CD163基因敲除大白豬的抗藍耳病性能和主要生產性能研究

張 健，吳珍芳，楊化強

(嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室云浮分中心/廣東中芯種業(yè)科技有限公司,廣東 云浮 527400)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗稱“豬藍耳病”，是導致養(yǎng)豬業(yè)重大損失的主要疾病之一；其防控較為困難與該病病原豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的遺傳多樣性有關。PRRSV是約15 kb的單鏈RNA病毒，有2種特征明確的基因型：Ⅰ型，又稱為歐洲型(EU型)；Ⅱ型，也稱為北美型(NA型)。我國流行的PRRSV毒株絕大部分為NA型。2006年中國第1次爆發(fā)高致病性豬藍耳病疫情，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失[1-2]。2013年，中國首次發(fā)現(xiàn)新的重組PRRSV毒株，稱為類NADC30(NADC30-like)，該毒株引起的呼吸道癥狀不明顯，死亡率低，但卻會對母豬繁殖性能造成嚴重影響，母豬流產率高達30%[3-4]。近幾年流行病學調查表明NADC30-like毒株已成為優(yōu)勢流行毒株，特別是在華南地區(qū)呈擴散態(tài)勢，對養(yǎng)豬業(yè)構成了重大挑戰(zhàn)[5]。過去，疫苗接種一直是預防PRRSV感染的主要策略。針對PRRSV的多種改良活疫苗和滅活疫苗已經(jīng)開發(fā)出來，然而由于PPRSV的高度重組和變異，這些疫苗未能提供可持續(xù)的保護[6-8]，豬場藍耳病仍時有出現(xiàn)，因此急需一種行之有效的方法來抵抗PRRSV在豬場的傳播。

利用CR ISPR/Cas9基因編輯技術敲除PRRSV關鍵宿主因子是一個很有前景的方法。想要通過基因編輯技術制備出能夠抵抗某一種病毒的豬，重要的前提條件是，需要知道該病毒與宿主互作的關鍵受體基因。目前只有為數(shù)不多的幾種病毒受體得到了鑒定[9-11]，CD163基因是目前最廣為認知的病毒受體，Whitworth等[12]在2015年證實CD163基因敲除(CD163 gene knockout，CD163-KO)大白豬表現(xiàn)出顯著的PRRSV耐藥性，并且CD163基因修飾豬沒有出現(xiàn)病毒血癥和臨床癥狀。2018年，華南農業(yè)大學吳珍芳教授課題組利用類似試驗驗證了CD163-KO杜洛克豬可以完全抵抗高致病性PRRSV的感染[13]。近年來國內外大量研究也證明CD163是PRRSV感染宿主細胞必不可少的蛋白分子，敲除CD163基因可使豬抵抗PRRSV的感染[14-20]。

本研究是在團隊前期研究的基礎上，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術和體細胞核移植的方法，成功獲得CD163-KO大白豬。接種國內目前流行的NADC30-like毒株進行攻毒試驗，通過臨床觀察、免疫熒光試驗、檢測血清中抗體滴度和病毒RNA水平等方法，證明了所獲得的CD163-KO大白豬能夠完全抵抗NADC30-like毒株的感染；同時，為了評估基因修飾對種豬生產和繁殖性能的影響，我們對CD163-KO大白豬的生長速度、繁殖性能、肉料比等生產性能進行了分析，評估其生產性能和育種價值，為其可能的產業(yè)化應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大白豬胎兒成纖維細胞由華南農業(yè)大學吳珍芳教授課題組分離培養(yǎng)并保存，代孕母豬由廣東中芯種業(yè)科技有限公司提供。豬藍耳病NADC30-like毒株為溫氏食品集團股份有限公司研究院豬病研究室惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬CD 163基因gRNA設計及靶向質粒pX330-CD163的構建 針對豬CD163基因外顯子7 (Exon 7)設計gRNA：選擇GGTCGTGTTGAAGTAC AACA為打靶位點，TGG為引導識別位點(圖1)。表達gRNA的DNA序列在兩端帶上的酶切位點為Bbs I，生物合成gRNA互補雙鏈?正義鏈：5′-CACCGGTCGTGTTGAAGTACAACA-3′，反義鏈：5′-AAACTGTTGTACTTCAACACGACC-3′，退火后連接到載體pX330-U6-Chimeric_BB-CBhhSpCas9(簡稱PX330，Addgene，貨號42230)，構成靶向質粒pX330-CD163。

