重組人腦利鈉肽等電點分析全柱成像毛細管等電聚焦電泳法的建立及驗證

張競，周志艷，李丹丹，安麗康，王巖勃，鄒衛(wèi)

1.河北冀兆聯(lián)科技發(fā)展有限責任公司，河北 石家莊 050051；2.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，河北 石家莊 050200；3.石家莊沃泰生物科技有限公司，河北 石家莊 050018；4.河北科技大學，河北 石家莊 050018

重組人腦利鈉肽是一種通過重組DNA 技術(shù)合成的、相對分子質(zhì)量為3 464 的多肽，與心室肌產(chǎn)生的內(nèi)源性多肽有相同的序列和空間結(jié)構(gòu)，因此有相同的生物活性［1］。研究表明，補充幾倍甚至十幾倍的外源性腦利鈉肽時，能迅速有效治療心力衰竭，改善預后［2-3］。目前，國內(nèi)外由腦利鈉肽開發(fā)的新型藥物均已上市。但在該藥物質(zhì)量研究過程中，等電點（isoelectric point，pI）的檢測一直是技術(shù)瓶頸。重組人腦利鈉肽pI 為10.9，超出了常規(guī)測定方法的pI 范圍，不論采用凝膠電泳還是毛細管電泳，檢測結(jié)果均不理想［4-6］。

1992年發(fā)展起來的新一代全柱成像毛細管等電聚焦電泳（capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection，CIEF-WCID）是一種將毛細管等電聚焦電泳（CIEF）和全柱成像檢測結(jié)合起來的技術(shù)［7-16］。其中CIEF 將毛細管內(nèi)壁涂覆聚合物減小電滲流，再將供試品和兩性電解質(zhì)混合進樣，兩個電極槽中分別加入酸液和堿液，施加電壓后毛細管中的操作電解質(zhì)溶液逐漸形成pH 梯度，各溶質(zhì)在毛細管中遷移至各自的pI 時變?yōu)橹行孕纬删劢沟膮^(qū)帶［17］，當樣品進行等電聚焦檢測時，互補性金屬氧化物半導體（compIementary metal-oxide-semicondu-ctor translator，CMOS）作為成像檢測技術(shù)，可對整個聚焦分離通道、聚焦過程進行實時監(jiān)控和記錄，該過程中不移動毛細管柱，也無須移動樣品［18］。因此可大幅度縮短檢測時間，提高檢測靈敏度。

本研究采用CIEF-WCID 法對兩性電解質(zhì)、占位劑、蛋白濃度、聚焦條件等進行優(yōu)化［19-23］，獲得檢測重組人腦利鈉肽pI 的最佳條件，并對建立的方法進行驗證［24-25］及初步應用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重組人腦利鈉肽理化對照品（批號：20130601）及3批樣品（批號：20161001、2016-1002、20161101）購自石家莊沃泰生物科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）購自天津市致遠化學試劑有限公司；精氨酸（分析純）購自美國Sigma 公司；毛細管分離柱、全柱成像毛細管等電聚焦電泳儀CE Infinite、兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5 和9-11、陽極電解液、陰極電解液、pI標記物、1%甲基纖維素溶液購自加拿大AES公司。

1.2 方法建立

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 兩性電解質(zhì)選擇 加入35 μL理化對照品和60 μL 1%甲基纖維素，各0.8 μL pI 標記物10.10 和10.45，8 μL兩性電解質(zhì)（HR AESlyte 8-10.5或9-11），超純水補齊至200 μL，10 140×g離心5 min。

1.2.1.2 占位劑選擇 加入35 μL理化對照品和60 μL 1%甲基纖維素，各0.8 μL pI標記物10.10和10.45，8 μL 兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5，不同濃度占位劑（15、20、25 mmol／L氫氧化鈉或5、10、20 mmol／L精氨酸），超純水補齊至200 μL，10 140×g離心5 min。

