桑椹中多糖和酚酸類化學(xué)成分的含量測(cè)定及相關(guān)性研究

王 芬，鄭玲玲，李 慧*，黃璐琦

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 院士工作站，江西 南昌330004；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究所，江西南昌330029；3.江西中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究院，江西 南昌330029；4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700）

桑椹為?？浦参锷orus albaL.的干燥果穗，有滋陰補(bǔ)血、生津潤(rùn)燥的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑椹具有增強(qiáng)免疫功能[2]、抗氧化[3]、抗炎鎮(zhèn)痛[4]、降血糖[5]、降血脂[6]、抗癌[7]、解酒護(hù)肝[8]以及抑菌[9]等藥理作用。桑椹中主要含有多糖類、酚酸類、黃酮類及花色苷成分，2020 年版《中國(guó)藥典》并未對(duì)桑椹的各類成分進(jìn)行整體分析或某一特定成分的含量進(jìn)行規(guī)定，使得桑椹飲片的質(zhì)量控制理論基礎(chǔ)相對(duì)薄弱。桑椹活性成分中，多糖和酚酸類研究較多，研究表明多糖具有抗氧化、降血糖等作用[10-11]，綠原酸等酚酸類成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抑菌、護(hù)肝等作用[12-13]。本研究以不同產(chǎn)地、不同批次桑椹藥材為研究目標(biāo)，采用硫酸-苯酚法對(duì)桑椹中多糖含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)采用超高效液相色譜法測(cè)定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸3 個(gè)酚酸類成分的含量，并將含量測(cè)定結(jié)果分別進(jìn)行初步對(duì)比研究，探索桑椹中多糖與3 種酚酸類化學(xué)成分之間是否具有相關(guān)性，以期為桑椹飲片的質(zhì)量控制以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 儀器與材料

Waters H-Class 型超高效液相色譜儀（PDA 檢測(cè)器，美國(guó)Waters 公司）；UV-1900i 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；XSR205DW/A 型電子分析天平（江西鼎技科學(xué)儀器有限公司）；MILLI-Q IQ-7005 型純水儀（江西鼎技科學(xué)儀器有限公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

乙腈（Merck）、磷酸（Macklin）為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。

綠原酸 （批號(hào)：YRL0098200419）、新綠原酸（批號(hào)：CR-069200117）、隱綠原酸（批號(hào)：YRY0026210420）純度均大于98%，均購(gòu)自寶雞市翊瑞生物科技有限公司。對(duì)照藥材（編號(hào)：S-1，批號(hào)：121158-201804）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，其余批次桑椹藥材的產(chǎn)地及批號(hào)見(jiàn)表1，樣品均由江西杏林白馬藥業(yè)股份有限公司提供，統(tǒng)一粉碎后過(guò)篩，備用。

表1 桑椹產(chǎn)地及批號(hào)Tab.1 Origin and batch number of mulberry

2 方法與結(jié)果

2.1 桑椹多糖含量測(cè)定

2.1.1 溶液的制備 對(duì)照品溶液：精密稱取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，加水制成0.1 mg/mL 葡萄糖對(duì)照品溶液。供試品溶液：取桑椹藥材0.5 g，加入25 mL純水，80℃水浴1 h，收集上清液，重復(fù)提取2 次，合并上清液，65℃旋蒸，定容10 mL，加入四倍體積的95%乙醇，4℃冷藏24 h 后，8 000 r/min 高速離心15 min，收集沉淀，加水溶解至100 mL 容量瓶，定容后搖勻，即得。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置具塞試管中，加水補(bǔ)至2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，精密加入硫酸5 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴中保溫15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X, μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為Y= 10.009X+ 0.057 8，r= 0.999 3,表明葡萄糖在10.93 ～ 54.65μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，于490 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定6 次吸光度，RSD 為0.15%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批桑椹飲片，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、20、40、60、80、100、120、150、180、210、240、300、330、360 min 于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD 為2.18%，表明桑椹樣品在360 min 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批桑椹飲片6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，RSD 為1.27%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知多糖含量的桑椹飲片0.25 g，共6 份，按照1 ∶1 的關(guān)系加入葡萄糖對(duì)照品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)（n = 6）Tab.2 Sample recovery experiment（n = 6）

2.1.7 樣品多糖含量測(cè)定 取桑椹飲片0.5 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算得多糖含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 多糖含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n = 3）Tab.3 Results of polysaccharide content determination（mg/g，n = 3）

2.2 桑椹中3 種酚酸類成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸水為流動(dòng)相B，梯度洗脫條件見(jiàn)表4；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1 μL。