圖1 豬CD163基因示意圖和CD163-gRNA序列Fig.1 Genetic map of pig CD163 gene and sequence of CD163-gRNA

1.2.2 陽性單克隆細胞的篩選與體細胞核移植

復蘇大白豬胎兒成纖維細胞，用含15%(φ)胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于38℃、5%(φ)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞長至80%匯合度時消化備用，按照Lonza原代成纖維細胞轉染試劑盒說明書將10μg靶向質粒pX 330-CD163轉染至1×106個豬胎兒成纖維細胞中，使用A-033程序進行瞬時轉染后，將細胞按照每cm210個細胞的密度接種到直徑10 cm的培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng)10 d，中途換液1次。10 d后挑取單克隆至48孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，48孔長滿后取少許細胞直接裂解并進行PCR檢測，篩選CD163陽性細胞，剩余細胞轉移至24孔板繼續(xù)培養(yǎng)。PCR引物為CD163-F：GAATTGTCT CCAGGGAAGGA，CD163-R：AGCCCAGATCTGTCC ACTTC；產物長度：380 bp。陽性細胞長滿后即可作為供體細胞進行體細胞核移植操作，每頭受體母豬移植200～250個操作胚胎。

1.2.3 CD163-KO大白豬鑒定新生克隆豬采耳組織再進行PCR測序鑒定。死亡仔豬采肺臟、脾臟、淋巴結、骨髓組織，提取總蛋白，進行CD163蛋白的Western blot檢測，一抗選用anti-CD163抗體(兔多克隆抗體，ab87099)，100倍稀釋，二抗選用HRP羊抗兔IgG(博士德，BA1054)，內參一抗選用GAPDH小鼠單抗(上海康成，KC-5G4)，二抗用HRP羊抗小鼠IgG(博士德，BA1050)。另取一頭瘦弱仔豬，在實驗室取肺沖出肺泡巨噬細胞，用鼠抗豬CD163 RPE(伯樂，MCA 2311PE)免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察到CD163-KO大白豬無CD163蛋白表達。

1.2.4 CD163-KO大白豬攻毒試驗取30日齡的11頭CD 163-KO大白豬和5頭野生型大白豬(對照)，用NADC30-like毒株進行攻毒，毒價為1×107TCID50/m L，采用滴鼻1m L和肌注1m L的攻毒方式，攻毒當天測量溫度，采集血清，連續(xù)14 d記錄體溫，攻毒后第3、7、10和14天采集血清，檢測血清中PRRSV含量和抗體水平。14 d后殺豬取肺臟組織進行免疫熒光檢測。

1.2.5 CD163-KO大白豬單核細胞誘導分化的巨噬細胞對血紅蛋白?結合珠蛋白復合物的攝取試驗分別取CD163-KO大白豬與野生型大白豬抗凝外周血10m L，根據(jù)TBD動物外周血單核細胞分離液試劑盒方法分離外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將分離到的細胞沉淀用含20%(φ)胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸，調整細胞密度為5×106～10×106/m L，以每孔2m L加入6孔板培養(yǎng)2 h，待PBMC貼壁，用37℃培養(yǎng)基輕輕洗滌3遍，去除懸浮細胞。換上含10%(φ)胎牛血清和hM-CSF(巨噬細胞集落刺激因子，20 ng/m L)的1640誘導分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d，中間換液1次，誘導成巨噬細胞。

按照FITC蛋白偶聯(lián)試劑盒(生工，貨號：D601049)標記血紅蛋白，再將血紅蛋白?FITC與結合珠蛋白按照1∶1的質量比混合，形成FITC熒光標記的血紅蛋白?結合珠蛋白復合物，將復合物按照終質量濃度10 μg/m L加入到誘導分化的巨噬細胞培養(yǎng)液中，37℃條件下避光孵育30min，PBS溶液洗2遍后拍照，觀察細胞熒光情況。

