13份化橘紅種質(zhì)的鑒定研究

葉賓　黃潔文　李 宇　魏鴻瑤　吳良肪　丁 玙　谷瀟雨　趙杰堂　胡桂兵　秦永華　王艷慧　張志珂

關(guān)鍵詞：化橘紅；種質(zhì)鑒定；植物學(xué)性狀；化學(xué)成分；分子標(biāo)記

中圖分類號：S666.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

化橘紅為蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）化州柚（Citrus grandis ‘Tomentosa）或柚[Citrusgrandis （L.） Osbeck]的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，通過清洗、殺青、烘干、修剪、陳放后得到。化橘紅是一種廣東省的道地藥材，一般產(chǎn)自廣東省化州市，因其含有豐富的二氫黃酮、野漆樹苷、柚皮苷等成分，具有散寒燥濕、利氣消疾、止咳化痰及健脾消食等功效，素有“南方人參”的美譽(yù)，隨著產(chǎn)業(yè)的擴(kuò)張，化橘紅在市場上出現(xiàn)的問題也日益明顯，以假充真、以次充好或產(chǎn)品標(biāo)識(shí)不全的現(xiàn)象充斥在化橘紅交易市場中。

以化州當(dāng)?shù)毓r(nóng)的習(xí)慣，根據(jù)果實(shí)表面絨毛多少，可將化橘紅品系分為6 類：正毛、黃龍正毛、密葉正毛、副毛、假西洋、光青[1]。正毛化橘紅與非正毛化橘紅的種苗在外觀形態(tài)上非常相似，運(yùn)用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法很難加以區(qū)分。有研究證明毛橘紅的藥用價(jià)值更高[2]，其售價(jià)也會(huì)更高，由于市場的不規(guī)范導(dǎo)致利用光橘紅冒充毛橘紅的現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，如何對不同種質(zhì)的化橘紅進(jìn)行辨別和分類，對于農(nóng)戶和市場來說都是一個(gè)亟需解決的問題[3]。

能否通過多種手段對化州當(dāng)?shù)夭煌a(chǎn)區(qū)的正毛化橘紅和非正毛化橘紅進(jìn)行鑒定和區(qū)分，相關(guān)文獻(xiàn)中大多采用一種方法（如分子標(biāo)記或形態(tài)學(xué)分析）進(jìn)行鑒定。因此，本研究通過植物性狀觀察、結(jié)合化學(xué)分析成分以及利用分子標(biāo)記技術(shù)對化州不同產(chǎn)地的13 份化橘紅材料進(jìn)行種質(zhì)鑒別，為更好地對不同種類的化橘紅進(jìn)行有效辨別和鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以化州當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)分類的正毛化橘紅（大合黃絨、大合密葉、平定黃絨、平定密葉、平定紅肉、山車正毛、帶刺正毛）和非正毛化橘紅（山車鳳尾、山車副毛、山車假西洋、山車光青、平定金錢篤、平定實(shí)生梨）共13 份化橘紅種質(zhì)作為供試材料，每種化橘紅共收集健康且生長狀況相近的花30 朵、葉15 片及大小相近的果實(shí)10 個(gè)用作植物學(xué)性狀特征的測定和分析，其中葉片采自樹體上方每個(gè)春梢的前1～5 片新葉，花主要采自樹體上方每個(gè)春梢的前1～10 朵花，果實(shí)主要采自樹體下方生長較密集的區(qū)域；以其果實(shí)干品為材料進(jìn)行藥用成分的提?。灰匀~片作為材料提取DNA，以供后續(xù)分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 方法

