病毒性亞單位疫苗的研究進(jìn)展

蘇津賢 綜述，柏家林，張海霞 審校

1.西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030

目前，多種病毒性疾病仍在全球流行，如病毒性肝炎（包括乙型肝炎、戊型肝炎等）、出血熱烈性傳染病埃博拉、流行性乙型腦炎等，且各類(lèi)病毒及其變異株的危害日益突出。針對(duì)病毒性疾病常用的防控策略仍是接種疫苗，市售病毒性疫苗多為滅活疫苗或減毒活疫苗，可能存在毒力清除不徹底和毒力恢復(fù)等缺陷［1］。病毒性基因工程亞單位疫苗作為一種新型疫苗，發(fā)展?jié)摿薮?。該疫苗是將病原本身的關(guān)鍵蛋白轉(zhuǎn)化入合適的載體，表達(dá)相應(yīng)的保護(hù)性抗原，再將抗原與免疫佐劑混合制備而成。由于該疫苗安全性好，且能規(guī)模化生產(chǎn)，為病毒性疾病的防控提供了新的思路［2］。本文從幾種常見(jiàn)的人和動(dòng)物DNA 及RNA 病毒出發(fā)，對(duì)不同病毒亞單位疫苗的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景作一綜述，旨在為病毒性疾病亞單位疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 DNA病毒亞單位疫苗

1.1 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV） HBV 屬嗜肝DNA 病毒科，為乙型肝炎病原體。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球約有2.6 億人感染HBV，其中890 000 死于肝硬化或肝癌等并發(fā)癥［3］。早期研究發(fā)現(xiàn)，PreS1、PreS2、S 和HBcAg 是HBV 衣殼蛋白中具有免疫效應(yīng)的片段，隨機(jī)組合可制成亞單位疫苗，目前已在全球廣泛研發(fā)應(yīng)用，其安全性及有效性得到了世界范圍的認(rèn)可［4］。MALANCHèRE_BRèS等［5］將CpG的寡脫氧核苷酸與HBsAg（含PreS2 和S 抗原）結(jié)合免疫轉(zhuǎn)基因鼠，結(jié)果顯示，HBsAg 被清除的同時(shí)，還伴有特異性抗體出現(xiàn)，且HBV 基因在小鼠體內(nèi)明顯下調(diào)。為尋找更經(jīng)濟(jì)有效的疫苗研制方法，HAYDEN 等［6-7］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法構(gòu)建含HBsAg 的玉米種子，經(jīng)胚芽部位表達(dá)抗原，超臨界CO2（supercritical fluid extraction，SFE）處理獲得HBV 病毒樣顆粒（virus-like particles，VLPs）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，小鼠血清中出現(xiàn)與商業(yè)疫苗相當(dāng)?shù)腎gG和IgA反應(yīng)。此外，所有服用VLPs的小鼠在糞便與唾液中均顯示出高分泌性IgA滴度，而經(jīng)商業(yè)疫苗處理的小鼠均未檢測(cè)到。證明了SFE處理獲得的HBV VLPs 口服疫苗在血清和黏膜表面誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的可行性，推動(dòng)了口服亞單位疫苗的發(fā)展。盡管針對(duì)HBV 的預(yù)防性疫苗已廣泛應(yīng)用，但誘導(dǎo)有效抗體反應(yīng)的治療性疫苗仍無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。HBV 的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域PreS1 是病毒黏附在肝細(xì)胞的主要位點(diǎn)，可作為治療性靶點(diǎn)?；诖耍琖ANG 等［8］設(shè)計(jì)了一種鐵蛋白納米顆粒疫苗，該疫苗可將PreS1運(yùn)送至特定的髓樣細(xì)胞，刺激濾泡輔助性T細(xì)胞和B細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)高效且持久的抗PreS1 反應(yīng)，且免疫慢性HBV 感染小鼠可有效降低其體內(nèi)病毒載量，并能清除血清中的抗原；為慢性乙型肝炎的功能性治療提供了一種新的研究策略。

1.2 人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV） HPV為小雙鏈DNA 病毒，其被認(rèn)為與宮頸癌、陰莖癌、頭頸部癌等的誘發(fā)密切相關(guān)［9］。目前，通過(guò)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和酵母系統(tǒng)分別表達(dá)研制的HPV16／18二價(jià)苗Cervarix?與HPV6／11／16／18四價(jià)苗Gardasil?、HPV6／11／16／18／31／33／45／52／58 九價(jià)苗Gardasil 9?已獲批上市［10-11］。國(guó)內(nèi)目前除了已上市的二價(jià)、四價(jià)、九價(jià)苗之外，還有多種類(lèi)型的疫苗已進(jìn)入臨床階段，見(jiàn)表1。

