洋蟲(chóng)內(nèi)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶內(nèi)生菌發(fā)酵液轉(zhuǎn)化人參皂苷產(chǎn)物分析及其抗腫瘤活性研究

胡茜， 王藝凝， 申鵬飛， 李雅倩， 楊陽(yáng)， 王艷成，姬文秀*， 董微巍*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 吉林 延吉 133000； 2.吉林省和龍市工商聯(lián)， 吉林 和龍 133400）

人參（Panax ginsengC. A. mey）為五加科人參屬多年生草本植物[1]。在2012 年，人參（人工種植）被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，同時(shí)其在保持人體健康和平衡機(jī)體狀態(tài)方面的保健作用日漸引起人們的關(guān)注[2-3]。人參皂苷是人參中主要的活性成分，具有抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂、促進(jìn)細(xì)胞再生等多種功效[4-9]。研究表明，人參皂苷口服后在人體腸道菌作用下轉(zhuǎn)化為人參皂苷的去糖基代謝產(chǎn)物更具藥理活性[10]，如Rh1、Rg3 和compound K 等都可以直接作用于癌癥組織，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[11-14]。但是，由于人體腸道菌群的個(gè)體差異及人參皂苷在體內(nèi)的停留時(shí)間等原因，使有些皂苷未在轉(zhuǎn)化前就被排出體外，因此口服人參皂苷的作用效果較低，在生物體內(nèi)的利用率不高。因此，體外人參皂苷去糖基化修飾對(duì)于提高人參的藥用價(jià)值具有十分重要的意義。

內(nèi)生菌資源在天然產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化中作為一類新型生物催化劑備受關(guān)注[15-16]。藥用昆蟲(chóng)洋蟲(chóng)內(nèi)生菌資源豐富，體內(nèi)生存環(huán)境獨(dú)特[17]，因其喜食中藥人參所以推測(cè)其體內(nèi)具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶水解人參皂苷功能的內(nèi)生菌。因此，本研究對(duì)洋蟲(chóng)體內(nèi)高效產(chǎn)β-葡萄糖苷酶內(nèi)生菌進(jìn)行篩選、鑒定，制備復(fù)合工程菌劑，液態(tài)發(fā)酵轉(zhuǎn)化人參皂苷，提高Rh1、Rg3、compound K 等去糖基化人參皂苷的轉(zhuǎn)化率，對(duì)動(dòng)態(tài)發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程中人參皂苷及其代謝產(chǎn)物化學(xué)組成進(jìn)行研究，采用體外模擬人參皂苷在洋蟲(chóng)體內(nèi)的代謝過(guò)程，明確其生物轉(zhuǎn)化機(jī)制，利用四甲基噻唑藍(lán)（methylthiazoletrazolium，MTT）染色法闡明低、中、高劑量發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌A549細(xì)胞抗腫瘤活性，為人參皂苷系列產(chǎn)品及功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，為中藥資源的綜合利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)材料：人肺腺癌耐順鉑株（A549/DDP）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司（Procell Life Science & Technology Co., Ltd.）；洋蟲(chóng)來(lái)自延邊大學(xué)植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室；正丁醇、無(wú)水乙醇、次氯酸鈉等均為分析純，購(gòu)于南京化學(xué)試劑股份有限公司；新鮮人參根（4 年生植物）來(lái)自于吉林集安人參培育基地；人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh1、Rg2、Rg3、F1、PPD 和compound K 購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)。

儀器包括離心機(jī)（TD-4C 型，金壇區(qū)金城海瀾儀器制造廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2010 型，鄭州予達(dá)儀器科技有限公司）、培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraus 公司）、倒置熒光相差顯微鏡（CR15-860HD 型，蘇州倍特嘉光電科技有限公司）。

1.2 人參皂苷提取物的制備及定性分析

人參粗皂苷制備：取100 g 洗凈的人參，干燥后粉碎成粉末，利用80%乙醇在82 ℃條件下索氏回流提取3 h，反復(fù)提取2 次后將萃取液合并，真空旋干，再置于烘箱50 ℃干燥脫水，制備人參粗皂苷粉末，備用。