1.2.1 化橘紅種質(zhì)植物學(xué)特征性狀的測定 本研究對化橘紅種質(zhì)植物學(xué)特征的測定主要參照柑橘種質(zhì)資源描述規(guī)范（NY/T 2930—2016），對葉片進(jìn)行葉形、葉長、葉寬、葉型指數(shù)、葉緣形狀、翼葉長、翼葉寬、葉尖形狀、翼葉形狀、葉基形狀和L*、a*、b*等植物學(xué)特征性狀進(jìn)行測定。以葉型指數(shù)=葉長/葉寬的計(jì)算公式對葉型指數(shù)進(jìn)行計(jì)算；用色差儀測定每片葉片的顏色；肉眼觀察葉緣形狀、葉基形狀等其他植物學(xué)性狀并記錄；每個(gè)種質(zhì)隨機(jī)取其中2 片葉片，拍攝其正反面。對化橘紅種質(zhì)的花瓣顏色、花瓣數(shù)量、花瓣長度、花瓣寬度、花形指數(shù)、花粉數(shù)量、花柱及雄蕊數(shù)這8 項(xiàng)植物學(xué)特征性狀進(jìn)行測定和數(shù)據(jù)記錄?；ㄐ椭笖?shù)=花瓣長/花瓣寬；每個(gè)種質(zhì)隨機(jī)取出其中2朵花，拍攝其正側(cè)面。對化橘紅種質(zhì)的單果重、果面顏色、中果皮顏色、果實(shí)縱橫徑、果型指數(shù)、果基形狀、有無果頸、果基凹陷、果頂形狀、果頂印圈等植物學(xué)特征性狀進(jìn)行測定和數(shù)據(jù)記錄；每個(gè)種質(zhì)取出其中3 個(gè)果實(shí)，拍攝其正面、側(cè)面、背面、橫切面和縱切面的照片。

1.2.2 化橘紅種質(zhì)的化學(xué)成分檢測分析 本研究主要對化橘紅化學(xué)成分中的總黃酮（柚皮苷）、野漆樹苷、水溶性浸出物（包含多糖物質(zhì)、水溶果膠、水溶性維生素、水溶蛋白和無機(jī)鹽等）和醇溶性浸出物（包括皂苷類成分等）4 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行提取和檢測，每種指標(biāo)測定重復(fù)5 次。

依據(jù)《地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品 化橘紅》[4]所提供的方法，測定化橘紅種質(zhì)的總黃酮（柚皮苷）含量；依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015 年版[5]，利用HPLC 測定化橘紅種質(zhì)的野漆樹苷含量；參照《中華人民共和國藥典四部 2020》[6]的方法，測定水溶性浸出物和醇溶性浸出物。

1.2.3 分子標(biāo)記鑒定化橘紅種質(zhì) 采用CTAB 法提取葉片DNA，參照張靜芳等[7]的方法，確定用于ISSR 的單引物共14 個(gè)（表1）和SRAP 的引物共20 對（表2）。

參照趙依杰等[8]的方法確定ISSR 的反應(yīng)體系，PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，根據(jù)不同的引物調(diào)整最適退火溫度，退火1 min，72℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。參照燕佳文等[9]的方法確定SRAP 的總反應(yīng)體系，PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，根據(jù)不同的引物調(diào)整最適的退火溫度，退火1 min，72℃延伸1 min，共5 個(gè)循環(huán)；緊接以上反應(yīng)條件后94℃變性1 min，最適溫度下退火1 min，72℃下延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物均由2%的瓊脂糖凝膠檢測，130 V 下電泳60 min，所得產(chǎn)物于凝膠成像系統(tǒng)下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0 軟件對所測定每份種質(zhì)的葉、花、果等數(shù)量性狀進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示各項(xiàng)數(shù)據(jù)；計(jì)算每份種質(zhì)中各項(xiàng)化學(xué)成分指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)Neis 遺傳一致度，采用SPSS 23.0 軟件將化學(xué)成分含量的測定結(jié)果結(jié)合性狀的測定結(jié)果利用非加權(quán)配對算數(shù)平均法（unweighted pair groupmethod using arithmetic average，UPGMA）對其進(jìn)行相關(guān)性聚類分析。利用Popgen 32 軟件對ISSR 和SRAP 條帶進(jìn)行觀察和記錄，無特異性條帶的地方記為“0”，有則記為“1”，采用SPSS 23.0 軟件根據(jù)Neis 遺傳一致度，用UPGMA 將ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行整合，對13 份化橘紅種質(zhì)進(jìn)行遺傳聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物學(xué)特征性狀數(shù)據(jù)的整理和分析