表1 國(guó)內(nèi)臨床階段的HPV疫苗Tab.1 HPV vaccines at clinical stages in China

盡管已有多種HPV 疫苗成功研發(fā)，但目前疫苗的覆蓋面較窄，而人群對(duì)接種疫苗的意愿不斷加強(qiáng)，為滿足預(yù)防需求，科研人員針對(duì)HPV 疫苗的研發(fā)還在不斷深入。仝光杰等［12］采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功獲得與天然病毒顆粒大小相近的HPV52 L1 VLPs，用該VLPs接種小鼠后，中和抗體滴度可達(dá)106，免疫原性良好。WEI等［13］將HPV L1的N-末端截短，促進(jìn)了HPV33、52、58 在大腸埃希菌中的可溶性表達(dá)，經(jīng)純化獲得的五聚體在體外自組裝成T=7 的二十面體VLPs，與前期經(jīng)大腸埃希菌生產(chǎn)的HPV6、11、16、18 和31 5 種基因型的L1 巨噬細(xì)胞株聯(lián)合配制了一種九價(jià)HPV 候選疫苗［14-15］，小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物免疫原性試驗(yàn)表明，該HPV 九價(jià)疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體滴度與商業(yè)化疫苗水平相當(dāng)，有望成為一種新型、高效的二代HPV 預(yù)防性疫苗。除此之外，治療性疫苗也有了新進(jìn)展。SONG等［16］將兩種五肽與4-氨基脯氨酸殘基及其衍生物聯(lián)合，與HPV E7蛋白的抗原表位共組裝產(chǎn)生兩種納米顆粒肽疫苗，免疫TC-1 荷瘤小鼠后，可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟并在淋巴結(jié)內(nèi)積聚、T 細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤組織內(nèi)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞最終溶解。表明利用納米纖維肽疫苗可進(jìn)行免疫治療，為治療性疫苗的研究提供了新的思路。

1.3 非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）ASFV 為核質(zhì)巨線性雙鏈DNA 病毒，通過(guò)感染宿主單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，常引起豬出血性疾病，急性期病死率高達(dá)100%［17］。ASFV基因編碼多達(dá)170種蛋白，且大多數(shù)基因無(wú)明顯的功能特征，使得篩選能夠起到誘導(dǎo)保護(hù)的候選抗原非常困難［18］。目前尚未開(kāi)發(fā)出有效的ASFV 預(yù)防疫苗。ASFV 關(guān)鍵蛋白如P30、P54及P72可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，病毒攻擊后可阻礙病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及內(nèi)化等過(guò)程，因此是目前研究ASFV 亞單位疫苗的重要靶點(diǎn)［19］。有報(bào)道稱(chēng)，ASFV P54 和P30 蛋白聯(lián)合使用，可引發(fā)針對(duì)ASFV E75 強(qiáng)毒株的完全保護(hù)性免疫反應(yīng)［20］；另有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)桿狀病毒表達(dá)的P54 + P30 + P72 蛋白組合對(duì)ASFV毒株Malawi的致死攻擊不能提供有效保護(hù)［21］。上述結(jié)果可能是毒株來(lái)源不同所致，同時(shí)也說(shuō)明僅依靠上述幾個(gè)ASFV免疫原性靶點(diǎn)，很難獲得理想的免疫保護(hù)效果。為解決免疫原性差這一難題，研究人員嘗試將豬的免疫球蛋白IgA1 Fc片段與ASFV 的p30／p54基因連接，經(jīng)釀酒酵母表達(dá)融合蛋白P30-Fcγ 和P54-Fcα，口服后能刺激豬產(chǎn)生特異性抗體和黏膜免疫反應(yīng)［22］，為研發(fā)ASFV 疫苗提供了新的思路。

