薄荷醇修飾槲皮素脂質(zhì)體的處方優(yōu)選及體外靶向性考察

劉婉瀅，蔡佳雨，劉 洋，司佳奇，李灃芮，孔 亮,2，李學濤*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學 中醫(yī)臟象理論及應用教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110847）

全球阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）患病人數(shù)逐年遞增，給各地衛(wèi)生系統(tǒng)帶來前所未有的壓力[1-2]。衰老導致的腦內(nèi)神經(jīng)元炎癥、氧化應激是導致AD 發(fā)病的重要因素，而血腦屏障是導致AD 治療進展相對有限的因素之一[3-4]。

近些年隨著傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展，多靶點、多通路的中藥及其單體成分越來越多的應用于疾病的治療中[5]。槲皮素（Quercetin，QU）具有很強的抗氧化與抗炎作用，可以保護神經(jīng)元免受氧化損傷與炎癥侵害，但因其水溶性較差，限制了其在體內(nèi)的應用[6]。薄荷醇（Menthol，Men）為薄荷的提取物，是一種強有力的血腦屏障滲透劑[7]。

脂質(zhì)體作為一種比較理想的藥物載體，具有較好的生物相容性，再加以特定的靶頭進行修飾，就可以靶向特定部位、提高藥物的使用效率[8]。因此，本研究制備了薄荷醇修飾槲皮素脂質(zhì)體（Men-Qu-Lip），靶向血腦屏障、增加藥物入腦量。通過Box-Behnken響應面法選取Men-Qu-Lip 優(yōu)化處方，并考察優(yōu)化處方中不同濃度脂質(zhì)體對細胞活力的影響，且使用bEnd.3 細胞考察Men 的靶向能力，為后續(xù)的研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

槲皮素（批號：21122007，純度：98.96%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）；DSPE-PEG2000-薄荷醇（批號：RF0222837，西安瑞禧生物科技有限公司）；膽固醇（Chol，批號：N1018A，大連美倫生物科技有限公司）；卵磷脂（批號：120025，日本NOF 公司）；DMEM（批號：20210619，北京索萊寶科技有限公司）；香豆素（美國Sigma-Aldrich 公司）；DAPI 染色液（北京碧云天科技有限公司）；水為純凈水,其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agress1100 型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；JY92-IIN 型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；FA1104 型電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；FACSCalibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；RE52CS 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B-220 型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；TiS 型熒光倒置顯微鏡（日本尼康公司）；WJ80B-Ⅱ 型CO2細胞培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）。

1.3 細胞

小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（bEnd.3）購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法，分別稱取DSPE-PEG2000-Men、卵磷脂、膽固醇和槲皮素于圓底燒瓶中，加入5 mL甲醇待其混合均勻后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。精密吸取5 mL 的PBS，超聲5 min 使藥物充分溶解，然后將混懸液移至10 mL EP 管中，探頭超聲10 min 后，即可得到Men-Qu-Lip。除不加槲皮素外，其余操作步驟同上，制備Men-Lip。除不加薄荷醇外，其余操作步驟同上，制備Qu-Lip。

2.2 槲皮素含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為UltimateXB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速為1 mL/min；流動相為甲醇-0.05%磷酸（65 ∶35）；檢測波長為360 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為20 μL。

2.2.2 溶液的制備 對照品溶液：取槲皮素 1 mg，用10 mL 的甲醇進行定容，得到濃度為0.1 mg/mL 的槲皮素母液。以甲醇為溶劑，將母液稀釋制得濃度為100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL 的系列槲皮素對照品溶液。

供試品溶液：精密吸取Men-Qu-Lip 1 mL，加甲醇9 mL 破乳，再稀釋5 倍，后經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

空白溶液：取Men-Lip 1 mL，加甲醇9 mL 破乳，再稀釋5 倍，后經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 標準曲線的建立 將“2.2.2”項下對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析。以Qu 濃度（X，μg/mL）為橫坐標，對應峰面積（Y）為縱坐標進行標準曲線的繪制，最后得到Qu 的回歸方程為Y= 69.662X+ 4.145 2（R2= 0.999 9）。結(jié)果表明槲皮素在0.5 ～ 100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系。

