辣椒炭疽病病原分離鑒定及對殺菌劑敏感性測定

周志成，孫 海，肖仲久，莫維弟，程歡歡，彭麗娟，丁海霞,5

(1貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院,貴州 貴陽 550025；2北京市植物保護站,北京 100011；3遵義師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,貴州 遵義 563002；4貴州大學(xué)煙草學(xué)院,貴州 貴陽 550025；5貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州 貴陽 550006)

辣椒Capsicum annuum是貴州省主要的經(jīng)濟作物之一，2020年，貴州省辣椒種植面積達36萬hm2，全國第一，產(chǎn)值達242億元，約占全國的1/6，全球的1/10[1]。隨著貴州省辣椒種植面積不斷擴大，辣椒真菌性病害的為害也在逐年加劇。辣椒的真菌性病害多達15種，可造成辣椒生產(chǎn)減產(chǎn)20%～50%，其中，由鏈格孢屬Alternaria sp.真菌引起的黑斑病、鐮刀菌屬Fusarium sp.真菌引起的根腐病和炭疽菌屬Colletotrichum sp.真菌引起的炭疽病為害較嚴重[2]。李小霞等[3]調(diào)查了貴州省遵義、湄潭、清鎮(zhèn)、花溪和大方等地辣椒炭疽病的發(fā)病情況，結(jié)果顯示黑色炭疽菌C.nigium、黑點炭疽菌C.capsici和膠孢炭疽菌C. gloeosporioides是引起這些地區(qū)辣椒炭疽病的主要病原菌，明確了75%(w)甲基布拖津WP對C.nigium菌絲生長具有較好的抑制效果。王妮等[4]從貴陽市花溪區(qū)磊莊村辣椒基地分離得到1株辣椒炭疽病病原菌，鑒定為尖孢炭疽菌C.acutatum，且30%(w)吡唑醚菌酯SC與25%(w)咪鮮胺EC對病原菌菌絲生長的抑制效果最好，此外，大豆炭疽菌C.truncatum、菠菜炭疽菌C.spinaciae、博寧炭疽菌C.boninense、斯高威爾炭疽菌C.scovillei等炭疽菌屬真菌也是辣椒炭疽病的致病菌[5-6]。因此，鑒定辣椒炭疽病病原菌種屬并有針對性地進行防治藥劑篩選，對辣椒炭疽病防控具有重要意義。

利用化學(xué)手段防治辣椒炭疽病仍是關(guān)鍵且有效的措施，常用的化學(xué)殺菌劑有味鮮胺、甲基硫菌靈、多菌靈和代森錳鋅等，但長期單一使用某種化學(xué)藥物，不僅使病原菌產(chǎn)生抗藥性，還加劇土壤中農(nóng)藥殘留等問題[7]。不同類型化學(xué)農(nóng)藥交替施用或配合施用，可有效解決上述問題[8]。采用對環(huán)境友好的生物農(nóng)藥，不僅能改善土壤微生物結(jié)構(gòu)，也能提高植株抗病性[9-10]。本研究對貴州省花溪區(qū)辣椒炭疽病菌進行分離鑒定及致病力測定；通過測定12種殺菌劑及其混配藥劑對辣椒炭疽病菌的毒力作用，篩選對該病菌具有抑制作用的化學(xué)藥劑，以期為辣椒炭疽病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

標本均采自貴州省花溪區(qū)辣椒種植基地辣椒炭疽病發(fā)病嚴重地塊，選取帶有典型病癥的病葉或病果，共采集樣品11份，其中，病果5份，病葉6份。供試辣椒品種為‘黨武’。

培養(yǎng)基為水瓊脂培養(yǎng)基(WA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)[11]。

化學(xué)殺菌劑：75%(w)肟菌·戊唑醇WDG購自拜耳作物科學(xué)(中國)有限公司北京分公司；10%(w)苯醚甲環(huán)唑WDG購自先正達南通作物保護有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯SC購自江蘇托球農(nóng)化股份有限公司；227 g/L二氰蒽醌SC購自江西禾益化工股份有限公司、500 g/L丙環(huán)唑ME購自山東省青島格力斯藥業(yè)有限公司；250 g/L溴菌腈EC購自江蘇托球農(nóng)化股份有限公司。

