高效毛細(xì)管電泳法測定金針菇提取物中β-煙酰胺單核苷酸含量的初步研究

馬曉穎， 肖軍， 陳珣， 龔娜， 劉國麗， 楊濤， 肇瑩

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110161）

金針菇(Flammulina velutiper (Fr.) Sing.)學(xué)名毛柄金錢菌，又名冬菇、樸菰、凍菌、構(gòu)菌等。早春和晚秋至初冬，在闊葉林腐木樁上或根部叢生，有白色和褐色品種[1]。金針菇的氨基酸含量豐富，其營養(yǎng)價值高、味鮮，被稱為“增智菇”，是廣為人知的食藥用菌[2]；多糖成分具有抗癌功效[3]，對肺癌[4]和肝癌[5-6]效果顯著；蛋白質(zhì)、維生素[7]和脂肪可為人體提供能量，增強(qiáng)免疫力，具有降血脂、抗疲勞、抗氧化[8]等功效；膳食纖維和微量元素有助于營養(yǎng)吸收；賴氨酸和精氨酸的含量明顯高于其他菇類[2]；另外金針?biāo)剡€具有緩解疲勞的作用[9]。在我國，金針菇栽培起步很早，但到20 世紀(jì)80 年代后才真正實(shí)現(xiàn)商品化，目前以白色品種為主，主要有袋栽和瓶栽2 種工廠化生產(chǎn)模式。β-煙酰胺單核苷酸（β-nicotinamide mononucleotide，NMN）是一種單核苷類化合物，能夠顯著改善小鼠的生理機(jī)能衰退，增強(qiáng)能量代謝，改善胰島素敏感性和血漿中脂質(zhì)的分布情況，并且可以改善眼部功能[10]。據(jù)報道，NMN 主要存在于蔬菜、水果中[11]，未見有關(guān)于金針菇中β-煙酰胺單核苷酸含量的研究報道。

毛細(xì)管電泳技術(shù)(high performance capillary clectrophoresis，HPCE)是一種高效分離分析技術(shù)，依據(jù)樣品各成分淌度和分配行為上的差異以高壓電場為驅(qū)動而實(shí)現(xiàn)分離，其柱效可比高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)高1～2 個數(shù)量級，復(fù)雜樣品的特征性也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HPLC[12]，具有所需樣品少、靈敏度高、成本低、抗污染能力強(qiáng)、柱效高、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥診斷、刑事偵查、環(huán)境監(jiān)測等方面發(fā)揮了一定的作用[13]?，F(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于β-煙酰胺單核苷酸含量測定方法比較常用的是液相色譜方法，但是該方法需要用到的色譜柱經(jīng)常需要維護(hù)，成本高，并且全程使用有機(jī)溶劑，在測定過程中溶劑揮發(fā)會影響操作者的健康，測定結(jié)束后的有機(jī)廢液也需要特殊處理，排放的過程也會有污染。本研究提供的金針菇中β-煙酰胺單核苷酸含量的毛細(xì)管電泳測定方法，在毛細(xì)管運(yùn)行過程中不需要有機(jī)溶劑，緩沖液為無機(jī)鹽溶液沒有揮發(fā)性，可以減少有機(jī)溶劑的污染，對人和環(huán)境都比較友好。本研究以金針菇的提取液為測定對象，利用高效毛細(xì)管電泳法測定金針菇中β-煙酰胺單核苷酸含量，實(shí)現(xiàn)了β-煙酰胺單核苷酸的定性和定量的測定，該方法簡單可靠，既可以測定金針菇提取液中的β-煙酰胺單核苷酸，也可以將此方法應(yīng)用到其他的食用菌品種中去。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金針菇子實(shí)體來源于遼寧省沈陽市恒生生物有限公司；金針菇品種來源于韓國；β-煙酰胺單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；試驗(yàn)中用的試劑均為分析純和色譜純；試驗(yàn)用水為超純水，Na2B4O7、H3BO3、Na2HPO4、NaH2PO4為美國Amresco生物試劑公司生產(chǎn)。

試驗(yàn)用儀器：P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀（美國貝克曼公司）、電子天平（ME204E 梅特勒-托利多儀器有限公司）、精密pH計(jì)（北京泰亞賽?？萍及l(fā)展有限責(zé)任公司）、HZQ-QX 全溫振蕩器（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、干熱消毒箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Cascada?實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)（Pall corporation）、微孔濾膜（孔徑0.22 μm，津隆設(shè)備有限公司）和A11 高速粉碎機(jī)（德國IKA集團(tuán)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 取20 g 金針菇子實(shí)體60 ℃烘干，粉碎，過400目篩，得到菌粉按照1 g干重加水15 mL 的比例加水混合,65 ℃超聲30 min，抽濾后取上清液，將過濾好的提取物用0.22 μm孔徑的水系濾膜濾過，4 ℃保存待用[14]。

1.2.2 β-煙酰胺單核苷酸的配制 用精密天平稱取5 mg β-煙酰胺單核苷酸，放到1.5 mL 的離心管中，用1.0 mL 超純水溶解，配成5 mg·mL-1的對照品母液，水系濾膜過濾備用，冰箱4 ℃避光保存。