2.2.4 專屬性試驗 取適量的供試品溶液，對照品溶液（20 μg/mL），空白溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示槲皮素在6.3 ～6.4 min 左右出峰，空白溶液則在6.3 ～6.4 min處并無峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

圖1 槲皮素含量測定HPLC 圖Fig.1 HPLC diagram of quercetin content determination

2.2.5 重復性試驗 取Men-Qu-Lip，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，將得到的峰面積帶入回歸方程，結(jié)果槲皮素峰面積的RSD 為0.13%（n= 6），表明該方法重復性良好。

2.2.6 精密度試驗 取對照品溶液（20 μg/mL）適量，按“2.2.1”項下色譜條件進樣6 次，將得到的峰面積帶入回歸方程，結(jié)果槲皮素峰面積RSD 為0.13%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液，放置于室溫下，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結(jié)果槲皮素的RSD = 0.21%（n= 6），表明該脂質(zhì)體在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.8 加樣回收率試驗 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6份，與相應的對照品溶液按1∶1 （m/m）的比例混勻，再按“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，得到相應峰面積，帶入回歸方程計算其加樣回收率。測得槲皮素的平均加樣回收率為102.32%，RSD 為0.68%（n= 6），表明本方法準確度較好。

2.3 處方工藝優(yōu)選

根據(jù)文獻[9]可知對Men-Qu-Lip 影響較大的三個因素包括：膽固醇用量（A）、槲皮素用量（B）、水化溫度（C），因此用以上三種因素作為Men-Qu-Lip 的包封率考察因素，固定處方量5 mL，磷脂量為110 mg。以槲皮素包封率（Y）作為考察指標，采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)選出Men-Qu-Lip 的最優(yōu)處方工藝。各因素水平編碼見表1，Box-Behnken 試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 各因素水平編碼Tab.1 Factors and levels

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計方案與結(jié)果Tab.2 Design and results of Box-Behnken

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis result of variance

結(jié)合Design-ExpertV8.0.6.1 軟件，將表2 中所得到的包封率與影響因素進行二次多項式的擬合，得到擬合方程為Y= 91.29 + 4.95A+ 0.26B- 0.59C+0.42AB- 0.69AC+ 0.15BC- 7.87A2- 3.03B2- 2.6C2（r=0.952 9，P＜0.05）說明該擬合方程模型能夠較好的反映出Y值的變化，可以用于篩選Men-Qu-Lip 的最優(yōu)處方。對該擬合模型進行方差分析，發(fā)現(xiàn)因素A、A2、B2、C2對Y值有顯著影響（P＜0.05），因素B、C、AB、AC、BC對Y值沒有顯著影響（P＞0.05），見表3。接著使用Design-ExpertV8.0.6.1 軟件繪制三維響應面圖以及等高線圖，見圖2。

圖2 各因素對包封率影響的響應面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of the influence of each factor on encapsulation efficiency

圖2 中曲線越陡，證明因素之間的交互作用對包封率（Y）影響越大。A與B、A與C交互作用的響應面形狀較陡，而B與C的響應面形狀較為平緩。等高線圖中A與B、A與C交互作用要強于B與C的交互作用。結(jié)合以往經(jīng)驗，確定脂質(zhì)體的優(yōu)化處方為磷脂110 mg、膽固醇30 mg、槲皮素5 mg、水化溫度為40 ℃、處方量為5 mL。

2.4 驗證實驗

根據(jù)優(yōu)化處方，平行制備3 批Men-Qu-Lip，測定其包封率，結(jié)果見表4。最終測得槲皮素的平均包封率為（91.20±0.53）%，表明本實驗所選取的優(yōu)化處方穩(wěn)定、可行。

表4 驗證試驗（%，n = 3）Tab.4 Validation experiment（%，n = 3）

2.5 體外細胞存活率考察

2.5.1 bEnd.3 細胞的培養(yǎng) bEnd.3 細胞使用含10%胎牛血清，1%雙抗和1%內(nèi)皮生長因子的培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）。待細胞生長到95%以上，棄去培養(yǎng)液，用適量的PBS 清洗，再用胰蛋白酶進行消化，然后加培養(yǎng)液終止消化，離心，去上清液，加適量新培養(yǎng)液復懸，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