植物源殺菌劑：10 g/L蛇床子素ME購自云南南寶生物科技有限責(zé)任公司；200 g/L異硫氰酸烯丙酯EW購自江蘇騰龍生物藥業(yè)有限公司；200 g/L異硫氰酸烯丙酯SL購自北京亞戈農(nóng)生物藥業(yè)有限公司。

微生物源殺菌劑：3%(w)中生菌素WP購自深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司；10 g/L申嗪霉素SC購自上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司；80 g/L寧南霉素AS購自德強生物股份有限公司。

1.2 病原菌分離與鑒定

1.2.1 病原菌的分離病原菌分離采用單孢分離法[12]，并稍加改動。在體視鏡下用無菌手術(shù)刀將病樣上的分生孢子堆切下，置于無菌水中，用移液槍反復(fù)吸打?qū)⒎稚咦佣逊稚⒒靹?，吸?00μL孢子懸浮液放入WA平板中均勻涂布，室溫下正置培養(yǎng)8～12 h后，在顯微鏡下用無菌手術(shù)刀挑取單個已萌發(fā)的分生孢子，轉(zhuǎn)移至PDA平板上，25℃、黑暗條件培養(yǎng)7 d后觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 病原菌的致病性將純化的菌株接種于PDA平板上，于25℃條件下培養(yǎng)7～14 d，待產(chǎn)孢后，將分生孢子沖洗制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板計算懸浮液孢子數(shù)量，最終將數(shù)量調(diào)整至1.0×106/m L。采用刺傷接種法，參考Than等[13]的方法并稍加改動。健康辣椒果實和葉片用φ為75%乙醇溶液表面消毒30 s，無菌水清洗3次后晾干備用。將表面消毒的果實和葉片置于含有濾紙的保鮮盒(長、寬、高為10 cm×8 cm×5 cm)中。采用無菌接種針刺傷供試植物組織，在刺傷處滴加10μL孢子懸浮液，陰性對照滴加10μL無菌水，每個處理重復(fù)3次。接種好的植物材料置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照周期為12 h光∶12 h暗，濕度(w)為80%，溫度為25 ℃，2 d后觀察并記錄發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌的形態(tài)觀察利用Leica S8APO體式顯微鏡和Olympus BX 53光學(xué)顯微鏡對病原菌進行觀察，并拍照記錄菌落特征和孢子形態(tài)。參照劉方玲[14]的研究方法進行附著胞的觀察，將28℃條件下培養(yǎng)7 d的病原菌用無菌水洗脫配制孢子懸浮液，在顯微鏡10×40倍下每視野觀察孢子約30～50個，選取無菌載玻片，在其中央滴1滴孢子懸浮液，置于28℃條件下保濕培養(yǎng)24～48 h，觀察附著孢的形成。

1.2.4 病原菌分子鑒定根據(jù)真菌DNA提取試劑盒(Biomiga Fungal gDNA Kit)說明書提取病原菌基因組DNA，分別選擇內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacers，ITS)、肌動蛋白基因(Actin gene，ACT)、幾丁質(zhì)合成酶(Chitin synthase 1，CHS-1)和3–磷酸甘油醛脫氫酶(3-Ghosphate-glycerol aldehyde dehydrogenase，GAPDH)基因引物(表1)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物采用10 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，檢測合格后將擴增產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，參照Damm等[18]的研究選取相關(guān)炭疽菌株基因序列(表2)，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件MEGA X執(zhí)行最大簡約法(Maximum likelihood，ML)[19]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究所得的序列提交到 NCBI的GenBank 數(shù)據(jù)庫，并獲取相應(yīng)的序列號(表2)。

表1 本研究所用的引物Table1 Primers used in this study

表2 多基因序列分析所用菌株信息1)Table 2 Species used for multi-gene phylogeny analysis in this study

1.3 殺菌劑敏感性測定

1.3.1 單劑毒力測定采用菌絲生長速率法[11]進行室內(nèi)藥劑篩選。將各供試藥劑用無菌水配制成母液，母液濃度為終濃度的10倍，然后以體積比1∶9分別加至冷卻至45℃的PDA 培養(yǎng)基中，充分搖勻后制成含藥平板，終質(zhì)量濃度見表3。用打孔器在供試菌株菌落邊緣處打取0.5 cm菌餅，用接種針挑取菌餅接種在PDA平板的中央，以無菌水作對照，每個濃度3次重復(fù)，25℃條件下培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法量取菌落直徑(D)，計算抑制率。