1.2.3 毛細(xì)管電泳分離條件的確定 為了獲得分離度比較好的峰型，分別對不同的緩沖液進(jìn)行了篩選，電泳操作條件如下：①30 mmol·L-1硼砂緩沖液pH 分別為8.0、8.5、9.0、9.5；②50 mmol·L-1檸檬酸緩沖液pH 分別為5.5、6.0、6.5；③20 mmol·L-1磷酸緩沖液pH分別為7.0、7.5。

其他條件：毛細(xì)管有效檢測長度57 cm，內(nèi)徑為30 μm，電泳溫度25 ℃，進(jìn)樣時間5 s，進(jìn)樣壓力0.5 psi，電壓25 kV，紫外檢測波長218 nm。

1.2.4 特異性考察 吸取5 mg·mL-1的β-煙酰胺單核苷酸10 μL，加入到100 μL的金針菇提取物上清液中，配成β-煙酰胺單核苷酸濃度為5 μg·mL-1的混合液；將單獨(dú)NMN、單獨(dú)金針菇提取物以及金針菇加NMN 的混合液依次進(jìn)樣。進(jìn)樣5 次，觀察檢測峰附近是否存在干擾峰，用以判斷方法的特異性[15]。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將β-煙酰胺單核苷酸配成5 mg·mL-1的母液，用超純水溶解。將β-煙酰胺單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品配成質(zhì)量濃度為0.03、0.20、0.50、1.00、2.00 mg·mL-1，依次進(jìn)樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度x（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程以測定質(zhì)量濃度。

1.2.6 靈敏度測定 將得到的β-煙酰胺單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品加到金針菇子實(shí)體提取液中，進(jìn)行無限稀釋，再按照1.2.3 電泳條件分別進(jìn)樣，找到信噪比（S/N）為3 的以確定檢測限（limit of detection，LOD）。

1.2.7 回收率測定 將已知含量的金針菇樣品中按照測定的質(zhì)量濃度分別加入300%、100%和30% 3 種不同量β-煙酰胺單核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照制備方法配制并進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳進(jìn)樣測定，利用下面公式計(jì)算加樣的回收率。

1.2.8 方法的精密度和穩(wěn)定性測定 精密度是指在規(guī)定條件下，用1個均勻樣品，經(jīng)多次取樣測定所得各個結(jié)果之間的接近程度[16]。取β-煙酰胺單核苷酸對照品溶液按照供試品溶液的制備和檢測方法進(jìn)行5 次檢測，考察色譜峰保留時間的一致性，記錄出峰時間和峰面積，將同1份β-煙酰胺單核苷酸（NMN）對照品，按照配制方法溶解后，分別在0、2、4、6、8 h不同的時間點(diǎn)進(jìn)行檢測，以主要峰面積計(jì)算，考察樣品的穩(wěn)定性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用BECKMAN 高效毛細(xì)管電泳儀自帶的32Karat 8.0 軟件處理圖譜，采用Excel 軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效毛細(xì)管電泳分離條件的確定

為了獲得分離度比較好的峰型，分別對不同的緩沖液進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，在pH≤7.0 時樣品各成分的電流淌度差別不大，無法分離樣品組分。當(dāng)緩沖液pH增加時，樣品中各成分電流淌度的差別開始明顯，分離效果增加。在pH 9.0～9.5時，緩沖液分離能力較強(qiáng)，分離效果相對較好。經(jīng)過不同條件的優(yōu)化得出最佳分離條件為：電泳緩沖液為30 mmol·L-1硼砂和10 mmol·L-1磷酸二氫鈉，pH為9.2，電泳溫度為25 ℃，進(jìn)樣時間為5 s，進(jìn)樣壓力為0.5 psi，電壓為25 kV，紫外檢測波長218 nm。

2.2 方法特異性檢測結(jié)果

由HPCE 結(jié)果看出，β-煙酰胺單核苷酸的對照品在8.08 min 時有特征峰出現(xiàn)，峰性穩(wěn)定良好，無肩峰和拖尾峰。金針菇提取液也在相同時間有特征峰，且加入對照品的金針菇提取液的圖譜中相應(yīng)β-煙酰胺單核苷酸的位置峰高和峰面積變大，表明在金針菇提取液中含有β-煙酰胺單核苷酸，且該方法可以用于定性和定量分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立結(jié)果

在最佳毛細(xì)管電泳分離條件下，以β-煙酰胺單核苷酸對照品質(zhì)量濃度x（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，β-煙酰胺單核苷酸峰面積y為縱坐標(biāo)得線性回歸方程：y=2E+6x-345.69，R2=0.999 4，表明該曲線的線性關(guān)系良好。由圖2 可知不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性較高；圖3 表明β-煙酰胺單核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積和質(zhì)量濃度的線性關(guān)系較好。將樣品峰的峰面積帶入方程，得β-煙酰胺單核苷酸的含量為27.57 μg·mL-1。

圖1 內(nèi)標(biāo)法測定β-煙酰胺單核苷酸的試驗(yàn)結(jié)果圖譜Fig. 1 Chromatogram of the determination of β-nicotinamide mononucleotide by internal standard method