1.2.1.3 蛋白濃度的選擇 加入不同體積（2.4、4.5、9.0、17.5 μL）理化對照品（使重組人腦利鈉肽終濃度分別為12、22.5、45 和87.5 μg／mL）和60 μL 1%甲基纖維素，各0.8 μL pI標記物10.10和10.45，8 μL兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5，占位劑25 mmol／L氫氧化鈉，超純水補齊至200 μL，10 140×g離心5 min。

1.2.2 CIEF-WCID 條件 在樣品制備條件優(yōu)化完成的基礎上，繼續(xù)進行聚焦條件的摸索。采用自動進樣方式，每次進樣前用50 μL 0.2%甲基纖維素沖洗毛細管；聚焦電壓和時間：第1次聚焦1 000 V 1 min、第2 次聚焦2 000 V 1 min、第3 次聚焦3 000 V 分別6、8、10 min；圖像采集間隔設置為20 s；樣品池溫度設置為8 ℃。

1.3 方法驗證

1.3.1 重復性 按照1.2項優(yōu)化后的方法制備1份樣品進行檢測，連續(xù)進樣6次，計算相對標準偏差（RSD）。

1.3.2 樣品間精密度 按照1.2項優(yōu)化后的方法制備6份樣品，分別進行檢測，計算RSD。

1.3.3 耐用性 按照1.2 項優(yōu)化后的方法制備樣品，調(diào)整蛋白濃度分別為50、87.5 和125 μg／mL，分別進行檢測，每個樣品重復進樣3次，計算RSD。

選擇3 組pI 標記物（9.46／9.77、9.77／10.10和10.10／10.45），按照1.2項優(yōu)化后方法制備樣品，進行檢測，每個樣品重復進樣3 次，計算RSD；按照1.2 項優(yōu)化后的方法制備樣品，分別于0、1、3、5 h 進行檢測，計算RSD。

1.4 方法的初步應用 取連續(xù)生產(chǎn)的3 批重組人腦利鈉肽，按照1.2 項優(yōu)化后的方法進行樣品制備及檢測，考察結(jié)果一致性。

1.5 數(shù)據(jù)分析 用CEInsight 軟件采集數(shù)據(jù)，Clarity軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 方法的建立

2.1.1 兩性電解質(zhì)選擇 用HR AESlyte 8-10.5 可正常檢測出1 個pI 標記物，其余樣品未檢出；用HR AESlyte 9-11 獲得的的圖譜基線波動大，無法正常檢測出重組人腦利鈉肽的pI。見圖1。推測HR AESlyte 8-10.5與待測樣品pI不同，使樣品易跑出毛細管柱，因此選擇HR AESlyte 8-10.5 作為兩性電解質(zhì)，后續(xù)加入占位劑繼續(xù)試驗。

圖1 不同兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5（A）和HR AESlyte 9-11（B）的CIEF-WCID圖譜Fig.1 CIEF-WCID profile of different amphoteric electrolytes HR AESlyte 8-10.5（A）and HR AESlyte 9-11（B）

2.1.2 占位劑選擇 加入精氨酸后，待測樣品峰被遮擋，依然僅有2 個pI 標記物的峰，不能檢出待測樣品峰；加入氫氧化鈉后，重組人腦利鈉肽峰可聚焦檢測到，并且隨著氫氧化鈉濃度的升高，其離右側(cè)邊界越遠。見圖2。為了檢測的穩(wěn)定性，選擇25 mmol／L氫氧化鈉作為占位劑。

圖2 不同占位劑樣品的CIEF-WCID圖譜Fig.2 CIEF-WCID profile of different space-occupying agent samples

2.1.3 蛋白濃度選擇 確定占位劑和兩性電解質(zhì)后，選擇的4種蛋白終濃度（87.5、45、22.5和12 μg／mL）建立的檢測方法均具有較好的靈敏度和重復性，但隨著蛋白濃度的降低，電泳圖會向右發(fā)生偏移，見圖3。因此選擇最大適宜濃度87.5 μg／mL 作為樣品終濃度。

