基于RPA技術(shù)對轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因產(chǎn)品的快速檢測

胡秀文， 鄧波， 王金斌， 劉華*， 唐雪明， 王宇，曾海娟， 蔣瑋， 李紅

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306； 2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708； 3.上海農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，上海 201106； 4.上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院，上海 200240； 5.蘭州理工大學生命科學與工程學院，蘭州 730050； 6.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106）

2019 年，全世界轉(zhuǎn)基因作物（genetically modified crops，GMC）的種植面積約27 億 hm2，比1996 年增加了約112 倍[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，全球五大種植國的轉(zhuǎn)基因作物應(yīng)用率已經(jīng)接近飽和，如美國（大豆、玉米和油菜的平均應(yīng)用率95%）、巴西（94%）、阿根廷（約100%）、加拿大（90%）和印度（94%）。目前，抗蟲和抗除草劑作物是最重要的2 種轉(zhuǎn)基因作物[3]。其中，轉(zhuǎn)基因抗草甘膦除草劑作物是將CP4-5-烯醇丙酮酸酯-3-磷酸合酶基因（CP4-5-enol acetate-3-phosphate synthase gene，CP4-EPSPS）[4]轉(zhuǎn)入作物基因組中[5-6]，該基因表達的CP4-EPSPS 蛋白表現(xiàn)出對草甘膦較強的耐受性[7]?？钩輨┺D(zhuǎn)基因作物的種植面積約占43%，而具有抗除草劑和其他性狀的復合性狀占比約為45%。轉(zhuǎn)基因作物廣泛種植對環(huán)境的風險引起了公眾的極大關(guān)注，因此，研究轉(zhuǎn)入CP4-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品對于食品安全和預(yù)防生態(tài)潛在風險具有重要意義。全球用于食品、飼料、加工和種植用途的轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體的批準數(shù)目越來越多，其中占比最高的是大豆、玉米、棉花和油菜。由于轉(zhuǎn)基因作物的迅速推廣，一些非法轉(zhuǎn)基因作物逐漸顯現(xiàn)。2020年12月歐盟食品和飼料類快速預(yù)警系統(tǒng)（Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）對華食品通報中指出，非法轉(zhuǎn)基因問題是我國食品出口貿(mào)易的主要問題[8]。盡管許多國家已經(jīng)實施了嚴格的轉(zhuǎn)基因標簽規(guī)定，但未經(jīng)授權(quán)和不受控制的轉(zhuǎn)基因作物種植依然被發(fā)現(xiàn)。因此，對轉(zhuǎn)基因作物的檢測在農(nóng)產(chǎn)品安全監(jiān)管中至關(guān)重要，迫切需要一種快速、靈敏、便攜、低成本和易操作的檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因作物進行檢測。

目前，聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和蛋白質(zhì)測試條是檢測轉(zhuǎn)基因作物最常用的方法[9]?；诘鞍踪|(zhì)水平的檢測方法，如ELISA或膠體金試紙條，獲得轉(zhuǎn)基因抗原的抗體較難，且制備過程耗時又昂貴，故基于蛋白質(zhì)水平的檢測方法適用的轉(zhuǎn)基因作物靶標蛋白有限。PCR技術(shù)是核酸檢測水平上最常用的方法，然而，由于檢測時間長和需要熱循環(huán)儀等限制因素，無法做到現(xiàn)場速測。近年來出現(xiàn)的等溫擴增方法[10-11]，如 環(huán) 介 導 等 溫 擴 增[12]（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、交叉引物擴增[13]（cross-priming amplification，CPA）和 滾 環(huán) 擴 增[14]（rolling circle amplification，RCA），雖已克服熱循環(huán)儀的限制，但多數(shù)仍需要長達1 h才能完成DNA擴增。