2.5.2 細胞活力檢驗 采用黃酰羅丹明B（SRB）染色法進行細胞活力考察。bEnd.3 細胞按1×105個每孔的密度接種于96 孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。設(shè)置不同給藥組，然后按優(yōu)化處方的最大量，設(shè)置一系列的濃度梯度，分別為0.012、0.021、0.043、0.085、0.170、0.330 mmol/L，每組設(shè)置5 個復孔。加藥后再孵育48 h，棄去培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸溶液固定，加入0.4% SRB 溶液染色30 min，再加入200 μL 的Tris 堿溶液，振蕩1 h，溶解SRB 溶液，用酶標儀在540 nm 波長下測定各孔的OD值，并計算細胞存活率。最后使用Graphpadprism-8.0.2 軟件進行折線圖繪制與單因素方差分析，使用熒光顯微鏡觀察0.330 mmol/L 濃度下不同組別脂質(zhì)體對bEnd.3 細胞形態(tài)的影響。

可以觀察到該濃度下各組別的bEnd.3 細胞形態(tài)與空白脂質(zhì)體組相比均無顯著變化，見圖3A。Men-Qu-Lip 組，Qu-Lip 組分別與Men-Lip 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明不同組別的脂質(zhì)體對bEnd.3 細胞的細胞活力無顯著影響，見圖3B。以上結(jié)果均說明，在0.012 ～ 0.330 mmol/L 濃度范圍內(nèi)的Men-Qu-Lip 安全性較高，細胞活力較好。

圖3 不同脂質(zhì)體組細胞形態(tài)圖及各濃度梯度下的細胞存活率Fig.3 Cell morphology of different liposome groups and cell survival rate under different concentration gradients

2.6 體外攝取能力的初步評價

2.6.1 細胞培養(yǎng) 選取bEnd.3 細胞作為脂質(zhì)體攝取能力考察的細胞，其培養(yǎng)方式與“2.5.1”項下方式相同。

2.6.2 熒光顯微鏡觀察脂質(zhì)體的攝取情況 以香豆素（Coumarin，Cou）代替槲皮素作為熒光探針，來考察細胞對脂質(zhì)體的攝取能力。采用48 孔板接種bEnd.3 細胞，接種密度為5×104個/孔。設(shè)置3 個給藥組。待細胞在48 孔板中培養(yǎng)24 h 后，分別給予Men-Lip、Cou-Lip 和Men-Cou-Lip。孵 育2 h 后，加入DAPI 染液染色，采用熒光顯微鏡查看各組細胞熒光強度，可觀察到Men-Cou-Lip 組的熒光要強于Cou-Lip 組的熒光，見圖4A 。使用Image J 軟件對圖4A進行攝取量統(tǒng)計分析，攝取量= IntDen-Area*Mean，再使用Graphpad-prism-8.0.2 軟件對Cou-Lip 組攝取量與Men-Cou-Lip 組攝取量進行方差分析，發(fā)現(xiàn)Men-Cou-Lip 攝取強度明顯強于Cou-Lip（P＜0.05），見圖4B。

圖4 不同脂質(zhì)體中香豆素熒光強度及攝取量統(tǒng)計結(jié)果（n = 3）Fig.4 Results of coumarin fluorescence intensity and uptake statistics in different liposomes （n = 3）

2.6.3 流式細胞儀測定脂質(zhì)體的攝取情況 采用6 孔板接種bEnd.3 細胞（5×106個/孔），同樣設(shè)置3 個給藥組，同“2.6.2”分組情況（n= 3）。待細胞在6 孔板中培養(yǎng)24 h 后，分別給予不同給藥組，后用胰酶進行消化，再加入1 mL 培養(yǎng)液終止消化，以1 000 r/min 離心后棄去上清液，加入300 μL 的PBS，氮氣吹勻，過膜進行流式分析。