圖3 不同蛋白濃度樣品的CIEF-WCID圖譜Fig.3 CIEF-WCID profile of samples with different protein concentrations

2.1.4 聚焦條件 3 種聚焦時間各峰峰形均無變化，在第3 次聚焦6 min 時已完成檢測，見圖4。確定聚焦條件為：1 000 V 1 min→2 000 V 1 min→3 000 V 6 min。

圖4 不同聚焦時間下樣品的CIEF-WCID圖譜Fig.4 CIEF-WCID profile of samples under different focu sing times

最終確定檢測重組人腦利鈉肽CIEF-WCID法的條件為：兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5、占位劑25 mmol／L氫氧化鈉、樣品濃度87.5 μg／mL、聚焦電壓及時間：1 000 V 1 min →2 000 V 1 min →3 000 V 6 min。

2.2 方法驗證

2.2.1 重復性 同一樣品6 次檢測pI 分別為10.86、10.87、10.87、10.86、10.87和10.85，平均值為10.86，RSD為0.1%；等電聚焦電泳圖峰形均無明顯變化，見圖5。表明方法重復性良好，可滿足試驗要求。

圖5 重復性驗證的CIEF-WCID圖譜Fig.5 CIEF-WCID profile for verification of repeatability

2.2.2 樣品間精密度 6份樣品pI分別為10.85、10.86、10.85、10.86、10.86、10.86，平均值為10.86，RSD為0.1%。等電聚焦電泳圖峰形均無明顯變化，見圖6。表明方法精密度良好，可用于重組人腦利鈉肽的檢測。

圖6 精密度驗證的CIEF-WCID圖譜Fig.6 CIEF-WCID profile for verification of precision

2.2.3 耐用性

2.2.3.1 對蛋白濃度的耐用性3種濃度下檢測pI的RSD為0.1%，見表1；等電聚焦電泳圖峰形均無明顯變化，見圖7，耐用性良好。

圖7 樣品濃度耐用性驗證的CIEF-WCID圖譜Fig.7 CIEF-WCID profile for verification of durability of sample concentration

表1 樣品濃度耐用性的驗證結(jié)果（pI）Tab.1 Verification for durability of sample concentration（pI）

2.2.3.2 對pI標記物的耐用性 9.46／9.77和9.77／10.10 的pI 標記物組合均不能檢測出重組人腦利鈉肽的pI，僅能應用10.10／10.45 的pI 標記物進行檢測，見圖8。

圖8 pI標記物耐用性驗證的CIEF-WCID圖譜Fig.8 CIEF-WCID profile for verification of durability of pI marker

2.2.3.3 對樣品進樣時間的耐用性 0、1、3、5 h 4個時間點pI分別為10.87、10.87、10.87、10.86，平均值為10.87，RSD為0.1%；等電聚焦電泳圖峰形均無明顯變化，圖9。耐用性良好。

圖9 進樣時間的耐用性驗證CIEF-WCID圖譜Fig.9 CIEF-WCID profile for verification of durability of injection time

綜上所述，建立的方法對蛋白濃度、樣品進樣時間耐用性良好，但pI標記物不可隨意更換。

2.3 方法的初步應用 3 批樣品等電聚焦電泳圖譜一致，與理論pI結(jié)果一致，可用于重組人腦利鈉肽pI的檢測，見圖10。

圖10 重組人腦利鈉肽樣品pI檢測的CIEF-WCID圖譜Fig.10 CIEF-WCID profile of pI detection of recombinant human brain natriuretic peptide samples

3 討論

本研究通過對兩性電解質(zhì)、占位劑、蛋白濃度以及聚焦時間等條件的摸索，獲得了CIEF-WCID 法的主要參數(shù)及檢測條件后，用于重組人腦利鈉肽pI 的分析。