13份化橘紅種質(zhì)的性狀測定結(jié)果見表3。13份種質(zhì)在葉緣形狀、翼葉形狀和葉基形狀上無顯著差異；大部分正毛種質(zhì)的葉顯著比非正毛更長；正毛的葉寬與非正毛的無顯著差異；葉型指數(shù)上，若以1.90 為閾值，非正毛種質(zhì)中山車鳳尾、山車假西洋、山車光青、山車副毛、平定金錢篤和實(shí)生梨形皆小于1.90，正毛中除平定紅肉和帶刺正毛外皆大于1.90，說明大部分正毛種質(zhì)的葉要比非正毛更細(xì)長；在色差測定中，若以L*值42.00為閾值，所有非正毛種質(zhì)均小于42.00，正毛中僅有平定紅肉和帶刺正毛小于42.00，說明正毛種質(zhì)的葉總體上比非正毛更偏白；從所測a*值可知所有非正毛種質(zhì)（山車鳳尾、山車假西洋、山車光青、山車副毛、平定金錢篤、實(shí)生梨形）均大于–17.00，正毛種質(zhì)除平定紅肉和帶刺正毛外均小于–17.00，說明大部分正毛種質(zhì)的葉比非正毛更偏綠；從所測b*值可知所有非正毛種質(zhì)（山車鳳尾、山車假西洋、山車光青、山車副毛、平定金錢篤、實(shí)生梨形）均小于25.00，正毛種質(zhì)除平定紅肉和帶刺正毛外均大于25.00，說明大部分正毛種質(zhì)的葉比非正毛更偏黃。

花的性狀測定結(jié)果見表4，在花瓣數(shù)量、花瓣顏色和花柱狀況上這13 份種質(zhì)無顯著差異；在花瓣長度上，非正毛種質(zhì)山車鳳尾、山車光青、山車副毛、平定金錢篤和實(shí)生梨形的均值均在23.00 mm 以下，而正毛種質(zhì)除平定黃絨、大合黃絨和大合密葉外，剩余均在23.00 mm 以上，最大的是平定密葉，均值為36.77 mm；在花瓣寬度上，非正毛種質(zhì)山車鳳尾、山車光青、山車副毛和實(shí)生梨形的均值均小于9.50 mm，僅有平定金錢篤大于9.50 mm，為9.67 mm，而在正毛種質(zhì)中有平定黃絨、平定密葉、大合黃絨和大合密葉4 份種質(zhì)大于9.50 mm，剩余正毛種質(zhì)的花瓣寬度均大于9.50 mm，最大的是帶刺正毛，均值為10.91 mm；在花粉數(shù)量上，山車鳳尾、山車假西洋和平定金錢篤的花粉數(shù)量測定為中或少，3 份均為非正毛種質(zhì)；在雄蕊數(shù)上，兩類種質(zhì)無顯著差異。

果實(shí)性狀測定結(jié)果見表5。13 份化橘紅種質(zhì)在放射溝紋、果頂印圈、果頂凸環(huán)、果皮顏色、果心充實(shí)度和中果皮顏色這6 個(gè)性狀中無顯著差異；在果形上，正毛和非正毛種質(zhì)有顯著差異，其中山車假西洋、山車光青、山車副毛、平定金錢篤和實(shí)生梨形等非正毛種質(zhì)中果形指數(shù)大于0.95，多呈球形或梨形，而正毛種質(zhì)果實(shí)果型指數(shù)小于0.95，整體呈高扁圓形，差異顯著；在果頂形狀上，非正毛種質(zhì)多呈平滑狀，正毛種質(zhì)多淺凹；在果基形狀上，2 類種質(zhì)無顯著差異。以平均果型指數(shù)0.95 作為分界時(shí)，可見非正毛種質(zhì)山車鳳尾、山車假西洋、山車光青、山車副毛和實(shí)生梨形的果型指數(shù)均大于0.95，僅有平定金錢篤小于0.95；正毛種質(zhì)中有山車正毛和大合密葉果型指數(shù)大于0.95，剩余正毛種質(zhì)中平定黃絨和平定紅肉的果形指數(shù)分別為0.81 和0.89，小于0.90，和非正毛種質(zhì)差異較大。從果實(shí)橫縱徑也可看出，正毛種質(zhì)的果實(shí)形狀相比非正毛種質(zhì)更趨向于扁圓，而非正毛種質(zhì)果實(shí)更趨向于球形。