1.2.6 CD163-KO大白豬生產性能和公豬的繁殖性能測定統(tǒng)計CD163-KO大白豬和野生型大白豬的出生質量、終測數(shù)據(jù)及公豬的精液質量等指標，分析CD163基因敲除是否影響大白豬的生產性能和公豬的繁殖性能。

2 結果與分析

2.1 CD163-KO大白豬的克隆與鑒定

篩選得到3個陽性單克隆細胞，移植5頭受體母豬，共分娩18頭克隆仔豬，采集耳組織提取基因組DNA，經(jīng)PCR和測序鑒定，18頭克隆仔豬的CD163基因都是插入1個A堿基(表1)。采集CD163-KO克隆豬肺臟、脾臟、淋巴結和骨髓，Western blot檢測結果表明成功獲得CD163-KO大白豬(圖2)，CD163-KO大白豬的肺泡巨噬細胞CD163免疫熒光結果也證實CD163蛋白完全缺失(圖3)。

圖2 野生型和CD163-KO大白豬取樣組織中CD163蛋白表達Fig.2 CD163 protein expression in sampling tissues of wild type and CD163-KO Large White pigs

圖3 野生型和CD 163-KO大白豬肺泡巨噬細胞表面CD163免疫熒光檢測Fig.3 Immunofluorescence detection of CD163 on the surface of pulmonary alveolar macrophages in wild type and CD163-KO Large White pigs

表1 陽性單克隆細胞及CD163-KO大白豬測序結果Table 1 Sequencing results of positive monoclonal cells and CD163-KO Large White pigs

2.2 CD163-KO大白豬攻毒試驗

野生型大白豬于攻毒后第3天開始發(fā)熱，直到第14天體溫維持在40℃左右，沒有出現(xiàn)明顯的呼吸道癥狀，沒有死亡；CD163-KO大白豬沒有任何臨床癥狀，體溫正常(圖4A)。檢測攻毒CD 163-KO豬第0、3、7、10和14天血清中PRRSV病毒和抗體含量，發(fā)現(xiàn)5頭野生型大白豬病毒核酸水平快速增長，第3天病毒核酸含量達到81g RNA拷貝數(shù)/m L，而11頭CD163-KO大白豬在此期間血清中病毒含量一直為0(圖4B)。野生型大白豬的抗體水平在第10和14天時，滴度明顯提高，而11頭CD163-KO大白豬抗體一直是陰性(圖4C)。豬肺臟組織免疫熒光結果顯示，野生型大白豬肺臟巨噬細胞表面存在大量的PRRSV，而CD163-KO大白豬完全沒有該病毒存在(圖5)。

圖4 野生型和CD163-KO大白豬攻毒后直腸溫度、血清中PRRSV含量和抗體水平Fig.4 Rectal pemperature,PRRSV load and antibody level in serum of wild type and CD163-KO Large White pigs post infection

圖5 野生型和CD163-KO大白豬攻毒后第14天肺臟PRRSV免疫熒光結果Fig.5 Immunofluorescence result of PRRSV in lung of wild type and CD163-KO Large White pigs at 14 d post infection

2.3 CD163-KO大白豬巨噬細胞功能分析

野生型和CD163-KO大白豬得到相同結果，體外分離得到的單核細胞利用hM-CSF體外誘導得到的巨噬細胞能夠正常攝取血紅蛋白?結合珠蛋白復合物(圖6)，并不影響其正常的生理功能。

圖6 野生型和CD163-KO大白豬巨噬細胞對血紅蛋白?結合珠蛋白復合物的攝取能力Fig.6 Up take capacity of macrophages from wild type and CD163-KO Large White pigs to hemoglobinhaptoglobin complex

2.4 CD163-KO大白豬生產和繁殖性能測定

取10頭品系相同、年齡和體質量相近的野生型大白豬為陰性對照，對5頭F0代CD163-KO公豬的出生體質量、體長、體高、115 kg背膘厚和115 kg眼肌面積、30～115 kg測定期平均日增體質量和飼料轉化率進行測定，結果如表2所示。F0代基因敲除豬的出生體質量、體高、體長、115 kg肌內脂肪、115 kg背膘厚、115 kg眼肌面積、平均日增體質量和飼料轉化效率等指標與野生型對照沒有明顯差異。