自2006 年以來，省時和方便的重組酶聚合酶擴 增（recombinase polymerase amplification，RPA）[15-16]技術(shù)成為廣泛應(yīng)用于病毒檢測的等溫核酸檢測技術(shù)之一，該系統(tǒng)識別度高且速度快，能夠?qū)袠似慰焖贁U增至可檢測水平[17-18]，主要由3種核心酶組成，包括重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-stranded DNA-binding protein，SSB）和鏈狀聚合酶。在反應(yīng)開始時，引物定位于同源序列，進行鏈交換反應(yīng)以形成和啟動DNA 合成，并以指數(shù)擴增模板上的靶標區(qū)域，其擴增產(chǎn)物在10 min 內(nèi)便可達到檢測水平；反應(yīng)結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。與傳統(tǒng)PCR 相比，RPA 因其所需時間短、且實現(xiàn)等溫（37～42 ℃）擴增而廣受歡迎[19]，已廣泛應(yīng)用于病毒或細菌的檢測[20-22]。食品安全問題與民生息息相關(guān)，為有效防控食品安全風險，開展特異、靈敏、快速的食源性致病菌及轉(zhuǎn)基因作物核酸檢測是關(guān)鍵。為實現(xiàn)轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因作物的快速檢測，本研究采用RPA 技術(shù)建立了一種快速、靈敏度高、特異強的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品的檢測方法，該方法利用一對特異性引物，在恒溫條件下，可快速擴增出特異性DNA片段，并對該反應(yīng)體系進行優(yōu)化，選取最佳反應(yīng)溫度。該方法符合轉(zhuǎn)基因作物的快速檢測要求，縮短了擴增時間，為大規(guī)模篩查CP4-EPSPS基因提供了一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以轉(zhuǎn)基因玉米（NK603）、轉(zhuǎn)基因苜蓿（J101）、轉(zhuǎn)基因油菜（GT73）、轉(zhuǎn)基因甜菜（H7-1）、轉(zhuǎn)基因大 豆（MON89788）、轉(zhuǎn) 基 因 棉 花（Mon1445 和Mon88913）和非轉(zhuǎn)基因玉米為試驗材料。其中，轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因苜蓿、轉(zhuǎn)基因油菜和轉(zhuǎn)基因甜菜購買于美國石油化學學會（American Oil Chemists' Society，AOCS）及標準物質(zhì)與測量研究所（Institute of Reference Materialsand Metrology，IRMM）；轉(zhuǎn)基因棉花、大豆和非轉(zhuǎn)基因玉米由農(nóng)業(yè)部作物生態(tài)與環(huán)境安全監(jiān)測中心提供；轉(zhuǎn)基因大豆MON89788 由本實驗室提供。材料列表如表1所示。選取轉(zhuǎn)基因棉花MON88913 作為CP4-EPSPS特異性、靈敏度及條件優(yōu)化的研究對象。

表1 試驗材料Table 1 Experimental materials

1.2 試驗試劑

RPA 引物、ssDNA 和CrRNA 由生物工程有限公司（中國上海）合成；RNase抑制劑購自生物工程有限公司；RPA檢測試劑盒購自TwistDx有限公司；植物基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京)有限公司。

1.3 DNA提取

將轉(zhuǎn)基因材料種子用研磨機粉碎，稱取0.1 g，利用基因組提取試劑盒提取并純化植物基因組DNA，使用NanoDrop 1000 UV/Vis 分光光度計（Thermo Scientific)和1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA樣品的質(zhì)量和濃度，備用。

1.4 RPA引物設(shè)計

依據(jù)RPA引物設(shè)計原則，包括長度30～35個堿基，最好不要超過45 個堿基，以形成最佳的重組酶-引物聚合體；適宜的GC 含量（30%～70%），避免過低或過高；擴增產(chǎn)物大小為80～400 bp（最佳為150～350 bp）。因此，根據(jù)設(shè)計原則采用Primer Premier 5.0 軟件對抗草甘膦基因CP4-EPSPS設(shè)計引物，序列詳見表2。