2.2 化橘紅種質(zhì)干品的化學(xué)成分

化橘紅種質(zhì)的化學(xué)成分檢測結(jié)果見表6。在13 份化橘紅樣品中，絕大多數(shù)正毛種質(zhì)的野漆樹苷平均含量高于5.00 mg/g，平均含量最高的種質(zhì)為大合黃絨和山車正毛，分別達(dá)到了11.80 mg/g和11.59 mg/g ； 6 份非正毛樣品除山車副毛（5.01 mg/g），其他種質(zhì)的野漆樹苷平均含量均低于5.00 mg/g，尤其是山車假西洋和平定實(shí)生梨形，含量低于1.00 mg/g，非正毛種質(zhì)的野樹漆苷含量與正毛有顯著差異，可以一定程度上區(qū)分出正毛和非正毛化橘紅。

13份材料中有8 份化橘紅樣品（其中包括3份正毛和5 份非正毛材料）的柚皮苷平均含量高于80.00 mg/g ， 平均含量最高為平定金錢篤（124.53 mg/g），非正毛的山車光青和山車副毛柚皮苷平均含量分別為117.57 mg/g 和106.35 mg/g，剩余5 份材料的柚皮苷含量均低于80.00 mg/g，其中最低為山車鳳尾（25.30 mg/g），另外4 份為正毛化橘紅；待測種質(zhì)中正毛和非正毛化橘紅中均存在柚皮苷含量相對較高且含量接近的種質(zhì)，因此不能完全將正毛種質(zhì)和非正毛種質(zhì)區(qū)分開來；平定黃絨種質(zhì)柚皮苷含量要低于大合黃絨，而大合密葉則比平定密葉要低，說明不同的產(chǎn)區(qū)或地理?xiàng)l件也可能影響化橘紅種質(zhì)的柚皮苷含量。

正毛與非正毛種質(zhì)在醇溶性浸出物中有顯著性差異，在水溶性浸出物中無顯著差異。13份化橘紅種質(zhì)的醇溶性浸出物含量為25%～39%，其中含量最低的為山車正毛（25.83%），含量最高的為山車鳳尾（38.65%）；在正毛化橘紅種質(zhì)中，醇溶性浸出物的含量為25%～35%，部分種質(zhì)的浸出物含量低于30%，而在非正毛化橘紅種質(zhì)中，醇溶性浸出物為35%～39%，除平定金錢篤（34.33%）和石灣實(shí)生帶刺（36.50%）以外，相比于大多數(shù)正毛化橘紅種質(zhì)，非正毛種質(zhì)（山車正毛、山車光青、山車假西洋和山車鳳尾）的含量相對更高；水溶性浸出物含量為33%～42%，含量最低的是山車正毛，為32.91%；含量最高的是山車假西洋，為41.82%；在正毛化橘紅中，水溶性浸出物的含量為33%～42%，而非正毛種質(zhì)則為36%～42%，相對于部分正毛化橘紅，其水溶性浸出物含量更高， 但與平定密葉（ 36.75% ）、平定金錢篤（39.42%）、大合密葉（39.56%）等種質(zhì)相比，其水溶性浸出物的含量差異并不大。