各組脂質(zhì)體的FCS Express V3 流式攝取曲線，見圖5A，使用FlowJo 進行攝取量統(tǒng)計，再使用Graphpad-prism-8.0.2 軟件對Cou-Lip 組攝取量與Men-Cou-Lip 組攝取量進行方差分析，發(fā)現(xiàn)Men-Cou-Lip攝取強度明顯強于Cou-Lip（P＜0.05），見圖5B。以上結(jié)果均說明，經(jīng)Men 修飾的脂質(zhì)體能夠增加bEnd.3 細胞對藥物的攝取能力，使得脂質(zhì)體的靶向性增強。

圖5 不同脂質(zhì)體中流式攝取曲線及攝取量統(tǒng)計結(jié)果 （n = 3）Fig.5 Flow uptake curves and statistical results of uptake in different liposomes （n = 3）

3 討論

AD 被認為是一種發(fā)病機制較為復雜的神經(jīng)退行性疾病，年齡增長、遺傳因素、頭部受傷、血管疾病、感染和環(huán)境因素都可能成為AD 的致病因素[10]。Aβ斑塊是AD 典型的病理特征，其中ROS 的生成可以導致氧化應激使Aβ 聚集而導致神經(jīng)損傷，在衰老和患病的大腦中炎癥因子的增加同樣會導致Aβ 斑塊周圍的小膠質(zhì)細胞活化，從而導致神經(jīng)變性[11-12]。

槲皮素是一種擁有抗氧化與抗炎作用的中藥單體成分，可通過上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶，調(diào)節(jié)Nrf2等相關(guān)因子與通路，減少環(huán)加氧酶和脂氧合酶的表達來發(fā)揮抗氧化及抗炎作用[13]。將其制備成脂質(zhì)體可改善其水溶性差、易降解等缺點，提高溶解度和相關(guān)組織分布。普通脂質(zhì)體進入體循環(huán)后會因血液中蛋白、酶等作用下發(fā)生破裂而引起的藥物滲漏，本研究選用DSPE-PEG2000 作為長鏈與其它膜材一起溶于有機溶劑中用于長循環(huán)脂質(zhì)體的制備，可增加脂質(zhì)體的穩(wěn)定性、減少藥物滲漏、延長體內(nèi)循環(huán)時間[14]。

Box-Behnken 響應面法是一種非線性模型擬合的響應面設(shè)計法，可通過數(shù)據(jù)擬合將各因素之間的交互作用變?yōu)橹庇^的等高線與三維立體圖，減少測試次數(shù)[15]。因此本實驗選擇Box-Behnken 響應面法進行Men-Qu-Lip 的處方優(yōu)化，選取膽固醇用量、槲皮素、水化溫度這三個因素進行數(shù)據(jù)擬合，確定最優(yōu)處方為磷脂110 mg、膽固醇30 mg、槲皮素用量5 mg、水化溫度40 ℃、處方量5 mL。最終測得平均包封率為（91.20±0.53）%（n= 3），結(jié)果符合2020 年版《中國藥典》的相關(guān)要求[16]，證明本方法的科學性。

細胞活力檢測結(jié)果顯示，Men-Qu-Lip 組與Men-Lip組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此證明按優(yōu)化處方所制備的Men-Qu-Lip 在0.012 ～ 0.330 mmol/L范圍內(nèi)，對細胞的存活率沒有影響?？疾觳煌|(zhì)體被bEnd.3 的攝取情況，因槲皮素本身無熒光作用，因此課題組選用香豆素來作為熒光探針。結(jié)果表明，與Cou-Lip 組相比，Men-Cou-Lip 組攝取能力明顯增加（P＜0.05），可以增強藥物在大腦中的分布，提高靶向性。流式細胞儀攝取結(jié)果與熒光顯微鏡攝取結(jié)果趨勢一致。

4 結(jié)論

本研究成功制備并優(yōu)選出Men-Qu-Lip 處方，優(yōu)選的處方對bEnd.3 細胞無毒副作用。還明確了經(jīng)Men 修飾的脂質(zhì)體能夠順利跨過血腦屏障，為后續(xù)其在AD 的研究與應用提供了相應的基礎(chǔ)。但后期仍要進行更為深入的體內(nèi)和體外研究來對本實驗的結(jié)論進行驗證。