定性分析：使用甲醇溶解人參皂苷粉末后用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析人參粗皂苷中的單體皂苷組成。

1.3 洋蟲(chóng)內(nèi)生菌液的制備

以紅棗和人參飼料按4∶1 的混合比例對(duì)洋蟲(chóng)進(jìn)行飼養(yǎng)，培養(yǎng)箱體積40 cm×60 cm×20 cm，培養(yǎng)箱恒溫24 ℃、濕度75%的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)1 年。取洋蟲(chóng)成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)各45 只，同齡期洋蟲(chóng)15 只為1 組，每組生物學(xué)重復(fù)3 次；將洋蟲(chóng)用無(wú)菌水清洗干凈后，在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)將其頭部、翅部去除，放置于75%乙醇中90 s，后經(jīng)次氯酸鈉溶液浸泡15 s，去除洋蟲(chóng)體表微生物后用滅過(guò)菌的蒸餾反復(fù)沖洗，研缽研磨，加入蒸餾水移至離心管；500 r·min-1離心5 min，將上清液取出，再10 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀；最后向沉淀中加入PBS 緩沖液，制備成洋蟲(chóng)內(nèi)共生菌液。

1.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株篩選、鑒定及高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶復(fù)合菌發(fā)酵液的制備

1.4.1 七葉苷培養(yǎng)基篩選高效產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株 取100 μL 稀釋好的洋蟲(chóng)菌液加到MRS 篩選培養(yǎng)基（添加秦皮甲素和檸檬酸鐵），將洋蟲(chóng)菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中顛倒放置，在厭氧條件下培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長(zhǎng)。將邊緣整齊且呈黑褐色的單一菌落挑選出來(lái)，將其接種到新的純化培養(yǎng)基上，進(jìn)行多次重復(fù)純化直至得到單一菌株。從菌株中挑選出4 株菌落顏色較深且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌株，即為高效功能菌株。

1.4.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用土壤基因組DNA提取試劑盒（DP336）提取基因組DNA，采用通用引物（上游引物ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和下游引物ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進(jìn)行PCR。PCR體系25 μL，包括：1×PCR buffer、1.5 mmol·L-1MgCl2、200 μmol·L-1dNTPs 0.5 μmol·L-1上下游引物、50 ng模板DNA 以及0.5 UTaqDNA 聚合酶。以ICycler 熱循環(huán)儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)合格后送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4.3 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶復(fù)合菌液的制備 按照相同比將4 株功能菌株進(jìn)行5 d 的規(guī)模化培養(yǎng)馴化，制備成復(fù)合工程菌種子液，備用。

1.5 復(fù)合菌液與人參皂苷的發(fā)酵反應(yīng)

取人參皂苷粗提物4 mg，加入種子液500 μL至2 mL 離心管中，混合均勻，在厭氧條件下（N285%，H210%，CO25%）將篩選出的菌株及篩選菌株的混合菌株富集培養(yǎng)24 h 后，將菌液與人參主皂苷反應(yīng)20 d，分別在生物反應(yīng)時(shí)間為0、1、2、3、7、12 和20 d 時(shí)采集發(fā)酵產(chǎn)物，利用LC-MS/MS 測(cè)定分析。

1.6 HPLC-MS/MS發(fā)酵產(chǎn)物分析

1.6.1 色譜條件 采用安捷倫1260 系列液相色譜系統(tǒng)與安捷倫Poroshell ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和C18保護(hù)柱進(jìn)行檢測(cè)分析。該系統(tǒng)使用Mass Hunter 采集軟件B.07.00 進(jìn)行操作。流動(dòng)相A 為0.1%甲酸-水溶液、B 為0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脫程序：B體積分?jǐn)?shù)由0%于0—20 min 內(nèi)線性升至23%；在13—33 min 由23%提升至46%；在33—38 min 由46%提升至68%；在38—45 min以68% 維持7 min；在45—55 min 由68% 提 升 至100%；在55—63 min 由100%降至23%。進(jìn)樣量2 μL，流速0.5 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