2.3 植物學(xué)性狀與化學(xué)成分結(jié)果的聚類分析聚類分析

結(jié)果見圖1，以遺傳距離為10 cM作為分界時(shí)，可將13 份化橘紅種質(zhì)聚為4 類，其中平定黃絨、平定密葉、大合密葉、山車正毛、山車副毛、山車鳳尾、平定金錢篤、平定紅肉、平定實(shí)生梨以及山車光青10 份種質(zhì)聚為第1 類，山車假西洋、大合黃絨和石灣帶刺正毛分別單獨(dú)聚為第2、第3 和第4 類。在第1 類聚類結(jié)果中既存在正毛化橘紅（平定黃絨、平定密葉等），也存在非正毛化橘紅（山車副毛、山車鳳尾等），因此僅依靠植物學(xué)性狀和化學(xué)成分無法區(qū)分13 份種質(zhì)中的正毛和非正毛化橘紅。

2.4 化橘紅種質(zhì)的分子標(biāo)記

2.4.1 ISSR 分子標(biāo)記鑒定化橘紅種質(zhì) ISSR 擴(kuò)增結(jié)果見表7。所有引物擴(kuò)增共獲得103 條擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶共有77 條，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為74.8%；引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為5～10 條，平均7.4 條；多態(tài)性條帶數(shù)為3～8 條，平均5.5條；部分引物擴(kuò)增結(jié)果見圖2，擴(kuò)增條帶數(shù)最多的為引物Z809，共擴(kuò)增出10 條條帶，其中多態(tài)性8 條，多態(tài)率為80%（圖2）。

2.4.2 SRAP 分子標(biāo)記鑒定化橘紅種質(zhì) SRAP擴(kuò)增結(jié)果見表8，所有引物擴(kuò)增共獲得76 條擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶共有72 條，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為94.7%；引物擴(kuò)增條帶為1～8 條，平均3.8 條；多態(tài)性條帶數(shù)為1～8 條，平均3.6 條，多態(tài)性相對ISSR 較低；部分?jǐn)U增結(jié)果見圖3。

2.5 13 份化橘紅種質(zhì)的ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記結(jié)果的聚類分析

13份化橘紅種質(zhì)的聚類分析結(jié)果見圖4，當(dāng)遺傳距離為15 cM 時(shí)，可將13 份化橘紅分為4類。其中大合密葉、平定黃絨、大合黃絨、山車正毛、平定紅肉、帶刺正毛、山車假西洋和平定密葉共8 份種質(zhì)聚為第1 類，山車副毛和山車光青2 份種質(zhì)聚為第2 類，山車鳳尾和平定金錢篤2 份種質(zhì)聚為第3 類，實(shí)生梨形單獨(dú)聚為第4 類。

從聚類分析結(jié)果看，第1類中的8份種質(zhì)除山車假西洋外均為正毛化橘紅，在果實(shí)絨毛、果實(shí)形狀等性狀上均較為相似，而第2、第3 和第4 類共5 份種質(zhì)均為非正毛化橘紅，與第1 類中的種質(zhì)在葉長、葉型指數(shù)、色差值、花瓣長、果實(shí)形狀和有無茸毛等性狀上差異顯著。由此可見，ISSR和SRAP 分子標(biāo)記能較好地區(qū)分正毛和非正毛化橘紅種質(zhì)。

2.6 13份化橘紅種質(zhì)植物學(xué)性狀與化學(xué)成分含量的相關(guān)性分析

13份化橘紅種質(zhì)植物學(xué)性狀測定及化學(xué)成分含量相關(guān)性分析結(jié)果見表9，化橘紅果實(shí)的野漆樹苷含量與花瓣數(shù)量、果實(shí)橫徑呈顯著正相關(guān)（P<0.05），水溶性浸出物與L*值呈顯著正相關(guān)；野漆樹苷含量與果型指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），從該結(jié)果推測化橘紅的植物學(xué)性狀中僅有果型指數(shù)和果實(shí)形狀與化學(xué)成分含量相關(guān)性較大，果型指數(shù)對有效成分的含量影響更大；其他植物學(xué)性狀與化學(xué)成分含量間無顯著相關(guān)。