1.4 豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV） PPV 為單股線狀DNA 病毒，無(wú)囊膜，直徑約25 nm，是引起豬胚胎和胎兒感染及死亡的重要病原之一；目前國(guó)內(nèi)普遍使用全病毒滅活疫苗進(jìn)行該病的防控［23］。PPV VP2 整合了主要的抗原結(jié)構(gòu)域，并能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的中和抗體，因此，VP2 通常被認(rèn)為是制備亞單位疫苗的關(guān)鍵保護(hù)性抗原［24］。中國(guó)勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司針對(duì)PPV1 型研制的單價(jià)亞單位疫苗ReproCyc?ParvoFLEX 在歐洲已獲得許可使用［25］。YANG 等［26］選用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus）作為表達(dá)平臺(tái)，并根據(jù)密碼子偏好對(duì)VP2進(jìn)行優(yōu)化合成，獲得高效表達(dá)的PPV-VP2-VLPs，48 h產(chǎn)量即高達(dá)2.5 g／L；用該VLPs 免疫小鼠，可激發(fā)高水平的IgG 抗體和血凝抑制抗體。WANG 等［27］通過(guò)優(yōu)化密碼子與表達(dá)工藝，獲得高水平的PPV-VP2-VLPs，該VLPs 與ISA-201VG 佐劑乳化后接種豚鼠和豬，可誘導(dǎo)與PPV 商業(yè)滅活疫苗一致的血凝抑制抗體和中和抗體滴度，并顯著降低了攻毒后豚鼠脾臟和肝臟的病毒載量。HUA 等［28］報(bào)道了一種在大腸埃希菌Transetta（DE3）中可溶性表達(dá)的重組VP2 蛋白，可自發(fā)裝配成類(lèi)似天然病毒形狀并具有血凝活性的VLPs，以水包油佐劑配制該P(yáng)PV VLPs，在豚鼠（參考模型）和靶物種（斷奶仔豬和初產(chǎn)母豬）中均能誘導(dǎo)高水平的血凝抑制抗體和中和抗體。PPV VLPs單劑疫苗免疫初產(chǎn)母豬后，能對(duì)胎兒產(chǎn)生完全保護(hù)，使其免受PPV 感染。張雪花等［29］將PPV 結(jié)構(gòu)蛋白VP2 插入豬IFNγ基因中，制備表達(dá)載體rBac-VP2-IFNγ，轉(zhuǎn)染sf9 細(xì)胞后，表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。劉國(guó)陽(yáng)等［30］通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出可溶性的豬圓環(huán)病毒2 型Cap 蛋白和VP2 重組蛋白，該重組蛋白純化后與佐劑混合制備成二聯(lián)亞單位疫苗，能使小鼠產(chǎn)生強(qiáng)免疫效力。上述研究為PPV 亞單位疫苗的研發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.5 豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）PCV2 為單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA 病毒，無(wú)囊膜，屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒顆粒大小約17 nm［31］。由于PCV2在世界各地廣泛存在，且與豬多種疾病相關(guān)，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，中國(guó)勃林格殷格翰動(dòng)物保健有限公司、荷蘭英特威／先靈保雅動(dòng)物保健公司生產(chǎn)的PCV2亞單位疫苗已廣泛使用，但現(xiàn)有疫苗價(jià)格較高，因此有必要開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)有效的PCV2亞單位疫苗。ZHANG等［32］通過(guò)改造載體構(gòu)建了pBDd-3-Cap 和pBDd-2 Cap-GM-CSF 質(zhì)粒，利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)獲得直徑為17 ～25 nm 的VLPs，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Cap-GM-CSF 亞單位疫苗免疫的豬比Cap 亞單位疫苗和商業(yè)疫苗免疫的豬平均日增重更高。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）作為免疫佐劑，顯著增強(qiáng)了豬的體液免疫應(yīng)答，提高了對(duì)PCV2感染的免疫保護(hù)作用。因此，以GM-CSF作為佐劑的亞單位疫苗有望成為一種安全有效的疫苗候選物。JUNG等［33］通過(guò)用豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）GP3、GP5 及GP3 的B 細(xì)胞抗原表位替換Cap 蛋白的誘餌表位構(gòu)建重組PCV2 Cap 桿狀病毒，用由3 種重組PCV2 Cap 桿狀病毒（Bac-Cap-GP3、Bac-Cap-GP5 和Bac-Cap-GP35）形成的PCV2 VLPs 免疫小鼠，小鼠同時(shí)產(chǎn)生了高水平的PCV2和PRRSV中和抗體。WANG等［34］通過(guò)EDC／NHS 法將PCV2 Cap 的氨基末端與聚乳酸-乙醇酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA）］的羧基末端共價(jià)偶聯(lián)，PLGA-Cap 能增強(qiáng)抗原提呈細(xì)胞對(duì)抗原的靶向性，并刺激細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的中和抗體。近年來(lái)，在PCV2b亞型的衣殼蛋白（capsid protein，CP）中發(fā)現(xiàn)了一種可逃避宿主免疫反應(yīng)的誘餌表位，為了避免誘騙效應(yīng)，YU［35］等設(shè)計(jì)并制備了重組PCV2b CP（ΔCPAAAAA），將保護(hù)性中和B 細(xì)胞表位取代誘騙表位，通過(guò)小鼠和豬評(píng)價(jià)該ΔCP 誘導(dǎo)的保護(hù)性抗體應(yīng)答能力，重組蛋白免疫后可使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免受野毒株P(guān)CV2b攻擊。上述研究為針對(duì)PCV2 和其他病毒亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)提供了另一種策略。

