Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化天麻膠囊揮發(fā)油包合工藝

劉松鑫，周 娜，莊 園，吳成紅，于祥玉，左瑞娟，武光云，盧傳廣，戰(zhàn)瑞雪，關(guān)永霞*，沈慶國(guó)

（1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2.魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；3.臨沂大學(xué) 檔案館，山東 臨沂 276005；4.臨沂市養(yǎng)老事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東 臨沂 276032）

天麻膠囊由天麻、獨(dú)活、羌活、鹽杜仲、牛膝、粉萆薢、附子、當(dāng)歸、地黃、玄參共10 味藥組成，具有活血止痛、祛風(fēng)除濕的功效[1]。天麻膠囊處方中當(dāng)歸、羌活、獨(dú)活等多味藥材含有揮發(fā)油成分[2-4]，具有抗癌、抗氧化、抗炎等藥理作用[5-6]。目前，中成藥在制劑過程中普遍將揮發(fā)油噴入到半成品顆粒中，在這種情況下?lián)]發(fā)油極易氧化和散失，且難以保證揮發(fā)油在成品中的均一性[7]。研究表明，揮發(fā)油經(jīng)環(huán)糊精包合后能使液體藥物粉末化，便于制劑，并掩蓋不良?xì)馕叮档痛碳ば?，同時(shí)降低揮發(fā)油的氧化，提高其穩(wěn)定性[8-10]?，F(xiàn)在一些中成藥也采用揮發(fā)油β-環(huán)狀糊精包合法提高制劑的穩(wěn)定性[11-12]。因此，本研究擬通過對(duì)比飽和水溶液法、膠體磨包合法和超聲法包合天麻膠囊揮發(fā)油的效果，采用 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化膠體磨包合工藝，為天麻膠囊工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料

1.1 藥物與試劑

獨(dú)活、羌活、當(dāng)歸藥材購(gòu)自宕昌縣康蘭森中藥材有限公司，由魯南制藥集團(tuán)中藥制藥共性技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室范建偉高級(jí)工程師鑒定均符合2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定；β-環(huán)糊精（批號(hào)：20211206，孟川市華興生物化工有限公司）。

1.2 主要儀器

SHIMADZU GC-2030 型氣相色譜儀（日本島津公司）；JM50AL 型膠體磨（上海力超電機(jī)有限公司）。

2 方法

2.1 揮發(fā)油的制備

分別稱取獨(dú)活、羌活、當(dāng)歸藥材各7 kg、7 kg、14 kg，按2020 年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2204揮發(fā)油測(cè)定法”中甲法提取揮發(fā)油[13]，提取得揮發(fā)油380 mL，加等量無水乙醇，備用。天麻膠囊揮發(fā)油的密度測(cè)定按照2020 年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0601 相對(duì)密度測(cè)定法”，以比重瓶法測(cè)得天麻膠囊揮發(fā)油相對(duì)密度為0.875 6。

2.2 空白回收率的測(cè)定

按“2.1”項(xiàng)下方法量取揮發(fā)油乙醇溶液2 mL（相當(dāng)于天麻膠囊揮發(fā)油純油1 mL），加水500 mL 和適量沸石，保持微沸5 h，測(cè)定空白回收率?？瞻谆厥章?（揮發(fā)油收集量/揮發(fā)油投入量）×100%，平行測(cè)定3 次后得其數(shù)值為（70.00±1.78）%。

2.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

在評(píng)價(jià)揮發(fā)油包合效果過程中，包封率和收率是其主要指標(biāo)，綜合多種因素，將包封率權(quán)重系數(shù)定為70%，收率權(quán)重系數(shù)定為30%[14]。本實(shí)驗(yàn)以天麻膠囊揮發(fā)油包合物收率和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算綜合分?jǐn)?shù)。包封率Y1=包合物中揮發(fā)油量/ （投油量×空白回收率）×100%收率Y2=包合物質(zhì)量/（β-環(huán)糊精質(zhì)量+揮發(fā)油質(zhì)量）×100%

綜合分?jǐn)?shù)Y=Y1/Y1max×70% +Y2/Y2max×30%

2.4 天麻膠囊揮發(fā)油包合方式的選擇

2.4.1 飽和水溶液法 稱取β-環(huán)糊精 24 g，加水500 mL（50℃），攪拌10 min，緩慢加入揮發(fā)油乙醇溶液6 mL（相當(dāng)于天麻膠囊揮發(fā)油純油3 mL，以下同），滴加完畢，恒溫?cái)嚢璋?0 min，靜置24 h，抽濾，45℃烘干，備用。

2.4.2 膠體磨包合法 稱取β-環(huán)糊精 24 g，加水500 mL（50℃），不斷攪拌，迅速加入膠體磨中，滴加揮發(fā)油乙醇溶液6 mL，研磨30 min，收集包合物，靜置24 h，抽濾，45℃烘干，備用。