圖2 不同濃度的β-煙酰胺單核苷酸的電泳圖譜Fig. 2 Capillary electrophoresis of β-nicotinamide mononucleotide at different concentrations

圖3 β-煙酰胺單核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Standard curve of β-nicotinamide mononucleotide

2.4 靈敏度測定結(jié)果

選擇線性最小質(zhì)量濃度10 μg·mL-1的樣品進(jìn)樣，進(jìn)樣后主峰峰高是20 mV，定量限質(zhì)量濃度為濃度/峰高，也就是0.5 μg·mL-1。用標(biāo)準(zhǔn)品添加到樣品中的方式來考察靈敏度。檢測限質(zhì)量濃度為定量限除以3，測得β-煙酰胺單核苷酸在金針菇提取液中的檢測限LOD為0.17 μg·mL-1。

2.5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

在金針菇提取物測得的β-煙酰胺單核苷酸濃度基礎(chǔ)上添加低、中、高質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在最佳電泳條件下進(jìn)樣，將測得的峰面積帶入到標(biāo)準(zhǔn)方程中，得出的含量再除以理論含量，得到回收率。結(jié)果（表1）表明β-煙酰胺單核苷酸平均回收率在89%～94%之間，表明該方法適用于金針菇中β-煙酰胺單核苷酸的測定。

表1 金針菇樣品中添加β-煙酰胺單核苷酸的回收率Table 1 Recovery of the samples added β-nicotinamide mononucleotide

2.6 進(jìn)樣精密度和穩(wěn)定性考察結(jié)果

取β-煙酰胺單核苷酸對照品溶液按照供試品溶液的制備和檢測方法進(jìn)行5 次檢測，考察色譜峰保留時間的一致性，記錄出峰時間和峰面積，計(jì)算β-煙酰胺單核苷酸出峰時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation,RSD）為0.68%；峰面積的RSD 為1.44%，表明該方法的精密度良好。分別在0、2、4、6、8 h不同的時間點(diǎn)進(jìn)行檢測，以主要峰面積計(jì)算，考察樣品的穩(wěn)定性。β-煙酰胺單核苷酸位置的出峰時間RSD 為1.26%；峰面積 RSD為2.82%（圖4），表明樣品在8 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖4 不同放置時間的β-煙酰胺單核苷酸毛細(xì)管電泳圖譜Fig. 4 Capillary electrophoresis of β-nicotinamide mononucleotide at different times

3 討論

β-煙酰胺單核苷酸承擔(dān)著人體細(xì)胞能量生成的重要任務(wù)，參與細(xì)胞內(nèi)煙酰胺嘌呤二核苷酸的合成，并且對衰老相關(guān)的疾病有一定的防治作用[17]。β-煙酰胺單核苷酸存在于多種生物體內(nèi)，李東芹[18]在西蘭花、卷心菜和牛油果中檢測到了煙酰胺單核苷酸；劉小芳等[19]利用液質(zhì)聯(lián)用測定方法，發(fā)現(xiàn)番茄、香菇、黃豆、鱷梨、對蝦、南極磷蝦為β-煙酰胺單核苷酸天然食物來源。孟辰笑凝等[20]以對苯二酚為內(nèi)標(biāo)建立了β-煙酰胺單核苷酸核磁共振氫譜測定法。目前測定單核苷類化合物通常用高效液相的方法[21]，HPLC 是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ),引入GC 的理論與試驗(yàn)方法發(fā)展而成的分離分析方法。但是如果樣品純度不夠，容易造成色譜柱中毒是高效液相色譜法測定有效成分的缺點(diǎn)。液相色譜需要的上樣量比較大，且樣品處理比較復(fù)雜，若樣品的粘稠度過高易堵塞色譜柱。而有的食用菌野生資源的采集樣本量比較少，經(jīng)常達(dá)不到液相色譜的上樣條件，這樣對食用菌品種中有效成分的測定就不全面。毛細(xì)管電泳的分離和富集模式多，已成為發(fā)展迅速的色譜技術(shù)之一[22]。所有液相色譜的分離模式，包括正相、反相、離子交換、親和、篩分等都可以在毛細(xì)管電泳中找到相應(yīng)的模式[23]。本文提供的金針菇中β-煙酰胺單核苷酸含量的毛細(xì)管電泳測定方法可以避免這種現(xiàn)象。毛細(xì)管電泳一次進(jìn)樣量是微克級別，一般食用菌都可以達(dá)到，對于一些比較珍貴的樣本可行性更高。本研究對毛細(xì)管電泳中β-煙酰胺單核苷酸物質(zhì)分離需要的不同參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到分離效果較好的方法，除了本文的金針菇內(nèi)相關(guān)物質(zhì)的測定，還可以應(yīng)用于其他的樣品測定。高效毛細(xì)管電泳還具有分離效率高、分析速度快、樣品和試劑用量少等特點(diǎn)，是更為環(huán)保、無害、便捷的檢測方法，可以廣泛地應(yīng)用于各種領(lǐng)域。