2 RNA病毒亞單位疫苗

2.1 流感病毒（influenza virus） 流感病毒為RNA 病毒，傳染性極強(qiáng)，可在多種宿主中引起嚴(yán)重的呼吸道疾??；每年暴發(fā)的季節(jié)性流感可導(dǎo)致全球60 萬(wàn)人死亡［36］。流感病毒基因組易發(fā)生抗原漂移和轉(zhuǎn)換，病毒變異速度快，致使人群易感［37］。LIU等［38］根據(jù)GISAID與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得H7N9病毒基因與H5N1病毒的基質(zhì)蛋白（M1），密碼子優(yōu)化后共轉(zhuǎn)入sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)，獲得具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的雜合H7N9 VLPs，免疫雪貂后產(chǎn)生高水平的血凝抑制抗體和中和抗體，在H7N9病毒攻擊后，免疫組雪貂未出現(xiàn)發(fā)熱、體質(zhì)量減輕等明顯臨床癥狀，肺和上呼吸道的病毒增殖也得到遏制。瑞士諾華（Novartis）公司于2015年完成了對(duì)H7N9滅活亞單位疫苗的Ⅱ期臨床試驗(yàn)［39］，將978 名受試者隨機(jī)分為3組，分別于1、21 d接種無(wú)佐劑、AS03佐劑、MF59 佐劑的H7N9 疫苗，免疫2 劑后，無(wú)佐劑組在95%置信區(qū)間（95%CI，0% ～7%）中，其血清轉(zhuǎn)換率（seroconversion rate，SCR）為2%，遠(yuǎn)低于AS03佐劑組的84%（95%CI：76% ～91%）和MF59 佐劑組的57%（95%CI：47%～68%），表明H7N9 滅活亞單位疫苗的免疫原性較弱，必須聯(lián)合佐劑使用才能有效增強(qiáng)疫苗的免疫原性；添加AS03 佐劑的疫苗組免疫2 次后的SCR 顯著高于添加MF59 組，也表明佐劑AS03 更能發(fā)揮效用，比MF59 佐劑更有效地增強(qiáng)了疫苗的免疫原性。該免疫方案除了證明疫苗的安全性良好之外，也為佐劑的選擇提供了依據(jù)。

2.2 口蹄疫病毒（food-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）FMDV 屬無(wú)囊膜的正鏈RNA 病毒，主要感染偶蹄類(lèi)動(dòng)物，是已知的傳染性最強(qiáng)的獸類(lèi)病毒之一，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展［40］。目前針對(duì)該病的預(yù)防主要采用滅活疫苗，但該疫苗可能存在病毒滅活不徹底等缺陷。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)FMDV 的多種新型疫苗研發(fā)成為熱點(diǎn)。SCHUTTA 等［41］利用復(fù)制缺陷型人腺病毒5 型（adenovirus 5，Ad5）載體制備了無(wú)需佐劑協(xié)助的FMDV 亞單位疫苗，該疫苗免疫牛群后未產(chǎn)生嚴(yán)重臨床癥狀，并能使牛群有效抵抗“A”型FMDV 強(qiáng)毒攻擊。ZIRALDO 等［42］將Ad5載體系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，獲得了針對(duì)O1／Campos／巴西／58菌株的FMDV 亞單位疫苗，無(wú)佐劑肌肉注射2 劑后，可保護(hù)94%小鼠免受同源毒株攻擊。該系統(tǒng)的優(yōu)化顯著增強(qiáng)了疫苗性能，也為腺病毒載體系統(tǒng)的應(yīng)用與發(fā)展提供了新的策略。LI等［43］將FMDV“O”型毒株VP1蛋白與ASIA1 型毒株衣殼蛋白片段嵌合組成VLPs，該嵌合VLPs 可保護(hù)豚鼠免受FMDV 攻擊，且誘導(dǎo)的免疫小鼠特異性抗體水平明顯高于滅活疫苗。上述研究表明，嵌合VLPs有望成為抗“O”型FMDV感染的候選疫苗。KOTECHA等［44］將FMDV O1K中編碼VP1-VP3和2A基因的氨基酸序列替換為編碼SAT2 的cDNA，通過(guò)大腸埃希菌表達(dá)獲得嵌合病毒，該病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)與野生型SAT2 病毒相同，但具有更好的熱穩(wěn)定性，并能誘導(dǎo)更高水平的中和抗體滴度。LEE 等［45］通過(guò)多表位蛋白構(gòu)建技術(shù)將FMDV 流行株的5 種不同B 細(xì)胞表位和1 個(gè)T 細(xì)胞表位嵌合成重組蛋白，并與豬痢疾短螺旋體的膜蛋白BmpB偶聯(lián)，在大腸埃希菌中可溶和穩(wěn)定表達(dá)，純化后可在免疫小鼠血清中檢測(cè)到FMDV 特異性抗體，該肽具有作為FMD 候選疫苗的潛力，可作為抗FMDV流行性變異的替代疫苗。

