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    猴樟CbMYB308轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及生物信息學(xué)分析

    2023-05-30 16:29:54胡甜葉蘇梅郝璦瀅王藝潤韓浩章張穎王曉李張麗華
    安徽農(nóng)學(xué)通報 2023年3期
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析基因克隆

    胡甜 葉蘇梅 郝璦瀅 王藝潤 韓浩章 張穎 王曉李 張麗華

    摘要 為研究猴樟CbMYB308蛋白的序列結(jié)構(gòu)和功能,該文克隆猴樟CbMYB308基因CDS序列,進行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明,克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框,編碼313個氨基酸,與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因序列一致性達97.29%,系統(tǒng)進化樹的結(jié)果表明,猴樟CbMYB308蛋白具有較高的保守性;猴樟CbMYB308蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結(jié)構(gòu)域,為R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子,CbMYB308蛋白化學(xué)分子式為C1496H2356N432O489S11,相對分子量34.57 kDa,理論等電點6.12,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,無序化特征明顯,為脂溶性和親水性蛋白,磷酸化氨基酸位點有53個,亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核。

    關(guān)鍵詞 猴樟;轉(zhuǎn)錄因子;基因克隆;生物信息學(xué)分析

    中圖分類號 S792.23 文獻標(biāo)識碼 A

    文章編號 1007-7731(2023)03-0014-04

    猴樟(Cinnamomun bodinieri Levl.)為樟科樟屬常綠喬木,主要分布于我國南方地區(qū),是我國重要的精油加工樹種、綠化樹種和林用樹種。我國關(guān)于猴樟的研究主要集中于精油資源、林用特性、組培技術(shù)和引種栽培等方面,近年來的研究表明,猴樟的生長速度和抗寒性優(yōu)于香樟[1],可以替代香樟在我國北方地區(qū)推廣應(yīng)用。很早就進行了香樟新品種選育工作,相繼選育出涌金、霞光、御黃等彩葉品種[2-4],然而,關(guān)于猴樟彩葉新品種選育較少。研究表明,花青素種類、組成及其代謝調(diào)控是植物葉片呈色的關(guān)鍵因素,而花青素代謝主要受轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH、WD40及其復(fù)合物的調(diào)控[5],其中MYB類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控功能研究最受關(guān)注,本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出調(diào)控植物花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子,并分析其特性,以期為猴樟新品種選育提供基因資源。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗材料為猴樟變種(春季葉色為紅色)2年生種苗,于2019年3月上旬播種,2021年3月上旬進行移栽。于2021年8月20日,取猴樟枝條頂部幼嫩葉片進行液氮速凍后,用RNAperp Pure Plant Kit(天根,北京)試劑盒提取材料的總RNA,按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)方法去除基因組DNA后,用TR Prime Mix(random primer)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得的cDNA產(chǎn)物作為模板。

    1.2 基因克隆

    根據(jù)猴樟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),獲得在紅葉猴樟變種葉片中上調(diào)表達的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計CDS擴增引物[F(5′—3′):AGAATGGGAAGAGCGCC;R(5′—3′):TCAA TCTACAAGCTTCTTATGC],PCR反應(yīng)采用25 μL體系[6],反應(yīng)產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(TSINGKE,北京),挑單菌落進行PCR鑒定,將PCR陽性菌落培養(yǎng)后,提取質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測序。

    1.3 生物信息學(xué)分析

    通過ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)將猴樟CbMYB308基因翻譯成蛋白序列;利用NCBI的CCD工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測;利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)對氨基酸序列的理化性質(zhì)和等電點進行分析;采用Prot Scale(https://web.expasy.org/protscale/)進行蛋白質(zhì)的親/疏水性預(yù)測;采用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)在線軟件進行蛋白二級結(jié)構(gòu)分析;利用Fold Index軟件(https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex)分析氨基酸折疊無序化特性分析;采用SoftBerry ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/)和Cell-PLoc 2.0在線分析軟件(http:// www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)進行蛋白亞細(xì)胞定位;采用Swiss-Model(http://www.Swissmodel.expasy.org)預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu),并利用PyMOL軟件生成三級結(jié)構(gòu)模型;利用MEGA7.0生成與CbMYB308的CDS序列同源性較近的物種序列進化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 猴樟CbMYB308基因的克隆與重組載體構(gòu)建