表4 梯度洗脫條件Tab.4 Gradient elution conditions

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取一定量綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品，加入甲醇配制成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的質(zhì)量濃度分別為0.377 6 mg/mL、0.393 3mg/mL、0.365 2 mg/mL 的對(duì)照品母液，分別吸取上述對(duì)照品母液1 mL，加入甲醇稀釋成新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的質(zhì)量濃度分別為15.728 μg/mL、15.104 μg/mL、14.608 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，搖勻，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取桑椹粉末0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入80%甲醇溶劑25 mL，稱重，置于90℃水浴鍋中加熱回流1h，冷卻補(bǔ)足失重，過(guò)濾，濾液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性考察 吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和試劑空白溶液，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖見(jiàn)圖1。各化合物的峰均能達(dá)到良好分離。

圖1 混合對(duì)照品（a）及桑椹供試品（b）UPLC 色譜圖Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard（a）and mulberry test substance（b）

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品母液各1 mL 置于10 mL 容量瓶加甲醇稀釋并定容至刻度，制成混合對(duì)照品溶液，依次稀釋2 倍、4 倍、8 倍、16 倍、32 倍、64 倍，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）積分值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見(jiàn)表5。

表5 桑椹中3 種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍Tab.5 Standard curves and linear ranges of the 3 components in mulberry

2.2.6 精密度試驗(yàn) 吸取同一桑椹飲片供試品溶液1μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸峰面積積分值RSD 分別為0.98%、2.61%、1.46%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液1μL，分別在0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值RSD分別為1.72%、1.96%、1.60%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次桑椹樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣1μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算其RSD 值。新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的RSD 分別為1.52%、1.73%、1.77%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸含量的桑椹飲片粉末0.25 g，分別按照1 ∶1 的關(guān)系加入綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，平行制備6 份樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 桑椹中3 種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab.6 Recovery experiment of 3 components in mulberry by sample addition（n = 6）

2.2.10 桑椹中酚酸類成分含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地不同批次桑椹樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

2.3 桑椹多糖與酚酸類成分含量相關(guān)性研究

將桑椹中多糖和酚酸類成分含量測(cè)定結(jié)果構(gòu)建相關(guān)系數(shù)圖，以相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)，其絕對(duì)值越接近1，則成分之間相關(guān)性越強(qiáng)。以不同產(chǎn)地桑椹為研究對(duì)象時(shí)，桑椹多糖與新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸三種酚酸類成分含量不具有相關(guān)性，而不同產(chǎn)地桑椹飲片三種酚酸類含量測(cè)定結(jié)果表明，綠原酸與隱綠原酸含量之間具有明顯相關(guān)性，見(jiàn)圖2。以同一產(chǎn)地不同批次桑椹飲片為研究對(duì)象時(shí)，桑椹多糖與新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸三種酚酸類成分的相關(guān)系數(shù)分別為-0.42、-0.33、-0.32，同樣不具有相關(guān)性，但三種酚酸類成分之間，其相關(guān)系數(shù)均接近1，所以綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸三者含量具有明顯相關(guān)性，見(jiàn)圖3。

圖2 不同產(chǎn)地桑椹多糖和3 種酚酸類成分相關(guān)系數(shù)圖Fig.2 Correlation coefficients of mulberry polysaccharide and 3 phenolic acids from different origins

圖3 同一產(chǎn)地不同批次桑椹多糖和3 種酚酸類成分相關(guān)系數(shù)圖Fig.3 Correlation coefficients of mulberry polysaccharide and 3 phenolic acids in different batches from the same origin

3 討論

通過(guò)對(duì)桑椹多糖含量測(cè)定前處理考察，對(duì)不同前處理方式（經(jīng)乙醚脫脂后80%乙醇提??；不同濃度乙醇前處理；不同浸提次數(shù)以及浸提溫度等）進(jìn)行除雜效果對(duì)比，明確以水浸提后95%乙醇對(duì)多糖醇沉可以實(shí)現(xiàn)除雜，且多糖提取率較高。優(yōu)選了最大吸收波長(zhǎng)490 nm，并對(duì)桑椹飲片粉末不同粒徑（24、50、65 目）、取樣量（0.25、0.5、1.0 g）以及浸提時(shí)間（1.0、1.5、2.0 h）等進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，桑椹飲片打粉后過(guò)50 目藥典篩，測(cè)得多糖含量明顯高于過(guò)24 目篩的樣品；取0.5 g 桑椹測(cè)得多糖含量高于0.25 g，且與1.0 g 結(jié)果接近；提取1 h 和1.5 h 含量無(wú)明顯變化；提取2 次多糖含量明顯高于提取1 次的結(jié)果。故最終確定多糖含量測(cè)定提取方法為：取0.5 g 過(guò)50 目藥典篩的桑椹粉末，加水提取1 h，提取2 次。