2.3 戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV） HEV是正向單鏈RNA 病毒，直徑為32 ～34 nm。ORF2 編碼的衣殼蛋白是研制HEV亞單位疫苗的候選片段［46］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全球每年有近2 000 萬(wàn)人感染HEV［47］。目前，英國(guó)研制的rHEV 和中國(guó)研制的p179 HEV 疫苗已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段；由廈門(mén)大學(xué)和養(yǎng)生堂萬(wàn)泰公司聯(lián)合研制的HEV 亞單位疫苗于2012 年10 月在中國(guó)境內(nèi)獲批上市，這是全球首個(gè)用于預(yù)防HEV 的疫苗［48］。盡管如此，基于HEV 衣殼蛋白作為亞單位疫苗的開(kāi)發(fā)還在不斷深入。GAO等［49］通過(guò)電轉(zhuǎn)法將含有ORF2基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至乳酸桿菌NZ3900并進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物口服接種BALB／c小鼠后，檢測(cè)其黏膜免疫及血清抗體，結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)腸道免疫和細(xì)胞免疫，有望成為新型口服HEV 疫苗。盧井才等［50］通過(guò)基因合成獲得HEV ORF2 的126 ～621 位氨基酸，優(yōu)化昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)（sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞），獲得的蛋白結(jié)合氫氧化鋁佐劑免疫小鼠后，具有良好的免疫原性，可用于制備和開(kāi)發(fā)預(yù)防性疫苗。利用植物載體系統(tǒng)表達(dá)經(jīng)濟(jì)有效的HEV 特異性蛋白也有新的進(jìn)展，ZHOU 等［51］利用轉(zhuǎn)基因植物煙草成功表達(dá)了HEV pE2蛋白，產(chǎn)量可達(dá)13.27 μg／g，且能刺激小鼠產(chǎn)生pE2 特異性抗體。因此，利用植物生物反應(yīng)器研制HEV疫苗成為新的研究方向。

2.4 PRRSV PRRSV為單鏈RNA病毒，感染后易誘發(fā)妊娠母豬繁殖障礙及小豬、幼豬呼吸障礙和生長(zhǎng)延遲等臨床癥狀［52］。PRRSV 中由ORF2-5編碼的GP2-GP5蛋白與M、N蛋白是現(xiàn)階段疫苗研究的關(guān)鍵區(qū)域，由ORF5基因編碼的GP5能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體［53］。ELIZONDO-QUIROGA 等［54］設(shè)計(jì)并表達(dá)了GP3、GP4、GP5 和M 蛋白組成的嵌合蛋白（PRRSV chim），該蛋白接種小鼠和仔豬后觸發(fā)免疫保護(hù)作用，在一定程度上抑制了PRRSV 野毒株的攻擊。MURTHY等［55］以HBcAg作為載體，融合PRRSV的免疫原性表位，經(jīng)大腸埃希菌表達(dá)獲得直徑23 nm的雜合HBcAg VLPs，經(jīng)Marc 145細(xì)胞檢測(cè)，證明該P(yáng)RRSV VLPs 可阻止敏感細(xì)胞感染病毒。MA 等［56］將密碼子優(yōu)化后的GP5m 與幽門(mén)螺桿菌鐵蛋白（ferritin，F(xiàn)t）融合，桿狀病毒系統(tǒng)共表達(dá)獲得GP5m-Ft 納米顆粒疫苗，免疫豬后，能誘導(dǎo)比滅活疫苗更高的抗體滴度；且GP5m-Ft免疫可促進(jìn)Th1主導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，并增強(qiáng)特異性T 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，攻毒后與未接種疫苗的豬相比，免疫組的臨床癥狀顯著降低。轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白經(jīng)濟(jì)有效，且在農(nóng)業(yè)環(huán)境中風(fēng)險(xiǎn)低，AN 等［57］研制了含PRRSV GP4D 和GP5D 蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，喂食豬后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，免疫豬產(chǎn)生了較高滴度的PRRSV 特異性抗體和促炎細(xì)胞因子。植物來(lái)源的PRRSV 蛋白可為生產(chǎn)有效的PRRSV亞單位疫苗開(kāi)辟新的途徑。