    根據(jù)克隆后的凝膠電泳圖(圖1),以猴樟的cDNA為模板,通過PCR擴增得到1條約1 000 bp的條帶,片段大小與預(yù)期一致,通過測序得到長942 bp的CDS序列。PCR產(chǎn)物送公司測序,測序結(jié)果與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因進行比對,序列一致性高達97.29%,具備MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能。將克隆獲得的基因編碼蛋白通過NCBI BLAST Protein與數(shù)據(jù)庫進行比對,根據(jù)比對結(jié)果顯示,所克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框,推導(dǎo)編碼313個氨基酸,將獲得的目的基因命名為CbMYB308。

    2.2 猴樟CbMYB308蛋白的生物信息學(xué)分析

    2.2.1 猴樟CbMYB308蛋白的理化性質(zhì)分析。利用Protparam軟件對猴樟CbMYB308蛋白的理化性質(zhì)進行分析,猴樟CbMYB308蛋白相對分子量34.57 kDa,理論等電點6.12,表明CbMYB308基因編碼蛋白為弱酸性,化學(xué)分子式為C1496H2356N432O489S11,原子總數(shù)為4 784,不穩(wěn)定指數(shù)值為48.55,不穩(wěn)定系數(shù)大于40時為不穩(wěn)定蛋白,因而該蛋白質(zhì)是不穩(wěn)定的。脂溶指數(shù)為66.77,CbMYB308基因編碼蛋白為脂溶性蛋白,帶負(fù)電荷的殘基(asp+glu)總數(shù)為39,帶正電荷的殘基(arg+lys)總數(shù)為36。利用NCBI的CCD工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測,結(jié)果表明(圖2),CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結(jié)構(gòu)域,具備R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子。利用Prot Scale(https://web.expasy.org/protscale/)對猴樟CbMYB308基因編碼蛋白的親水性進行分析(圖3),總平均親水性值(GRAVY)為-0.568,預(yù)測該蛋白為親水性蛋白。蛋白質(zhì)親水性分析對于研究其跨膜特征和二級結(jié)構(gòu)有著重要的指導(dǎo)意義,通常認(rèn)為,氨基酸分值越低親水性越強,分值越高疏水性越強。猴樟CbMYB308基因編碼蛋白各氨基酸序列中第267位氨基酸分值最低為-2.556,親水性值最強;第303位氨基酸分值最高,為2.089,疏水性最強,就整體分析而言,親水性氨基酸均勻分布在整個多膚鏈中,沒有明顯的疏水性區(qū)域,因此,推測猴樟CbMYB308基因編碼蛋白為親水性蛋白。

    2.2.2 猴樟CbMYB308蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位于細(xì)胞核。根據(jù)蛋白二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果(圖4),該蛋白的組成為122個氨基酸(38.98%)為α-螺旋、39個氨基酸(12.46%)為延伸主鏈,23個氨基酸(7.35%)為β轉(zhuǎn)角及129個氨基酸(41.21%)為隨機卷曲,因而猴樟CbMYB308主要由α-螺旋和隨機卷曲組成;蛋白質(zhì)中二硫鍵橋的可能數(shù)量為76種不同組合。利用Fold Index對猴樟CbMYB308蛋白進行氨基酸序列折疊無序化分析(圖5),結(jié)果表明,該蛋白存在7個氨基酸無序化區(qū)域,共包含178個氨基酸,折疊無序化比例為56.87%,折疊無序化指數(shù)為0.056,無序化特征明顯。蛋白磷酸化位點進行預(yù)測結(jié)果(圖6),該多肽鏈0.500以上分值的氨基酸位點為53個,其中包含36個絲氨酸(S)、15個蘇氨酸(T)和2個酪氨酸(Y)磷酸化位點。根據(jù)蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果和同源建模分析(圖7),CbMYB308編碼蛋白三級結(jié)構(gòu)與PDB:1a5j.1.A的氨基酸序列一致性達46.23%,1a5j.1.A序列的編碼蛋白R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。