表2 RPA引物Table 2 RPA primers

1.5 RPA擴增及條件優(yōu)化

為了選擇最佳的反應(yīng)溫度，根據(jù)試劑盒的建議，RPA 反應(yīng)溫度分別設(shè)置為35、36、37、38、39、40、41 和42 ℃。除反應(yīng)溫度外，還對RPA 體系進行優(yōu)化，總反應(yīng)體系分別設(shè)置為50、25、20 和15 μL，具體各成分加入量如表3所示。

表3 RPA體系優(yōu)化Table 3 RPA system optimization

RPA 擴增使用TwistAmp basic 試劑盒（TwistDX，Cambridge，UK)進行。選取轉(zhuǎn)基因棉花MON88913 基因組進行擴增，首先，反應(yīng)物平均分配到每個含有凍干顆粒的反應(yīng)管中，并充分混合；其次，將相應(yīng)的MgOAc 放在試管的蓋子上，將反應(yīng)混合物管倒置10 次以確?；旌狭己煤?，短暫離心后在恒溫擴增儀上進行反應(yīng)；15 min后取出，短暫離心，然后加入50 μL 苯酚-氯仿，充分混勻后以12 000 r·min-1離心10 min，留上清（有RPA 擴增產(chǎn)物）；最后用3%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.6 RPA反應(yīng)的特異性與靈敏性

將擴增產(chǎn)物片段進行克隆，獲得質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度并計算拷貝數(shù)。將獲得的MON88913棉花質(zhì)粒進行連續(xù)稀釋，稀釋濃度至每微升為10～100個拷貝（108～100），以10倍稀釋梯度進行靈敏度檢測試驗。

2 結(jié)果分析

2.1 RPA引物篩選

由圖1 可知，RPA 獲得了長度為140～204 bp的特異性條帶，5 對引物均能成功擴增得到目標條帶，而陰性對照無可見條帶。引物RPA-CP4-3、RPA-CP4-4和RPA-CP4-5出現(xiàn)擴增條帶，其中引物RPA-CP4-4的擴增效果最優(yōu)。因此引物RPACP4-4的特異性強，擴增產(chǎn)物片段為167 bp，適合于RPA擴增。

圖1 RPA-CP4-1～RPA-CP4-5的擴增產(chǎn)物Fig. 1 Amplification products of RPA-CP4-1～RPA-CP4-5

2.2 RPA體系優(yōu)化

為降低試驗成本，對RPA 反應(yīng)體系進行優(yōu)化，結(jié)果（圖2）表明，隨著整個反應(yīng)體系不斷縮小，反應(yīng)穩(wěn)定性逐漸降低。當反應(yīng)體系為50、25和20 μL，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果間無顯著差異；當反應(yīng)體系為15 μL時，條帶模糊。因此，20 μL的RPA 反應(yīng)體系為最佳反應(yīng)體系，在保證體系擴增穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，降低了每份樣品的檢測成本，可用于后續(xù)試驗。

圖2 不同體積反應(yīng)體系的擴增產(chǎn)物Fig. 2 Amplification products of different reaction system

溫度對RPA 起著關(guān)鍵的作用。由圖3 可知，隨著溫度的增加（36～39 ℃），條帶逐漸變亮且更加清晰；當溫度達到40 ℃后，隨著溫度的增加條帶又開始變淡，且出現(xiàn)雜帶。由此表明，RPA 對溫度要求較低，35～41 ℃范圍內(nèi)均有擴增條帶，且特異性較強；當溫度為37 ℃時，條帶較清晰且無雜帶，為最佳反應(yīng)溫度，可用于后續(xù)試驗。

圖3 不同反應(yīng)溫度的擴增產(chǎn)物Fig. 3 Amplification products of different reaction temperatures