2.5 豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV） PEDV 為線型單股正鏈RNA 病毒，主要引起新生仔豬急性腹瀉、脫水和嘔吐等，感染后死亡率高達(dá)80%［58］。S 蛋白與M 蛋白是PEDV 重要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別攜帶3 個(gè)和1 個(gè)B 細(xì)胞表位，是目前研制PEDV 亞單位疫苗的重要候選抗原區(qū)［59］。焦茂興等［60］選取PEDV 疫苗株的S、M、sM基因，通過(guò)PCR等方法獲得腺病毒穿梭質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞表達(dá)重組蛋白，細(xì)胞上清液免疫小鼠后，能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答。MAKADIYA 等［61］通過(guò)對(duì)S1 蛋白的N-端進(jìn)行亞單位疫苗設(shè)計(jì)，成功獲得真核表達(dá)載體pPinkα-S1，轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞分泌表達(dá)，免疫懷孕母豬可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG 和IgA；PEDV 攻毒后，免疫組哺乳仔豬未表現(xiàn)出嚴(yán)重疾病癥狀。王雅婷［62］利用基因工程技術(shù)將S1 的主要抗原COE 序列與不同佐劑融合，經(jīng)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得rCOE、rCOE-P1Fc、rCOE-H1Fc 3 種蛋白，輔加ISA206 佐劑免疫小鼠后，均檢測(cè)出高水平的中和抗體滴度，其中rCOE-P1Fc 蛋白免疫后抗體效價(jià)最高，為研制高效力PEDV亞單位疫苗提供了參考。

3 其他新發(fā)病毒的亞單位疫苗

3.1 埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV） EBOV 為不分段的單股負(fù)鏈RNA 病毒，是近年來(lái)新發(fā)的最致命傳染原，死亡率一度接近90%［63］。亞單位疫苗以其良好的安全性和免疫效力成為EBOV 最有潛力的候選疫苗。KONDURU 等［64］將EBOV GP 蛋白外域第1 ～637 位氨基酸插入人IgG1 Fc 片段中制成EBOVgp-Fc，此融合蛋白可形成同源三聚體，能保護(hù)小鼠抵抗致死量EBOV 的攻擊。AGNOLON 等［65］認(rèn)為EBOV黏蛋白缺失的構(gòu)建體經(jīng)CHO 表達(dá)后，可有效執(zhí)行體內(nèi)發(fā)生的弗林蛋白水解步驟，從而增強(qiáng)受體結(jié)合，因此，其將可溶性糖蛋白DTM、黏蛋白結(jié)構(gòu)域缺失的糖蛋白DTM-DMUC 以及2個(gè)帶有C-末端三聚化基序的糖蛋白DTM-DMUC 變異體經(jīng)CHO 細(xì)胞共表達(dá)，獲得可溶性三聚體重組抗原，可對(duì)EBOV 疾病幸存者自然感染產(chǎn)生的抗體顯示出較強(qiáng)的親和力。LIU 等［66］用EBOV GP 蛋白制成亞單位疫苗，配合皂苷免疫佐劑免疫小鼠，可在小鼠感染EBOV 中起到保護(hù)作用。除此之外，VP24和VP40基因所編碼的蛋白可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)宿主的保護(hù)性免疫反應(yīng)。LEHRER 等［67］將EBOV 的GP、VP24 和VP40 蛋白轉(zhuǎn)入果蠅S2 細(xì)胞共表達(dá)，細(xì)胞上清液免疫小鼠后，能夠100%保護(hù)致死量EBOV的攻擊。