1.6.2 質(zhì)譜條件 采用安捷倫1260HPLC 系統(tǒng)聯(lián)用安捷倫6420 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-QQQMSMS, Agilent Technologies, Santa Clara, USA)進(jìn)行質(zhì)譜分析。離子化條件如下：ESI 電離源，正離子掃描，噴霧電壓4 kV。采用二級(jí)全掃描模式，掃描質(zhì)荷比范圍500～1 500。采用多離子檢測(cè)模式作為篩選及評(píng)價(jià)方法，對(duì)各天然物樣品中皂苷類物質(zhì)進(jìn)行初步篩選檢測(cè)，數(shù)據(jù)處理軟件為Mass Hunter工作站B.06.06軟件[18]。

1.7 發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)A549細(xì)胞抗腫瘤活性

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，將細(xì)胞懸液的含量調(diào)至5×104cell·mL-1。96 孔培養(yǎng)板中每個(gè)孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，將其放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞長(zhǎng)至單層；然后將孔中上部澄清的液體吸出舍棄，利用PBS 緩沖液洗1～2遍后，加入培養(yǎng)基（不含血清）稀釋分別得到0、0.5、2.0、5.0 mg·L-1的篩選組分。每個(gè)水平6 次重復(fù)。每個(gè)孔抽取100 μL 篩選出來(lái)的組分。將細(xì)胞板放在培養(yǎng)箱中孵育48 h，繼續(xù)將孔中上部澄清的液體吸出舍棄，用PBS 溶液淋洗2 遍。在MTT法中，向每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg·L-1，即0.5% MTT）和80 μL 培養(yǎng)基（不含血清），4 h后培養(yǎng)終止，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μL DMSO，搖床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。利用ELISA reader 在波長(zhǎng)490 nm 測(cè)得OD值，同時(shí)觀察細(xì)胞活性。試驗(yàn)中設(shè)立空白對(duì)照（無(wú)細(xì)胞，加培養(yǎng)基、MTT 和DMSO）。3 次重復(fù)試驗(yàn)，取平均值用來(lái)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.8 方法評(píng)價(jià)

進(jìn)樣液體為10 種人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液。以混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以定量離子色譜的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用信噪比S∶N =3∶1 時(shí)的含量計(jì)算各人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出含量（limit of detection，LOD），用信噪比S∶N =10∶1 時(shí)的含量計(jì)算定量限（limit of quantitation，LOQ）。向空白菌液發(fā)酵產(chǎn)物樣品中分別添加高（5 mg·L-1）、中（2 mg·L-1）、低（0.5 mg·L-1）3種不同水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平平行制備3份，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS11. 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷樣品的統(tǒng)計(jì)與評(píng)價(jià)

配制100、200、500、1 000、2 000、5 000、8 000和10 000 ng·mL-1人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)液，以人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為x軸，其對(duì)應(yīng)峰面積為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果（表1）表明，在100～10 000 ng·mL-1范圍內(nèi)，10 種皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系較好，R2均在0.99以上。以3倍信噪比計(jì)算10種標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限，不同標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限在8.5～12.9 ng·mL-1之間；以10 倍信噪比定量限，不同標(biāo)準(zhǔn)品的定量限在28.8～34.9 ng·mL-1之間，平均回收率為83.9%～119.3%，表明該方法可以滿足檢測(cè)要求。

表1 人參皂苷樣品的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限、定量限及回收率Table 1 Regression equation， correlation coefficient， linear range， detection limit， quantification limit and recovery rate of ginsenoside samples

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株的分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，從洋蟲(chóng)成蟲(chóng)、幼蟲(chóng)菌液中篩選出4株具有明顯顯色反應(yīng)的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能菌株，經(jīng)18S rRNA 基因擴(kuò)增進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和Blast 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，4 個(gè)菌株分別為煙曲霉（Aspergillus fumigatus） 、鴿 色 藍(lán) 狀 菌（Talaromyces columbinus）、長(zhǎng)枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）及粉色面包霉菌（Neurospora crassa）（表2）。