2.3 RPA特異性檢測

為評估引物的特異性，將引物RPA-CP4-4用于檢測多種轉(zhuǎn)基因作物，包括含有Cry基因的轉(zhuǎn)基因玉米BT-11、轉(zhuǎn)基因水稻克螟稻（KMD），含有PAT基因的轉(zhuǎn)基因玉米59112、MON863、轉(zhuǎn)基因油菜RF1 及非轉(zhuǎn)基因大豆、玉米等。在37 ℃反應(yīng)15 min，結(jié)果（圖4）表明，僅含有CP4-EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因棉花MON88913 為陽性，其余不含CP4-EPSPS基因的材料均為陰性。此外，將上述轉(zhuǎn)基因作物進行混樣（同等質(zhì)量1∶1∶1進行混合）后提取DNA 進行檢測，結(jié)果為陽性。由此可見，引物RPA-CP4-4具有較好的特異性，且條帶單一，適宜用于轉(zhuǎn)CP4-EPSPS基因作物的檢測。

圖4 RPA特異性檢測Fig. 4 RPA specificity detection

2.4 RPA靈敏度檢測

靈敏度檢測結(jié)果如圖5 所示，從4.5×107～4.5×105，其擴增條帶均清晰、單一，且亮度基本一致；從104開始逐級遞減，條帶逐漸變暗；100時未觀察到條帶。由此可見，RPA 表現(xiàn)出較高的靈敏性，最低檢出限為45 拷貝，和熒光定量PCR 的檢出限一致。

圖5 RPA靈敏度檢測Fig. 5 RPA sensitivity detection

2.5 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其制品檢測

為了驗證RPA 擴增體系在實際樣品檢測中的穩(wěn)定性，對含有CP4-EPSPS的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物進行檢測，選取10份含有CP4-EPSPS的不同種類的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，包括苜蓿、大豆、玉米、棉花、甜菜等，用優(yōu)化后的重組酶聚合酶擴增技術(shù)法進行檢測，結(jié)果（圖6）表明，所有樣品均能擴增出目的片段，且條帶清晰，說明該反應(yīng)具有良好的穩(wěn)定性。

圖6 轉(zhuǎn)基因制品檢測Fig. 6 Detection of genetically modified products

3 討論

近年來，越來越多的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，因此，各種檢測方法也應(yīng)運而生（表4）。多數(shù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法基于PCR 等試驗技術(shù)，如PCR、實時PCR 或數(shù)字PCR 等，這些技術(shù)需要特殊的試驗條件；而基于蛋白質(zhì)分析的酶聯(lián)免疫反應(yīng)、免疫傳感器等需要較長的時間。與上述方法相比，RPA 具有步驟簡單、操作方便、結(jié)果直觀等優(yōu)點，且不需要昂貴的儀器和復雜的預(yù)處理程序。此外，該方法特異性和靈敏度高、穩(wěn)定性好，有利于轉(zhuǎn)基因作物的檢測。RPA 的低溫操作（近體溫）及其較小的樣品制備要求，使得該體系可檢測各種生物樣品，例如血清、糞便、尿液、牛奶、鼻腔、陰道、血漿、食品、植物和動物組織等。

表4 核酸檢測方法比較Table 4 Comparison of nucleic acid detection methods

本研究將RPA 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因生物的快速檢測，該方法不僅提高了檢測效率（15 min內(nèi)完成），對CP4-EPSPS的檢出限為45個拷貝，具有較高的特異性、準確性和靈敏度。采用LAMP 進行核酸檢測時，擴增溫度需65 ℃[28]，而RPA 只需室溫左右即可進行反應(yīng)，因此更適合用來快速篩選。此外在RPA 檢測過程中，其引物對于該反應(yīng)系統(tǒng)至關(guān)重要，本研究發(fā)現(xiàn)擴增片段越大，越不易出現(xiàn)DNA 污染現(xiàn)象；且引物設(shè)計時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生二聚體。近年來，CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）系統(tǒng)展示了其強大的分子檢測潛在能力，未來將RPA 技術(shù)與其結(jié)合可能會成為新的檢測平臺，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展保駕護航。