表2 野生型(n=10)和CD16-KO(n=5)大白豬生產性能比較1)Table 2 Comparison of the productive performance of wild type and CD163-KO Large White pigs

取10份F0代CD 163-KO大白豬的精液樣本、20份一級野生型大白豬的精液，進行精液質量分析，統(tǒng)計結果如表3顯示。CD163-KO大白豬采精量，精液1∶1稀釋后精子活力、密度與野生型大白豬無明顯差異，其中畸形率略低于野生型大白豬。

表3 野生型(n=20)與CD163-KO(n=10)大白豬精液質量比較1)Table 3 Comparison of the quality of the semen from wild type and CD163-KO Large White pigs

3 討論與結論

大量研究表明，PRRSV進入細胞是由多種細胞受體介導的，如唾液粘附素(Sn/CD169)、CD151、硫酸肝素、CD163[21-23]。其中，目前已經(jīng)證明CD163是PRRSV感染過程中的關鍵受體。CD163被稱為清道夫受體，是一種I型跨膜糖蛋白，在單核細胞/巨噬細胞系(如肺泡巨噬細胞)和非洲綠猴胚胎腎細胞(MAC145)表面表達。CD163由富含半胱氨酸的9個清道夫受體結構域(SRCR1～9)組成，其中SRCR2被證明支持紅細胞的黏附，促進紅細胞成熟，SRCR 3可以清除血漿中的游離血紅蛋白，SRCR5對PRRSV進入靶細胞至關重要[24-25]。本研究通過設計靶向CD163基因的SRCR5區(qū)域(對應外顯子7)的gRNA，通過單克隆篩選只有1個A堿基插入的突變型作為供體細胞移植，獲得18頭CD163-KO克隆豬，克隆效率處于較高水平，在方法學上也為制備CD163-KO大白豬提供了一定的參考。

本研究證實了利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得的CD163-KO大白豬對當前本地區(qū)流行的藍耳病NADC30-like毒株具有完全抗性，并且不損傷豬的主要生產性能。CD163基因缺失并沒有影響豬正常生理功能，體外單核細胞誘導分化的巨噬細胞能夠保持吞噬細胞外血紅蛋白的功能[24,26]，但是CD163基因敲除是否會影響CD163的其他一些功能還需要更多研究進行驗證。下一步工作需要盡可能詳盡地追蹤CD163-KO大白豬的生長性能和繁殖性能，擴大群體規(guī)模，為后期應用提供更多數(shù)據(jù)支撐。

本研究敲除CD163基因沒有改變豬的生產性能等指標。CD163-KO大白豬與自然分娩的野生型大白豬在出生體質量和料肉比等性狀上無明顯差異，這一結果和多數(shù)研究結果相似。研究報道，克隆豬的出生、3周齡和斷奶體質量以及30～110 kg平均日增體質量、料肉比、背膘厚等性狀與對照豬均無明顯差異[27-29]。

對于豬常見的其他傳染性疾病，目前還沒發(fā)現(xiàn)很有效的受體基因。一方面是因為病毒侵襲宿主基因組很可能是多個基因協(xié)同作用的結果，這導致僅修飾單個基因很難達到抵抗病毒入侵的目的；其次，目前的分子試驗技術很難一次性精準找到與病毒相互作用的關鍵基因，而會識別出大量的候選基因，導致后期驗證工作量異常艱巨，進展緩慢。2020年，華中農業(yè)大學趙書紅教授團隊首次利用豬全基因組CRISPR敲除文庫，對抗乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)基因進行了篩選，篩選到幾個顯著影響JEV病毒在細胞內復制的關鍵基因[29]，然而這些基因并不是JEV病毒進入細胞的膜受體，所以并不能阻止病毒進入細胞。此外，即使找到了病毒的關鍵受體基因，也不能簡單地將其敲除?；蚪M的每個編碼基因不僅執(zhí)行特定功能，而且參與多個基因通路，起著不同的作用，如果簡單地敲除，必然會影響宿主某一方面的功能；或者有些基因至關重要，敲除后會導致胚胎致死等情況。這些都決定了病毒受體的尋找和利用難度非常大，還有更多的工作要做。