2.4.3 超聲包合法 稱取β-環(huán)糊精 24 g，加水500 mL（50℃），不斷攪拌使其溶解，緩慢加入揮發(fā)油乙醇溶液6 mL，超聲30 min，收集包合物，靜置24 h，抽濾，45℃烘干，備用。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例 將水與β-環(huán)糊精的比例固定為20 ∶1，包合時(shí)間固定為30 min，分別研究β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例為4 ∶1、6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1 時(shí)綜合分?jǐn)?shù)的變化。

2.5.2 水與β-環(huán)糊精比例 將β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例固定為8 ∶1，包合時(shí)間固定為30 min，分別研究水與β-環(huán)糊精比例為9 ∶1、11 ∶1、14 ∶1、17 ∶1、20 ∶1 時(shí)綜合分?jǐn)?shù)的變化。

2.5.3 包合時(shí)間 將β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例固定為8 ∶1，水與β-環(huán)糊精比例固定為20 ∶1，分別研究包合時(shí)間為10、20、30、40、50 min 時(shí)綜合分?jǐn)?shù)的變化。

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用DesignExpert.V8.0.6.1 軟件以A（β-環(huán)糊精∶揮發(fā)油）、B（水∶β-環(huán)糊精）、C（包合時(shí)間）為影響因素，Y（綜合分?jǐn)?shù)）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化包合工藝。為了直觀體現(xiàn)三因素對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)Y（綜合分?jǐn)?shù)）的影響，選擇固定任意一個(gè)因素，分別考察因素A和因素B，因素A和因素C，因素B和因素C對(duì)Y的影響。

2.7 包合效果評(píng)價(jià)

包合物加適量無水乙醇，超聲處理30 min，取上層揮發(fā)油備用。以未包合的原揮發(fā)油為對(duì)照，取揮發(fā)油10 mg，精密稱定，加適量正己烷溶解，搖勻，即得。

色譜條件：HP-5MS 氣相色譜柱（30 m，0.25 mm×0.25μm）；載氣為氦氣；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為1μL；初溫為70℃，3 min 后以5℃/min 升至85℃，7.5 min 后以2℃/min 升至100℃，2.6 min 后以50℃/min升至230℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為230℃。

3 結(jié)果

3.1 天麻膠囊揮發(fā)油包合方式的選擇

以“2.2”項(xiàng)下綜合分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較三種方法的包合效果，結(jié)果表明飽和水溶液法、膠體磨包合法、超聲包合法的綜合評(píng)分分別為53.12%、69.54%、60.18%，膠體磨包合法的綜合分?jǐn)?shù)高于飽和水溶液法和超聲包合法，故采用膠體磨包合法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例 在4 ∶1 ～ 12 ∶1的β-環(huán)糊精與揮發(fā)油梯度比例范圍內(nèi)，隨著比例增加，綜合分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在8 ∶1 時(shí)綜合分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，造成上述現(xiàn)象可能的原因是，隨著β-環(huán)糊精的過量加入，未包合的β-環(huán)糊精流失，降低了收率，進(jìn)而影響綜合分?jǐn)?shù)。故選擇β-環(huán)糊精與揮發(fā)油的比例為6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1 三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，見圖1A。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of single-factor test

3.2.2 水與β-環(huán)糊精比例 在9 ∶1 ～ 20 ∶1的水與β-環(huán)糊精梯度比例范圍內(nèi)，當(dāng)水∶β-環(huán)糊精 = 14 ∶1 時(shí)綜合分?jǐn)?shù)有最大值，造成上述現(xiàn)象可能的原因是，隨著水的過量加入，溶解的β-環(huán)糊精逐漸增多，在過濾過程中流失，進(jìn)而降低了綜合分?jǐn)?shù)。故選擇水與β-環(huán)糊精比例為11 ∶1、14 ∶1、17 ∶1 三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，見圖1B。

3.2.3 包合時(shí)間 在10 ～ 50 min 的包合時(shí)間范圍內(nèi)，隨著包合時(shí)間延長(zhǎng)，綜合評(píng)分呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在25 min 時(shí)綜合分?jǐn)?shù)達(dá)到最大值，造成上述現(xiàn)象可能的原因是，隨著包合時(shí)間的延長(zhǎng)，部分包合液濺出，影響收率和包封率，降低綜合分?jǐn)?shù)。故選擇包合時(shí)間為20、30、40 min 三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，見圖1C。