表2 4株菌的18S rRNA基因相似性對(duì)比及鑒定結(jié)果Table 2 Comparison of 18S rRNA gene similarity of 4 strains and identification results

2.3 洋蟲(chóng)內(nèi)生菌復(fù)合菌液發(fā)酵人參皂苷粗提物發(fā)酵產(chǎn)物分析

2.3.1 復(fù)合菌液與人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物定性分析由圖1和圖2可知，在人參皂苷提取物中共檢測(cè)出Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2 和Rd 7 種人參皂苷；在復(fù)合菌液中功能菌的協(xié)同作用下，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中檢測(cè)出Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2 和Rd 7 種人參皂苷和Rg3、compound K和Rh1 3種人參皂苷去糖基化產(chǎn)物，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其代謝產(chǎn)物含量呈明顯升高趨勢(shì)。由此表明，利用洋蟲(chóng)內(nèi)生菌復(fù)合菌液直接發(fā)酵人參皂苷粗提物可同時(shí)制備多種高活性次級(jí)人參皂苷產(chǎn)物。

圖1 4株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌聯(lián)合發(fā)酵人參皂苷提取液產(chǎn)物分析Fig. 1 Analysis of the product of 5 strains of β-glucosidase-producing fungi combined fermentation of ginsenoside extract

圖2 發(fā)酵產(chǎn)物EIC色譜圖Fig. 2 EIC chromatogram of fermentation products of ginseng extract

2.3.2 復(fù)合菌液與人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物定量分析由圖3 可知，大部分人參皂苷隨著發(fā)酵反應(yīng)的進(jìn)行含量逐漸減少；而人參皂苷Rd的含量為先降低后升高；發(fā)酵產(chǎn)物人參皂苷Rg3 的含量先增加后降低，8 d 時(shí)含量最高，為425 mg·mL-1，20 d 時(shí)降至221 mg·mL-1；去 糖 基 化 人 參 皂 苷Rh1 和compound K 含量呈上升趨勢(shì)。這可能是隨著發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)行人參皂苷被水解，大部分人參皂苷含量降低，其中人參皂苷Rd作為代謝中間產(chǎn)物在代謝初期被水解轉(zhuǎn)化，同時(shí)二醇類皂苷Rb1、Rc、Rb2在發(fā)酵反應(yīng)過(guò)程中C-20位外部糖基被水解掉又轉(zhuǎn)化生成Rd，因此，0～3 d 人參皂苷Rd 含量呈下降趨勢(shì)，在3～20 d又呈升高趨勢(shì)。Rd在β-葡萄糖苷酶等水解酶的作用下（水解掉C-20 位糖基）轉(zhuǎn)化為分子量更小的人參皂苷Rg3，同時(shí)C-3位糖基被復(fù)合功能菌水解產(chǎn)生人參皂苷compound K，因此，Rg3 和compound K 含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加。三醇類人參皂苷Rg1、Re、Rf的主要發(fā)酵產(chǎn)物為稀有人參皂苷Rh1，其中，Re 在β-葡萄糖苷酶等水解酶的作用下C-6 位外部糖基被水解掉，轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rg1，Rg1 再水解掉C-6 位外部糖基轉(zhuǎn)化生成人參皂苷Rh1；Rf 直接被水解掉C-6 位外部糖基轉(zhuǎn)化生成Rh1，因此，Rh1 含量呈上升趨勢(shì)。綜上所述，人參皂苷二醇類皂苷以Rd為中間代謝產(chǎn)物，生物轉(zhuǎn)化途徑為Rb1/Rb2/Rc→Rd→Rg3/compound K；三醇類人參皂苷的轉(zhuǎn)化途徑為Re→Rg1→Rh1和Rf→Rh1，且人參皂苷二醇類皂苷更容易被發(fā)酵菌劑水解。