3.2 中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-corona-virus，MERS-CoV） MERS-CoV 以RNA 作為遺傳物質(zhì)，致死率高達(dá)35%，目前尚無(wú)獲批的MERS-CoV 預(yù)防性疫苗上市［68］。有研究發(fā)現(xiàn)，MERS-CoV 尖峰蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（receptor-binding domain，RBD）可作為疫苗靶標(biāo)。TAI等［69］將MERS-CoV RBD 殘基與Fd三聚基序（RBD-Fd）融合構(gòu)建重組三聚體，其可特異識(shí)別MERS-CoV 受體，誘導(dǎo)高效的IgG 抗體，有效保護(hù)hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠免受致命MERS-CoV攻擊。ZHANG等［70］也認(rèn)為基于MERS-CoV 尖峰蛋白R(shí)BD 研制的疫苗具有更強(qiáng)的免疫效價(jià)，RBD 的重組蛋白配合MF59佐劑對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生強(qiáng)的中和抗體，并能使小鼠抵抗MERS-CoV 攻擊。MA 等［71］根據(jù)S 蛋白R(shí)BD 中S377-588-Fc 片段構(gòu)建的重組蛋白能在小鼠與家兔體內(nèi)誘導(dǎo)高效價(jià)的中和抗體，可作為開(kāi)發(fā)MERS 疫苗的理想候選區(qū)。上述研究均證實(shí)，MERS-CoV 的RBO 蛋白是研制MERS 亞單位疫苗的一個(gè)重要抗原表位。

3.3 2019新型冠狀病毒（2019 novel corona virus，2019-nCoV） 2019-nCoV屬冠狀病毒亞科，為單鏈RNA病毒，直徑約160 nm，基因組大小為27 000 ～32 000 bp［72］。2019-nCoV 主要引起新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19），據(jù)WHO報(bào)道，截至2021 年10月26日，該病感染確診人數(shù)超過(guò)2.4億，死亡人數(shù)高達(dá)490 萬(wàn)［73］。盡管已研發(fā)出2019-nCoV 滅活疫苗與腺病毒載體疫苗，但針對(duì)2019-nCoV 新型疫苗的研發(fā)仍迫在眉睫。2019-nCoV 的S 蛋白R(shí)BD 是目前開(kāi)發(fā)亞單位疫苗的最佳抗原區(qū)之一［74］。2020 年10月，俄羅斯針對(duì)2019-nCoV 研制的EpiVacCorona 亞單位疫苗獲得了在該國(guó)使用的監(jiān)管批準(zhǔn)［75］。中國(guó)微生物研究所與安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司研制的2019-nCoV RBD 二聚體亞單位疫苗ZF2001 已于2020 年11 月進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，因效果突出，于2021年3月10日成為國(guó)際上第一個(gè)獲批臨床使用的抗COVID-19重組亞單位疫苗［76］。美國(guó)Novavax生物技術(shù)公司構(gòu)建了S 蛋白全基因，經(jīng)sf9 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制備了2019-nCoV S 亞單位疫苗NVXCoV2373，結(jié)合皂苷基Matrix-M?佐劑可誘導(dǎo)非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物產(chǎn)生高滴度的中和抗體；目前，該公司研制的NVXCoV2373 疫苗已于2020 年9 月在英國(guó)啟動(dòng)了Ⅲ期臨床試驗(yàn)［77］。加拿大Medigen 公司研發(fā)的植物源VLPs 2019-nCoV VLPs疫苗已進(jìn)入Ⅱ／Ⅲ期臨床試驗(yàn)。另外，還有威克斯／中國(guó)華西醫(yī)院、古巴Finlay 疫苗研究所和賽諾菲（Sanofi）／葛蘭素史克（GSK）制藥公司等研發(fā)的2019-nCoV亞單位疫苗正在進(jìn)行第一／第二階段試驗(yàn)［78］。TAN等［79］通過(guò)SpyTag／Spycacher技術(shù)獲得直徑為36 nm的2019-nCoV RBD VLPs（RBD-Spy VLPs），該候選疫苗在小鼠和豬中具有高免疫原性，誘導(dǎo)了高水平的2019-nCoV中和抗體反應(yīng)，可作為一種有效且廉價(jià)的抗COVID-19候選疫苗。目前，在英國(guó)、南非、巴西已出現(xiàn)不同變異毒株，印度甚至出現(xiàn)了三重變異毒株，現(xiàn)有疫苗面臨巨大的效力挑戰(zhàn)，防控新型毒株大流行仍十分重要，研究人員針對(duì)2019-nCoV的研究仍在不斷深入。

