2B、C)。

圖2 DYNLT3氨基酸序列多重比較及其保守序列及氨基酸序列相對(duì)位置Fig.2 Multiple comparison of DYNLT3 amino acid sequences；The conserved amino acid sequence of DYNLT3 and its relative position in the amino acid sequence

在黃鱔DYNLT3氨基酸序列與GenBank中已知物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析基礎(chǔ)上，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建黃鱔與其他物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示黃鱔與底鳉(Fundulusheteroclitus)、鯉(Cyprinuscarpio)、鯽(Carassiusauratus)等聚為一大支；哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)和爬行類(lèi)聚為一支；兩棲類(lèi)聚為獨(dú)立一支(圖3)。且黃鱔DYNLT3氨基酸序列與底鳉親緣關(guān)系最近，該結(jié)果符合物種一般進(jìn)化規(guī)律。

圖3 基于黃鱔與不同物種DYNLT3氨基酸序列的NJ進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 NJ phylogenetic tree analysis based on DYNLT3 amino acid sequences of M.albus and different species

2.3 黃鱔dynlt3基因組織表達(dá)分析

通過(guò)RT-PCR對(duì)黃鱔dynlt3基因進(jìn)行不同組織的表達(dá)分析，結(jié)果顯示dynlt3在黃鱔肌肉和腦具有較高表達(dá)，心臟次之，在皮膚、脾臟、腎臟以及胃中表達(dá)中等，在腸、肝和卵巢有較低表達(dá)且差異顯著(圖4A)；dynlt3基因在黃鱔性腺不同發(fā)育階段表達(dá)結(jié)果顯示，dynlt3在雌性卵巢至間性早期黃鱔性腺中表達(dá)量無(wú)顯著性差異，間性后期與雄性睪丸中表達(dá)量無(wú)顯著性差異，但顯著高于卵巢與間性早期表達(dá)量(圖4B)。

圖4 dynlt3基因在黃鱔不同組織、不同性腺發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)Fig.4 Expression of dynlt3 gene at different gonad development stages in different tissues of M.albus圖中不同字母表示各組織之間差異顯著(P<0.05)；Sk：皮；He：心；In：腸；Mu：肌肉；Li：肝；Sp：脾；Ki：腎；Ov：卵巢；Br：腦；St：胃。

2.4 黃鱔dynlt3基因組織表達(dá)定位

通過(guò)原位雜交技術(shù)對(duì)黃鱔卵巢、間性性腺、精巢細(xì)胞中dynlt3的表達(dá)定位分析。結(jié)果顯示使用正義RNA探針雜交性腺中未檢測(cè)到dynlt3的陽(yáng)性信號(hào)(圖5A)，使用反義RNA探針原位雜交的性腺中可檢測(cè)到藍(lán)紫色陽(yáng)性信號(hào)。在II時(shí)期卵巢中dynlt3基因主要在卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)(圖5B)；間性性腺組織中dynlt3基因主要在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)(圖5C)；精巢組織中可在精原細(xì)胞與初級(jí)精母細(xì)胞中檢測(cè)到dynlt3基因表達(dá)(圖5D)。

圖5 黃鱔dynlt3基因在不同發(fā)育階段性腺中的表達(dá)定位Fig.5 The expression and location of dynlt3 in gonads at different developmental stagesA：對(duì)照組；B：卵巢；C：間性發(fā)育時(shí)期；D：精巢；Ch：染色質(zhì)；FM：濾泡膜；N：細(xì)胞核；Nu：核仁；Oo II：II時(shí)相卵母細(xì)胞；Oo III：III時(shí)相卵母細(xì)胞；PSG：初級(jí)精母細(xì)胞；SG：精原細(xì)胞；Va：液泡；YG：卵黃顆粒；YM：卵黃塊；Yp：卵黃小板。

2.5 MT處理后卵巢結(jié)構(gòu)變化及Zebularine處理原代性腺細(xì)胞dynlt3表達(dá)模式分析

將2月齡黃鱔采用MT處理2個(gè)月后，HE切片結(jié)合顯微鏡觀察，結(jié)果表明經(jīng)MT處理后卵巢組織結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯退化，主要表現(xiàn)為II時(shí)相卵母細(xì)胞退化且數(shù)量減少，卵膜與卵質(zhì)明顯分離，卵巢結(jié)締組織間出現(xiàn)空泡結(jié)構(gòu)(圖6A)。MT處理2月后，退化卵巢中dynlt3基因的表達(dá)量降低，且與對(duì)照組表達(dá)量存在顯著差異(圖6B)。

取1齡黃鱔卵巢，將性腺組織處理為單細(xì)胞，進(jìn)行原代性腺細(xì)胞培養(yǎng)。向培養(yǎng)基中添加Zebularine進(jìn)行去甲基化處理后，dynlt3基因在不同濃度梯度Zebularine處理原代細(xì)胞中表達(dá)無(wú)顯著性差異(圖6C)。

3 討論

本研究成功克隆了dynlt3基因，全長(zhǎng)1 082 bp，5′UTR 119 bp，3′UTR 609 bp，開(kāi)放閱讀框354 bp，編碼117 aa。通過(guò)在線工具SMART分析黃鱔DYNLT3蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示，DYNLT3蛋白在第32至第114位氨基酸區(qū)域?yàn)閯?dòng)力蛋白輕鏈(DLC)類(lèi)域超家族保守域，在不同的家族成員之間具有高度的同源性。dynein輕鏈(DLC)-like結(jié)構(gòu)域超家族是一類(lèi)含有DLC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，該結(jié)構(gòu)域具有反向平行的β-折疊與α-螺旋。含有DLC類(lèi)結(jié)構(gòu)域的蛋白包括細(xì)胞質(zhì)dynein輕鏈DYNLL1和DYNLL2、動(dòng)力蛋白輕鏈Tctex型DYNLT1和DYNLT3[10]等。