表3 供試殺菌劑及有效成分質(zhì)量濃度Table3 Fungicides and the contentrations of active ingredients used in this study

1.3.2 混劑毒力測定根據(jù)單劑毒力測定結(jié)果，選擇作用機制不同且抑制效果較好的2種殺菌劑以不同的體積比(4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4)進行復(fù)配，每個體積比設(shè)置5個濃度梯度，每個梯度設(shè)置3次重復(fù)，計算EC50，采用黃清臻等[20]的方法計算共毒系數(shù)(Co-toxicity coefficient)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel和DPS軟件進行數(shù)據(jù)整理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測定

通過對采集的典型炭疽病發(fā)病葉片和果實進行單孢分離，從11份培養(yǎng)物中共分離得到8株具有致病力的菌株，分離率為72.7%，其中，菌株HGUPLJ169致病力最強。菌株HGUPLJ169致病性測定結(jié)果如圖1所示，有傷接種的辣椒葉片在3 d后開始表現(xiàn)出病害癥狀，發(fā)病中心呈灰白色至深棕色，病斑邊緣呈現(xiàn)黃色，對照葉片無發(fā)病癥狀(圖1A、1B)。有傷接種的辣椒果實在5 d后開始表現(xiàn)病害癥狀，發(fā)病中心灰白色至深褐色，病斑凹陷，呈長橢圓形，邊緣呈黑色，對照果實無發(fā)病癥狀(圖1C、1D)。發(fā)病葉片和果實癥狀與原病害樣本癥狀一致，對接種發(fā)病葉片和果實進行病原菌的再分離，經(jīng)鑒定與原接種菌種相同，符合科赫氏法則，以上結(jié)果證明菌株HGUPLJ169為‘黨武’辣椒炭疽病的致病菌。

圖1 菌株HGUP LJ169致病性測定Fig.1 Pathogenicity test of HGUP LJ169

2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

如圖2所示，菌株HGUP LJ169在PDA培養(yǎng)基上于28 ℃條件下培養(yǎng)7 d后菌落直徑達8.0～9.0 cm。菌落圓形，邊緣整齊，菌絲致密、羊絨狀，白色至淺灰色，菌落中心隆起呈灰白色同心輪紋狀生長，菌落背面橘黃色至灰黑色，有時在背面有深色斑點(圖2A、2B)。分生孢子附著胞棕色，卵圓形或圓形，邊緣整齊；大小為：4.1～4.9×6.7～11.4μm，=(4.53±0.49)×(8.73±0.93)，n=30(圖2C～2F)；分生孢子單胞、無色、壁光滑，圓柱狀，兩端鈍圓，有油球，大小為：3.1～8.2×4.6～17.2μm，=(4.16±0.37)×(12.67±1.47)，n=50(圖2G)，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定菌株為Colletotrichum sp.。

圖2 菌株HGUP LJ169的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of HGUP LJ169

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用ITS、ACT、CHS-1、GAPDH等基因序列構(gòu)建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示，在以C.acutatum CBS 129921和C.acutatum CBS 129922菌株為外群的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株HGUP LJ169與C. scovillei CBS 126529以100%的支持率聚集于一支，并與其他種明顯區(qū)分開。與菌株C.scovillei CBS 126529相比，ITS序列相似性達100%，ACT序列相似性達100%，CHS-1序列相似性達99%，GAPDH序列相似性達100%。因此，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征，將菌株HGUPLJ169鑒定為斯高維爾炭疽菌C.scovillei。

圖3 基于ITS、ACT、CHS-1、GAPDH基因序列的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacterial strains based on ITS, GADPH,CHS-1 and ACT gene sequences

2.4 12種殺菌劑的敏感性測定

由表4可見，12種殺菌劑對辣椒炭疽病菌C.scovillei均表現(xiàn)出一定的抑制效果，但對菌絲生長的抑制效果不同，毒力差異較大。所選用的6種化學(xué)藥劑中，75%(w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲環(huán)唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC抑菌效果最好，其EC50分別為0.254、0.731和0.745 mg/L；所選用的6種生物農(nóng)藥中，200 g/L異硫氰酸烯丙酯SL和3%(w)中生菌素WP抑菌效果較好，其EC50分別為1.238和1.307mg/L。

表4 12種殺菌劑對Colletotrichum scovillei的抑制效果Table 4 Inhibitory effects of twelve fungicides against Colletotrichum scovillei