3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用DesignExpert.V8.0.6.1 軟件，Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化包合工藝，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。對(duì)表1 中Y（綜合分?jǐn)?shù)）進(jìn)行二次多元回歸擬合，方差分析見表2。由表2 可知，建立的多元模型F=59.36，模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平，表明擬合的模型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬項(xiàng)P= 0.385 ＞0.05，表明其它因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小，殘差由隨機(jī)誤差引起。由F值可知，各因素對(duì)綜合分?jǐn)?shù)影響大小順序?yàn)椋篊＞A＞B。對(duì)表1 數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得方程綜合分?jǐn)?shù)Y= 94.02 + 3.31A- 2.56B- 5.35C+ 1.63AB-0.47AC+ 7.91BC- 4.31A2- 7.31B2- 6.25C2，其中，A、B、C、BC、A2、B2、C2達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），模型擬合度較好。各因素對(duì)綜合評(píng)分影響的響應(yīng)曲面和等高線圖見圖2。

圖2 各因素對(duì)包封率影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plot of the influence of each factor on encapsulation efficiency

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.1 Response surface experimental design and results

表2 方差分析表Tab.2 Analysis of variance

經(jīng)計(jì)算可得，當(dāng)A為9.01 ∶1、B為12.84 ∶1、C為25.11 min 時(shí)，綜合評(píng)分為96.91 分，考慮到生產(chǎn)成本和實(shí)際操作，將其修正為A為 9 ∶1、B為13 ∶1、C為25 min。在上述工藝下進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得平均包封率為（79.07±3.62）%，收率為（75.48±5.27）%，綜合評(píng)分為94.43±2.15，表明優(yōu)化后的工藝重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

3.4 包合效果評(píng)價(jià)

按“2.4.2”項(xiàng)下方法，選擇最優(yōu)包合工藝（β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例為9 ∶1、水與β-環(huán)糊精比例為13 ∶1，包合時(shí)間為25 min）進(jìn)行包合。采用氣相色譜法檢測(cè)，結(jié)果見圖3，包合前后圖譜相似度為0.99，各成分基本無變化。

圖3 揮發(fā)油（a）與包合物（b）GC 色譜圖Fig.3 GC chromatograms of volatile oil (a) and inclusion (b)

4 討論

天麻膠囊在《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)——中藥成方制劑》（第三冊(cè)）中記載是治療肢體拘攣、手足麻木的常用中成藥，天麻膠囊制法中羌活、獨(dú)活、當(dāng)歸提取揮發(fā)油，其余味藥經(jīng)煎煮、濃縮、制粒后噴入羌活、獨(dú)活、當(dāng)歸揮發(fā)油，裝入膠囊。由于揮發(fā)油具有易揮發(fā)、水溶性差等特點(diǎn)，上述制法所得的天麻膠囊無法保證其質(zhì)量的穩(wěn)定性，同時(shí)揮發(fā)油對(duì)胃腸道黏膜有一定的刺激性[15]，因此，需優(yōu)化天麻膠囊的制法，提高制劑穩(wěn)定性。β-環(huán)糊精包合法能將液體藥物粉末化，是常用的保持揮發(fā)油質(zhì)量穩(wěn)定性的方法之一。本研究采用 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化得到天麻膠囊揮發(fā)油膠體磨包合工藝最佳工藝，該方法可為后續(xù)天麻膠囊制劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)膠體磨法較飽和水溶液法和超聲法包合揮發(fā)油效果好，且膠體磨法包合率高、簡(jiǎn)便、快速。目前，高剪切分散乳化法因其能提供強(qiáng)大的剪切力，常被用來乳化、分散等操作，已被證明是包合揮發(fā)油的重要方法之一[16]。在包合物的制備過程中，經(jīng)過靜置、抽濾、干燥等工序，包合物有一定損失，同時(shí)存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高等問題，不便于大規(guī)模生產(chǎn)。噴霧干燥技術(shù)是解決上述問題的措施之一，噴霧干燥通過將包合液霧化成小液滴，再利用熱空氣進(jìn)行干燥，能夠在較短時(shí)間內(nèi)迅速將包合液轉(zhuǎn)化為固體粉末。在今后的研究中，也應(yīng)重點(diǎn)考察噴霧干燥技術(shù)在制備藥物揮發(fā)油包合物中的應(yīng)用，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

綜合考慮生產(chǎn)成本和方便實(shí)際操作，得到天麻膠囊揮發(fā)油最佳膠體磨包合工藝條件為β-環(huán)糊精∶揮發(fā)油= 9 ∶1、水∶β-環(huán)糊精= 13 ∶1，包合時(shí)間為25 min。經(jīng)驗(yàn)證天麻膠囊揮發(fā)油在包合前后成分基本無變化，工藝效果較好，穩(wěn)定可行。在今后的研究中，應(yīng)對(duì)比高剪切分散乳化法與膠體磨法包合的差異，為后續(xù)相關(guān)制劑的開發(fā)提供參考。