圖3 4株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶真菌聯(lián)合發(fā)酵產(chǎn)物人參皂苷定量分析Fig. 3 Quantitative analysis of ginsenosides from the combined fermentation of 4 β-glucosidase-producing

2.4 復(fù)合菌液與人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌A549細(xì)胞活性的影響

由圖4 可知，復(fù)合菌液與人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物具有較好的抗腫瘤活性，抗腫瘤效果優(yōu)于發(fā)酵菌液及人參皂苷粗提物。對(duì)比復(fù)合菌液與人參皂苷發(fā)酵20 d 產(chǎn)物在不同劑量（0.5、2.0 和5.0 mg·L-1）和不同處理時(shí)間下對(duì)肺癌A549細(xì)胞抑制效果，結(jié)果（圖5）表明，發(fā)酵產(chǎn)物在5.0 mg·L-1、反應(yīng)72 h時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)85%，且在一定的范圍內(nèi)隨著發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度的升高對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯升高。

圖4 洋蟲(chóng)內(nèi)生真菌/人參皂苷20 d發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞抑制率Fig. 4 Inhibition rate of 20-day fermentation product of endophytic fungi/ginsenosides of worms on lung cancer cell A549 fermentation

圖5 復(fù)合菌液-人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)肺癌A549細(xì)胞的活性抑制率Fig. 5 Inhibition rate of compound bacterial liquid-ginsenoside fermentation product on lung cancer A549 cells

3 討論

稀有人參皂苷的各種生物活性越來(lái)越受到人們的重視，但是由于其天然含量低，使其在開(kāi)發(fā)利用時(shí)備受限制，利用生物轉(zhuǎn)化法對(duì)人參皂苷的糖鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，成為獲得稀有人參皂苷的有效途徑。目前，多數(shù)研究停留于單一菌株轉(zhuǎn)化單一皂苷，如程雅韻等[19]從發(fā)酵食品中分離篩選出1株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的植物乳桿菌菌株E9，可將Rb1轉(zhuǎn)化成Rg3；張麗娜等[20]從人參種植土中篩選到1 株可將Re 轉(zhuǎn)化為Rhl 的菌株S329，但是皂苷單體提純工藝復(fù)雜，產(chǎn)品生產(chǎn)成本價(jià)格高，因此難以推廣應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。本研究利用喜食人參的洋蟲(chóng)源內(nèi)生菌復(fù)合劑直接發(fā)酵人參皂苷粗提物，同時(shí)制備多種高活性次級(jí)人參皂苷產(chǎn)物，使其更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

不同人參皂苷單體具備不同的藥理活性。目前，人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物在抗腫瘤方面取得突破性進(jìn)展，庫(kù)受權(quán)[21]檢測(cè)紅曲霉和人參雙向固體發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的抑制率，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度為200、100、50 和25 μg·mL-1時(shí)抑制率分別為50.89%、36.19%、23.18%、20.68%，與本研究結(jié)果一致，即在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)癌癥細(xì)胞的抑制率隨著其質(zhì)量濃度的增加逐漸升高。吳彤[22]用MTT 比色法與流式細(xì)胞儀分析Rg3對(duì)人大腸癌細(xì)胞株HCE8693 的生長(zhǎng)抑制作用，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Rg3 含量為0.010%、0.017%、0.025%和0.050%時(shí)對(duì)HCE8693 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為8.6%、8.6%、18.7%和21.9%。對(duì)比前人研究結(jié)果，本研究的復(fù)合菌劑與人參皂苷發(fā)酵代謝產(chǎn)物更加豐富（10 種），乙醇萃取的發(fā)酵產(chǎn)物在5.0 mg·L-1、反應(yīng)72 h 時(shí)的腫瘤細(xì)胞抑制率可達(dá)85%，且隨著發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量濃度的增加，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率明顯升高，即對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果更加明顯。此后，在此基礎(chǔ)上本課題組將進(jìn)一步深入研究，探明復(fù)合菌劑與人參皂苷發(fā)酵產(chǎn)物抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，為抗腫瘤先導(dǎo)藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。