2.5 混配藥劑共毒系數(shù)計算

由表5可見，將250g/L吡唑醚菌酯SC和10%(w)苯醚甲環(huán)唑WDG按照體積比為4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4配比進行混配并測定其共毒系數(shù)及聯(lián)合毒力，結(jié)果表明，配比組合為4∶1、3∶2、1∶1、2∶3和1∶4時，EC50均較小，且明顯小于2種單劑的EC50。5種配比組合的共毒系數(shù)分別為635.953、420.795、125.992、108.012、95.836，說明以這5種配比組合進行混配均對該辣椒炭疽病菌具有較好的抑制作用。配比為4∶1、3∶2和1∶1時其共毒系數(shù)大于120，表現(xiàn)出明顯的增效作用；配比為2∶3和1∶4時其共毒系數(shù)大于80，小于120，表現(xiàn)出相加作用。綜合以上，5種藥劑配比中，250 g/L吡唑醚菌酯SC和10%(w)苯醚甲環(huán)唑WDG體積比為4∶1時為最佳配比。

表5 苯醚甲環(huán)唑WDG和吡唑醚菌酯SC對Colletotrichum scovillei的聯(lián)合毒力作用Table 5 Co-toxicity of the mixed difenoconazole WDG and pyraclostrobin SC to Colletotrichum scovillei

3 結(jié)論與討論

本研究中通過病原菌分離和致病力測定，依據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)，結(jié)合ITS、GADPH、CHS-1和ACT基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對比分析，將菌株HGUPLJ169鑒定為C.scovillei。由C.scovillei引起的辣椒炭疽病在安徽、甘肅、美國南卡羅來納州、日本島根縣、韓國、巴西等地均有發(fā)現(xiàn)，而在貴州鮮見報道[21-25]。C. scovillei侵染后發(fā)病速度快、傳染性強，具有很強的寄主組織?；?，能夠危害芒果、蘋果等，對果實產(chǎn)量和品質(zhì)造成一定的影響[26-27]。結(jié)合本研究，表明貴州省花溪區(qū)辣椒炭疽病可由C.scovillei引起，明確病原菌的分類地位有利于為后續(xù)研究其病害的防治提供依據(jù)。

本研究以菌株HGUPLJ169為靶標病原菌，采用菌絲生長速率法測定了C.scovillei對生產(chǎn)中常用的12種殺菌劑的敏感性。結(jié)果表明，所選用的6種化學(xué)殺菌劑對C.scovillei均表現(xiàn)出一定的抑制效果，其中75%(w)肟菌·戊唑醇WDG、10%(w)苯醚甲環(huán)唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC抑菌效果最好；同時在測定單一化學(xué)殺菌劑室內(nèi)抑制效果的基礎(chǔ)上，選用了2種作用機制不同的化學(xué)殺菌劑，10%(w)苯醚甲環(huán)唑WDG和250 g/L吡唑醚菌酯SC在不同體積配比下對C.scovillei的室內(nèi)抑制作用，2種藥劑的復(fù)配抑制效果較好，其中最佳配比體積比為4∶1，可用于下一步的辣椒炭疽病田間藥劑篩選。所選用的6種生物殺菌劑(3種微生物源殺菌劑和3種植物源殺菌劑)均具有一定的防治潛力，200 g/L異硫氰酸烯丙酯SL和3%(w)中生菌素WP抑菌效果較好；6種生物殺菌劑的抑菌效果均優(yōu)于溴代氰烷烴類殺菌劑(250 g/L溴菌腈EC)、三唑類殺菌劑(500 g/L丙環(huán)唑ME)和醌類殺菌劑(227 g/L二氰蒽醌SC)。研究結(jié)果表明C.scovillei對溴菌腈、丙環(huán)唑和二氰蒽醌的敏感性較低，其原因可能是生產(chǎn)中長期使用這3種藥劑，導(dǎo)致C. scovillei產(chǎn)生了一定抗性。長期或同時使用同種類型殺菌劑可能會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，炭疽菌對甲氧基氨基甲酸酯類殺菌劑和三唑類殺菌劑的自發(fā)突變頻率較高，且存在一定的抗性分化[28-30]。若長時間單一使用某種殺菌劑，可能會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，不同類型殺菌劑交替或配合使用，可延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長藥劑的使用壽命。本研究可為生產(chǎn)中常用防治辣椒炭疽病藥劑的替代藥劑或輪換藥劑的使用提供參考。