在魚(yú)類(lèi)的性別發(fā)育過(guò)程中存在天然的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，黃鱔具有典型的“首雌特征”即先為雌性卵巢，卵巢發(fā)育完全后逆轉(zhuǎn)為雄性精巢。目前對(duì)于黃鱔性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中差異表達(dá)基因的研究主要在呈現(xiàn)出性別二態(tài)性的基因，如cypl9a、foxl2、gdf9等基因。對(duì)于性逆轉(zhuǎn)過(guò)程中其他差異表達(dá)基因研究較少。本研究從黃鱔卵巢、間性性腺、精巢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中獲的差異表達(dá)基因dynlt3。檢測(cè)dynlt3基因在不同組織中mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該基因在多個(gè)組織器官中都有表達(dá)，其中肌肉和腦中的表達(dá)量最高，腸、肝和卵巢中表達(dá)量較低。

通過(guò)對(duì)比不同性腺發(fā)育時(shí)期表達(dá)量結(jié)果顯示，dynlt3基因在雌性發(fā)育時(shí)期與間性發(fā)育早期表達(dá)量較低，隨著性腺逐漸向雄性性腺發(fā)育，基因表達(dá)量逐漸增加。RASHID等[19]對(duì)患弱精子癥小鼠dynlt3表達(dá)水平研究表明，dynlt3表達(dá)水平與精子活力和形態(tài)呈顯著正相關(guān)，dynlt3基因可能影響鞭毛的結(jié)構(gòu)和功能。LI等[20]對(duì)差異表達(dá)的蛋白DYNLT1在精子細(xì)胞發(fā)育和鞭毛組裝等階段進(jìn)行特異性富集分析，結(jié)果表明DYNLT1在精子尾部發(fā)育中發(fā)揮重要作用[20]。在間性后期與雄性發(fā)育時(shí)期黃鱔性腺中初級(jí)精母細(xì)胞開(kāi)始逐漸發(fā)育為次級(jí)精母細(xì)胞和精子[21]，因此，精巢中dynlt3基因表達(dá)水平是由精巢發(fā)育水平影響，綜上推測(cè)dynlt3基因在性逆轉(zhuǎn)過(guò)程及精子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

甲基睪酮為天然雄激素睪酮的17-α位甲基衍生物，具有抗雌激素作用，抑制卵巢功能及子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)。將MT添加到幼鯢飼料中可使雄性大鯢比例顯著升高，表明飼喂添加性激素類(lèi)似物可顯著增加幼鯢發(fā)生性反轉(zhuǎn)比例[22]。在使用性激素處理黃鱔實(shí)驗(yàn)中，注射MT未得到具有生殖能力的性逆轉(zhuǎn)雄魚(yú)，但MT可促進(jìn)雌鱔卵母細(xì)胞退化[23]。本研究通過(guò)在水體中添加甲基睪酮抑制卵巢功能及性腺細(xì)胞發(fā)育，由HE染色結(jié)果可知，MT處理導(dǎo)致黃鱔生殖板周?chē)纬纱竺娣e中空，生殖板出現(xiàn)明顯增粗延長(zhǎng)毛細(xì)血管豐富，且組織中出現(xiàn)卵膜與卵質(zhì)分離現(xiàn)象。上述現(xiàn)象表明，MT處理可能促進(jìn)卵巢退化，且生殖板周?chē)霈F(xiàn)中空小葉，但未見(jiàn)卵巢排卵，說(shuō)明生殖板周?chē)霈F(xiàn)的中空是由于MT處理作用下雌性組織中II時(shí)相卵母細(xì)胞退化及雄性發(fā)育進(jìn)程加速導(dǎo)致的。該結(jié)果與黃鱔外源性甲基睪酮實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同[23]，dynlt3基因在性腺組織中的表達(dá)相較于對(duì)照組呈顯著性下降(P<0.05)，推測(cè)該基因表達(dá)水平下降是由于MT處理使卵母細(xì)胞早期發(fā)育抑制引起的，綜上所述，dynlt3基因在卵母細(xì)胞早期發(fā)育中發(fā)揮重要生物作用。

RNA原位核酸雜交又稱(chēng)RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)可在性腺組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測(cè)組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合。通過(guò)原位雜交來(lái)對(duì)卵巢組織、間性性腺組織、精巢組織細(xì)胞中dynlt3基因的表達(dá)進(jìn)行定位，結(jié)果顯示在三組性腺組織中均存在陽(yáng)性表達(dá)。在雌性組織中dynlt3基因主要在Ⅱ時(shí)相卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，同時(shí)期對(duì)照組中未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)；在間性性腺中dynlt3基因主要在精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)；雄性組織中dynlt3基因在初級(jí)精母細(xì)胞及次級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)明顯。

Zebularine是一種DNA甲基化(DNA methylation)抑制劑，其作用機(jī)制可能是與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases)形成致密共價(jià)復(fù)合物阻止了Dnmt的釋放，從而使DNA達(dá)到去甲基化狀態(tài)[24-25]。本研究中通過(guò)對(duì)原代性腺細(xì)胞使用Zebularine處理，降低原代性腺細(xì)胞甲基化水平，對(duì)dynlt3基因表達(dá)模式進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)Zebularine處理，dynlt3基因表達(dá)未呈現(xiàn)顯著性差異，因此無(wú)法判斷甲基化是否在dynlt3基因表達(dá)過(guò)程中的作用，甲基化修飾在dynlt3基因表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮的作用還有待研究確定。