在CIEF技術(shù)中，兩性電解質(zhì)通常用于產(chǎn)生pH梯度。當在混有兩性電解質(zhì)的樣品上施加電壓時，pI最低的兩性電解質(zhì)（負電荷最多）向陽極移動，pI 最高的兩性電解質(zhì)（正電荷最多）向陰極移動。其他兩性電解質(zhì)會根據(jù)它們的pI值將溶液緩沖至相應的pH，而這個結(jié)果會是一個連續(xù)的pH范圍。為了實現(xiàn)對蛋白的成功分離，根據(jù)pH 范圍和強度選擇的兩性電解質(zhì)是重要參數(shù)之一。由于重組人腦利鈉肽pI為10.9，呈極堿性，現(xiàn)有pI標記物不能將其包含進去，因此選則離該pI 最近的1 組pI 標記物10.10、10.46。為達到樣品與pI 標記物最好的分離效果，選擇不同范圍的兩性電解質(zhì)HR AESlyte 8-10.5 和9-11 進行優(yōu)化，最終確定將HR AESlyte 8-10.5作為兩性電解質(zhì)。

由于整根毛細管充滿了兩性電解質(zhì)和樣品溶液，因此聚焦在毛細管出口端的極堿性蛋白質(zhì)在遷移過程中無法被檢測到。需要在樣品加入占位劑，用于占據(jù)毛細管出口端的位置，避免發(fā)生極堿性蛋白聚集在檢測窗口之后的現(xiàn)象。本研究選擇精氨酸和氫氧化鈉作為占位劑，其中精氨酸選擇5、10、20 mmol／L 3 個濃度，NaOH 選擇15、20、25 mmol／L 3 個濃度，進行篩選。最終確定加入25 mmol／L 氫氧化鈉作為占位劑。

在相同的樣品體系和聚焦條件下，蛋白質(zhì)溶解度也不相同。當?shù)鞍诐舛冗^高時，溶解度低的蛋白會沉淀，從而導致電泳圖峰型變差，重現(xiàn)性降低；溶解度高的蛋白也會因樣品過載而導致分辨率下降。但另一方面，蛋白濃度也不能過低，才可達到足夠的檢測靈敏度。經(jīng)試驗，確定87.5 μg／mL 作為樣品終濃度。在樣品配制條件優(yōu)化完成的基礎上，繼續(xù)進行了聚焦條件的摸索，最終確定擇1000 V 1 min →2 000 V 1 min →3 000 V 6 min為聚焦條件。

為確認建立的方法適用于相應檢測要求，本研究進行了方法驗證。重復性可測定同一份均勻供試品經(jīng)多次測定所得結(jié)果間的接近程度［17］。耐用性是指在測定條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，為建立的方法用于常規(guī)檢驗提供依據(jù)［17］。開始研究分析方法時，應考慮其耐用性，本實驗選取了蛋白濃度、pI標記物和樣品進樣時間3個影響因素進行耐用性考察，結(jié)果顯示，該方法重復性好、精密度高。

由于重組人腦利鈉肽的pI 過高，導致其分析方法存在不穩(wěn)定性。而本研究建立的CIEF-WCID法經(jīng)驗證后，可準確、穩(wěn)定地進行pI檢測。為進一步確認該方法的可靠性，選擇連續(xù)生產(chǎn)的3 批重組人腦利鈉肽進行檢測，均可穩(wěn)定檢測pI，表明建立的方法可用于重組人腦利鈉肽pI 檢測，為后續(xù)重組人腦利鈉肽質(zhì)量標準的建立提供了參考。

綜上所述，本研究建立的CIEF-WCID法可穩(wěn)定、準確地檢測出腦利鈉肽這一極堿性多肽的pI，也證明了該方法可測定極端pI 多肽，對于生物技術(shù)藥物質(zhì)量標準的建立具有重要意義。