4 問(wèn)題及展望

隨著許多高致病性病毒在全球范圍內(nèi)的流行，有效的疫苗免疫仍是預(yù)防病毒感染最安全有效的方法，亞單位疫苗的研發(fā)為抵抗病毒感染提供了有效屏障。DNA、RNA 病毒及其他新發(fā)病毒亞單位疫苗的研發(fā)均取得了一定成果，其中部分病毒性亞單位疫苗已有產(chǎn)品上市，但大部分亞單位疫苗的研制仍處于臨床前研究，距離臨床研究尚有一段距離。

由于亞單位疫苗只含部分病原體的免疫活性片段，雖可誘導(dǎo)記憶輔助性T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的產(chǎn)生，但由于其缺乏病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），難以產(chǎn)生記憶殺傷性T 細(xì)胞，導(dǎo)致存在免疫效價(jià)較低的問(wèn)題［80］。目前，將亞單位疫苗與佐劑聯(lián)用，可在一定程度上解決該問(wèn)題。免疫佐劑能作為特異性免疫增強(qiáng)劑，也可作為載體將抗原靶向感染抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cells，APCs），觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，增強(qiáng)抗原的免疫原性［81］。其中，鋁佐劑、弗氏佐劑、中藥佐劑（皂苷、中藥多糖、中藥復(fù)方等）、蜂膠佐劑等應(yīng)用較廣泛，除此之外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)一些小分子多肽類(lèi)具有提升機(jī)體免疫效應(yīng)的能力，具備佐劑功效［82］。因其具有安全性高，獲取簡(jiǎn)單，易合成，純度高及便于儲(chǔ)存運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)逐漸引起研究者的關(guān)注，有望成為一種新型佐劑，改善亞單位疫苗免疫原性弱的現(xiàn)狀。

目前，生產(chǎn)應(yīng)用的重組蛋白產(chǎn)品約30%由大腸大腸埃希菌提供，但該菌細(xì)胞內(nèi)缺乏糖基化和磷酸化作用，且原核細(xì)胞質(zhì)不是形成復(fù)雜二硫鍵的合適場(chǎng)所，導(dǎo)致外源蛋白在細(xì)菌胞質(zhì)中表達(dá)尤為困難，而缺失折疊的蛋白易聚集成不溶性包涵體，生物活性低，易被內(nèi)源蛋白酶降解［83］。這使得重組亞單位疫苗候選物的生產(chǎn)和儲(chǔ)存復(fù)雜化。目前通過(guò)維持中間折疊條件的穩(wěn)定和促進(jìn)成熟結(jié)構(gòu)的形成，如表達(dá)宿主的改造、融合標(biāo)簽的引入、伴侶蛋白或折疊酶的共表達(dá)等方式干擾蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域來(lái)防止蛋白聚集，可提高表達(dá)效率［84］。酵母表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用于亞單位疫苗研發(fā)的第二大表達(dá)系統(tǒng)，但該系統(tǒng)周期較長(zhǎng)，易受菌種、外源基因特性及發(fā)酵模式等諸多因素的影響，進(jìn)而制約外源蛋白的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。目前，通過(guò)強(qiáng)啟動(dòng)子優(yōu)化、多拷貝和高表達(dá)量菌株篩選、敲除蛋白酶等基因、促折疊因子共表達(dá)、跨膜信號(hào)肽突變以及發(fā)酵工藝的優(yōu)化等策略，可大部分解決上述難題［85］。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的蛋白在生物活性、免疫原性方面均與其天然產(chǎn)物相近，并能將所表達(dá)的復(fù)合蛋白進(jìn)行組裝，在VLPs 疫苗生產(chǎn)中極具應(yīng)用前景，但其在靶蛋白的生產(chǎn)過(guò)程中成本較高，糖基化程度不足、易引發(fā)細(xì)胞凋亡，存在蛋白穩(wěn)定性的問(wèn)題。目前通過(guò)對(duì)桿狀病毒載體的設(shè)計(jì)與優(yōu)化、宿主細(xì)胞部分基因的敲除／敲入、無(wú)血清培養(yǎng)細(xì)胞株的馴化及簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝等一系列改造，可顯著改善桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的各項(xiàng)性狀［86］。

隨著研究不斷深入，各系統(tǒng)在逐步完善，基因工程亞單位疫苗的相關(guān)研究也在不斷深入及改進(jìn)，期望在未來(lái)病毒性疾病的流行防控中發(fā)揮巨大作用，保障人類(lèi)與動(dòng)物的健康安全。