3 討論

3.1 關(guān)于化橘紅植物學(xué)性狀對種質(zhì)鑒別的影響

許多植物學(xué)性狀可對化橘紅的種質(zhì)鑒別產(chǎn)生影響，缺少相關(guān)的性狀數(shù)據(jù)會(huì)導(dǎo)致化橘紅資源管理的欠缺，阻礙化橘紅的生產(chǎn)與發(fā)展[10]。通過肉眼觀察部分性狀能直觀地區(qū)分正毛和非正毛化橘紅，如正毛和非正毛種質(zhì)的葉型指數(shù)有顯著差異；其次，相對于正毛種質(zhì)的葉尖而言，部分非正毛種質(zhì)（光青、副毛）的葉尖更鈍；還可直接觀察果實(shí)形狀和果面上的茸毛量等。若借助實(shí)驗(yàn)儀器（游標(biāo)卡尺、色差儀、電子天秤等）進(jìn)行其他性狀（如葉型指數(shù)、花型指數(shù)、果型指數(shù)和單果重等）進(jìn)行測定，便能對化橘紅種質(zhì)作更進(jìn)一步的鑒別。在13 份化橘紅種質(zhì)中，無論葉、花還是果實(shí)在正毛和非正毛種質(zhì)中均存在差異顯著的性狀，這與曹征等[11]的研究結(jié)果一致，測定植物學(xué)性狀是化橘紅種質(zhì)鑒別的有效手段之一。

3.2 化橘紅種質(zhì)化學(xué)成分含量差異的原因及其在種質(zhì)鑒別上的應(yīng)用

不同產(chǎn)地及品種的化橘紅種質(zhì)，其內(nèi)在所含的化學(xué)成分的含量也會(huì)存在差異[12]；通常來說，相同條件下毛橘紅化學(xué)成分含量要比光橘紅高。因此，針對來自不同產(chǎn)地的13 份化橘紅種質(zhì)可通過測定果實(shí)干品化學(xué)成分含量，對其進(jìn)行質(zhì)量檢測分析，通過化學(xué)成分的含量差異對這些種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分和鑒定。作為一款應(yīng)用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥材，對于化橘紅各種化學(xué)成分的研究也有不少報(bào)道，方法也在不斷地創(chuàng)新，發(fā)揮藥用作用的如柚皮苷[13]、野漆樹苷等[14]，其提取和測定的效率對于化橘紅作為中藥材在市場上的應(yīng)用有著十分重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)在這13 份種質(zhì)中，正毛和非正毛化橘紅的化學(xué)成分含量不同，尤其是野漆樹苷和醇浸出物的含量有顯著差異，推測這2個(gè)成分可作為種質(zhì)鑒別的參考依據(jù)之一；不同產(chǎn)地可能會(huì)對相同種質(zhì)的藥效產(chǎn)生一定影響，由于化州市各鄉(xiāng)鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)在地形、生態(tài)和土壤環(huán)境等存在較大差異[15]，推測可能是氣候、土壤等環(huán)境因素或管理水平等會(huì)影響種質(zhì)的化學(xué)成分。本研究中正毛和非正毛種質(zhì)在柚皮苷和水溶性浸出物上無顯著差異，部分正毛種質(zhì)還出現(xiàn)了柚皮苷含量相對較低的情況，同樣也可能是受環(huán)境因素影響，也可能是加工和保存過程中造成部分正毛種質(zhì)果實(shí)的化學(xué)成分含量發(fā)生變化[16]；相反，平定金錢篤和山車光青等一些非正毛化橘紅也有著相對較高的柚皮苷含量，因此也具有良好的藥用功效。從研究結(jié)果推論，以醇溶性浸出物含量作為標(biāo)準(zhǔn)對正毛和非正毛化橘紅進(jìn)行區(qū)分和鑒定的效果優(yōu)于水溶性浸出物，可以用作區(qū)分正毛化橘紅和非正毛化橘紅的手段和參考依據(jù)之一；水溶性浸出物一般包含各種游離氨基酸、核苷酸和糖原、糖類等物質(zhì)，而醇溶性浸出物包含皂苷物質(zhì)和其他各種有機(jī)物質(zhì)等，均是人體所需的一部分營養(yǎng)物質(zhì)，對于研究化橘紅的藥用功效有著重要意義。通過化學(xué)成分結(jié)果可以看出從野漆樹苷和醇溶性浸出物含量，對于13 份化橘紅種質(zhì)的鑒別和區(qū)分都有著良好的效果，說明利用化學(xué)成分也可在一定程度上鑒別和區(qū)分不同類別化橘紅種質(zhì)。