    2.2.3 猴樟CbMYB308蛋白序列同源比對及系統(tǒng)進化樹。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對猴樟CbMYB308蛋白序列進行blastp比對,根據(jù)結(jié)果下載比對得分較高的氨基酸序列,再通過MEGA7.0軟件構(gòu)建CbMYB308蛋白系統(tǒng)進化樹(圖8)。結(jié)果表明,猴樟CbMYB308蛋白在進化樹上與同為樟科樟屬的沉水樟聚為一類,說明其親緣關(guān)系最近,樟科樟屬植物中該類蛋白具有較高的保守性。猴樟CbMYB308蛋白進化樹中大概分3類,其中猴樟與沉水樟、博落回歸為一類,其次是麻雀花、流蘇馬兜鈴、藍星睡蓮和盧旺達睡蓮歸為一類,與猴樟親緣關(guān)系更遠(yuǎn)的深圳擬蓮、椰子、鐵皮石斛和鼓槌石斛歸為一類。

    3 結(jié)論與討論

    MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青素生物合成包括正調(diào)控和負(fù)調(diào)控2個方面,其中起正調(diào)控作用的主要是R2R3-MYB蛋白S6亞組,該亞組具有保守的“KPRPR[S/T]F”基序,光照、溫度、糖、激素等均能誘導(dǎo)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子表達,從而促進花青素合成[7]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對花青素生物合成調(diào)控具有組織特異性,是人們研究的重點,本研究結(jié)果表明,克隆得到的序列具有1個942 bp完整的ORF框,編碼313個氨基酸,與沉水樟中收錄的RWR91885.1基因序列一致性達97.29%,系統(tǒng)進化樹的結(jié)果表明,猴樟CbMYB308蛋白具有較高的保守性,與前期研究結(jié)果一致[7];猴樟CbMYB308蛋白生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,CbMYB308蛋白具有PLN03091家族結(jié)構(gòu)域,為R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子,亞細(xì)胞定位預(yù)測為細(xì)胞核,結(jié)合表型來看,只在葉片顯示紅色,而在莖、花、根中不顯示紅色,說明CbMYB308具有明顯的組織特異性,研究結(jié)果為進一步進行猴樟葉片花青素合成途徑及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究提供了基礎(chǔ)。

    4 參考文獻

    [1] 韓浩章,張麗華,王曉立,等. 猴樟與香樟幼苗的耐鹽堿性比較[J]. 西部林業(yè)科學(xué),2019,48(05):7-14.

    [2] 王建軍. 香樟新品種‘涌金[J]. 林業(yè)科學(xué),2010,46(08):181.

    [3] 王建軍. 香樟新品種‘霞光[J]. 林業(yè)科學(xué),2015,51(06):163.

    [4] 王豪,張波,陸云峰,等. 香樟新品種‘御黃[J]. 園藝學(xué)報,2019,46(S2):2924-2925.

    [5] 王欣,張?zhí)熘? 園藝作物花青素合成調(diào)控研究進展[J]. 生物技術(shù)進展,2022,12(01):10-16.

    [6] 韓浩章,張麗華,李素華,等. 猴樟CbP5CS1基因克隆及表達載體構(gòu)建[J/OL]. 分子植物育種:1-9.http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210720.1751.012.html.

    [7] Stracke R,Werber M,Weisshaar B. The R2R3-MYB gene family in Arabidopsis thaliana.[J]. Current Opinion in Plant Biology,2001,4(5):447-456.

    (責(zé)編:王 菁)

    基金項目 宿遷學(xué)院2020年優(yōu)秀論文培育團隊項目;江蘇省自然科學(xué)基金(BK20201481);宿遷市科技計劃(M202001);宿遷市科技計劃(L202004);宿遷學(xué)院創(chuàng)新團隊項目(2021td05)。

    作者簡介 胡甜(1998—),女,江蘇南通人。研究方向:樟屬植物研究與應(yīng)用。

    韓浩章*通信作者

    收稿日期 2022-03-23

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