通過(guò)PDA 檢測(cè)器提取不同波長(zhǎng)下色譜圖，經(jīng)對(duì)比研究后發(fā)現(xiàn)三個(gè)酚酸類成分的最大吸收波長(zhǎng)均在325 nm左右，同時(shí)分別考察了25、30、35℃三個(gè)柱溫下的分離效果，并考察了流速0.2、0.25、0.3 mL/min，最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm，柱溫：30 ℃，流速：0.2 mL/min 作為酚酸類成分含量測(cè)定的色譜條件。

通過(guò)考察不同提取方式［超聲提?。?00 W，40 kHz）、回流提取］，桑椹粉末不同粒徑（50、65、80 目），不同取樣量（0.2、0.5、1.0 g），不同提取時(shí)間（30、60 min）、不同提取溶劑（甲醇、80%甲醇、50%甲醇、無(wú)水乙醇、80%乙醇、50%乙醇），綜合目標(biāo)峰峰形以及三種目標(biāo)成分含量為優(yōu)化指標(biāo)，最終確定酚酸類成分含量測(cè)定供試品制備方法：取0.5 g 桑椹飲片粉末（65 目），以80%甲醇回流提取60 min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地之間桑椹飲片中桑椹多糖含量與酚酸類含量差異較大，但不存在相關(guān)性，而酚酸類成分中綠原酸與隱綠原酸含量之間具有明顯相關(guān)性；在同一產(chǎn)地不同批次桑椹飲片中，桑椹多糖含量與酚酸類化學(xué)成分之間也不存在明顯相關(guān)性，但3 種酚酸類成分之間存在明顯相關(guān)性。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同產(chǎn)地不同批次桑椹中，綠原酸與隱綠原酸含量具有明顯相關(guān)性，而同一產(chǎn)地不同批次桑椹中，綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸含量具有明顯相關(guān)性。由此可知，不能以多糖或酚酸類等某單一成分對(duì)桑椹飲片質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，或作為質(zhì)控成分建立標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該綜合考慮不同成分，多指標(biāo)多維度對(duì)桑椹飲片進(jìn)行定性或定量的綜合評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

桑椹藥材中多糖與酚酸類成分含量不具有明顯相關(guān)性，桑椹質(zhì)量控制提升應(yīng)綜合考慮桑椹活性成分含量及其藥理作用。通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地以及不同批次藥材進(jìn)行含量測(cè)定對(duì)比研究，能夠更加全面了解桑椹藥材中某一成分或多個(gè)成分的總體水平，對(duì)桑椹的多糖與其它化學(xué)成分含量相關(guān)性以及桑椹內(nèi)在質(zhì)量關(guān)系還需進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典: 一部[S].北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2020: 340.[2] 姚肖華.桑葚多糖對(duì)妊娠小鼠免疫功能的影響[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2013,35(5): 492-495.[3] 王馨悅, 陳華國(guó), 周 欣.6 種常見(jiàn)食材抗氧化及抑制乙酰膽堿酯酶活性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 47(15): 208-212.[4] 吳志琴.桑椹果實(shí)抗炎活性成分篩選及其作用機(jī)理研究[D].深圳:深圳大學(xué), 2015.[5] 王 強(qiáng), 王 睿, 王 存, 等.桑葚多糖調(diào)節(jié)血糖代謝及體外抗氧化效果研究[J].食品科學(xué), 2014, 35(11): 260-264.[6] 劉學(xué)銘, 黃小霞, 廖森泰, 等.3 種富含花青素植物提取物抗氧化和降血脂活性比較研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014, 14(1): 20-27.[7] 王 湛, 付鈺潔, 常 徽, 等.桑椹花色苷的提取及對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-453 生長(zhǎng)的抑制[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33(10): 988-990.[8] 王 靜, 丁海燕.酚酸類化合物抑菌作用研究進(jìn)展[J].中成藥, 2022,44(6): 1906-1911.[9] 段江蓮, 徐建國(guó).桑椹紅色素抑菌作用的研究[J].食品科學(xué), 2007, 28(10):87.[10] 王 杏, 鄧青芳, 陳華國(guó),等.桑椹多糖的結(jié)構(gòu)表征及其對(duì)乙醇脫氫酶活性的影響研究[J].中國(guó)中藥雜志, 2017, 42(12): 2329-2333.[11] 董 強(qiáng), 李 陽(yáng), 國(guó)錦琳.桑椹多糖研究進(jìn)展[J].中藥與臨床, 2021,12(4): 77-80.[12] 韋麗文.不同成熟度桑椹多酚綠原酸含量測(cè)定及抗氧化活性研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥, 2019, 21(7): 946-950.[13] 劉 瑩, 覃驪蘭, 藍(lán)毓?fàn)I.桑葚化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量標(biāo)志物研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué), 2021, 50(6): 1063-1067.