因此在實(shí)際的化橘紅種植和生產(chǎn)中，選擇種植品種時(shí)要充分考慮當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境條件[17]，最大程度增加橘紅果實(shí)的藥用價(jià)值，也可適當(dāng)種植部分化學(xué)成分較高的非正毛種質(zhì)，增加當(dāng)?shù)亻偌t的多樣性，有利于化橘紅種植產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展。總的來說，對化橘紅的化學(xué)成分測定和分析都是十分重要且對橘紅產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大的一項(xiàng)工作。

3.3 ISSR 與SRAP 分子標(biāo)記對于化橘紅種質(zhì)鑒別效果的比較

ISSR 和SRAP 兩種分子標(biāo)記能成功地將13 份化橘紅種質(zhì)中的正毛與非正毛種質(zhì)從一定程度上區(qū)分開來，與前人用ISSR 實(shí)驗(yàn)的鑒定結(jié)果吻合[3]。SRAP 的條帶數(shù)量和多態(tài)性條帶數(shù)量都比ISSR少，可能是SRAP 的引物組合可能對于外界溫度的變化較ISSR 的敏感，在一定程度上影響了SRAP 的結(jié)果；從聚類結(jié)果可知，2 種分子標(biāo)記綜合聚類下可將13 份化橘紅種質(zhì)區(qū)分為正毛和非正毛兩大類，鑒定效果較好。

ISSR 和SRAP 分子標(biāo)記能很好地應(yīng)用于化橘紅的種質(zhì)鑒別，2 種分子標(biāo)記方法各有優(yōu)劣，而相比于ISSR 分子標(biāo)記，SRAP 分子標(biāo)記在引物組合選擇上更為靈活，正向引物可與反向引物兩兩組合，使用效率更高[18]。因此，在實(shí)際操作中，應(yīng)當(dāng)依據(jù)不同分子標(biāo)記的特點(diǎn)和注意事項(xiàng)，力求得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.4 13 份化橘紅種質(zhì)植物學(xué)性狀、化學(xué)成分與分子標(biāo)記結(jié)果的相關(guān)性分析

化橘紅果實(shí)的形狀與其所含的化學(xué)成分有較大的關(guān)系，更趨向于扁圓形的果實(shí)的化學(xué)成分含量越高，而正毛化橘紅果實(shí)的形狀趨向于高扁圓形，而非正毛化橘紅果實(shí)更趨向于梨形或球形。化州柚的化學(xué)成分含量要顯著高于光青柚和其他柚，一定程度上也說明正毛的化學(xué)成分要高于非正毛種質(zhì)，與前人研究結(jié)果[19]一致。曹征等[11]通過聚類分析將正毛橘紅歸為第1 類，光橘紅歸為第2 類，且第2 類化橘紅種質(zhì)資源的化學(xué)成分含量更高。水溶性浸出物含量與L*值呈顯著正相關(guān)，葉片的L*值越高，其水溶性浸出物含量（如游離氨基酸等各類含氮營養(yǎng)物質(zhì)）可能也越高。2種分子標(biāo)記都可將13 份種質(zhì)以平定假西洋為界分為正毛和非正毛種質(zhì)，二者在部分植物學(xué)性狀上存在顯著差異，如葉長、葉型指數(shù)、色差值、花瓣長、果實(shí)形狀和有無茸毛等，可知分子標(biāo)記結(jié)果與植物性狀具有一定的相關(guān)性。

3.5 化橘紅種質(zhì)鑒定研究對其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的實(shí)際應(yīng)用和意義

首先，橘紅作為化州市的特色支柱產(chǎn)業(yè)[20]，不僅用途廣泛，對于延緩咳嗽、利氣消疾等病癥都有著相當(dāng)顯著的藥用功效。橘紅在市面上的需求量也日益增長，除了化州道地產(chǎn)區(qū)在逐步擴(kuò)大橘紅種植規(guī)模，廣西等地也在逐漸推廣橘紅的種植和產(chǎn)品[21]，相比以前，種植化橘紅所帶來的經(jīng)濟(jì)效益有著明顯提高，市面上的橘紅產(chǎn)品質(zhì)量也變得參差不齊，同時(shí)許多農(nóng)戶在種植過程中會(huì)出現(xiàn)把橘紅種質(zhì)混淆的情況。對產(chǎn)區(qū)內(nèi)的橘紅種質(zhì)進(jìn)行種質(zhì)鑒定，既可以應(yīng)對市面需求，一定程度上解決品種混亂和品種優(yōu)劣的問題[22]，又能最大限度保證高質(zhì)量橘紅種質(zhì)的種植和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，為市場源源不斷地提供高質(zhì)量橘紅產(chǎn)品，也可給當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶帶來可觀的收益。

其次，雖然在大多數(shù)情況下，化橘紅的中藥活性成分是由其種質(zhì)特性決定的，但其對環(huán)境也有較大的依賴性[23]：一方面，化橘紅作為道地藥材，其道地產(chǎn)區(qū)的生態(tài)環(huán)境對化橘紅的獨(dú)特品質(zhì)形成和保持有著極強(qiáng)的相關(guān)性[24]，土壤作為植物生長的養(yǎng)分庫，其成分的含量和變化都會(huì)影響到橘紅的生理代謝過程及體內(nèi)各種藥用化合物的合成和變化[25]；另一方面，氣候也是影響橘紅生長的一個(gè)重要因素，氣候條件若發(fā)生較大的變化，會(huì)直接影響到橘紅的生長發(fā)育[26]，進(jìn)而影響其化學(xué)成分的含量。作為道地中藥材，橘紅的價(jià)值還是體現(xiàn)在其化學(xué)成分上，如何保證化橘紅果實(shí)的質(zhì)量和化學(xué)成分的含量始終貫穿著整個(gè)生產(chǎn)過程[27]，讓橘紅在整個(gè)生長周期中保持果實(shí)健康發(fā)育，提高化學(xué)成分含量才是橘紅產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展和保持競爭力的第一要?jiǎng)?wù)。作為橘紅的道地產(chǎn)區(qū)，對化州各個(gè)種植區(qū)的橘紅種質(zhì)進(jìn)行鑒定，以當(dāng)?shù)馗哔|(zhì)量的橘紅產(chǎn)品作為各項(xiàng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)，可為其他橘紅產(chǎn)區(qū)提供一個(gè)模板和參考，從而促進(jìn)其橘紅產(chǎn)品的質(zhì)量提升以及產(chǎn)業(yè)發(fā)展；此外，通過合適的鑒別方法，各橘紅產(chǎn)區(qū)也可對當(dāng)?shù)亻偌t產(chǎn)品進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢驗(yàn)和對比，如定期觀察物候期、測定各項(xiàng)植物學(xué)性狀指標(biāo)和化學(xué)成分的含量變化等，并根據(jù)所測定的結(jié)果為之后的產(chǎn)業(yè)化種植制定更詳細(xì)的計(jì)劃，這將有利于整個(gè)橘紅產(chǎn)業(yè)更長遠(yuǎn)、更健康地發(fā)展。