石斑魚PPAR-δ基因SNP位點和單倍型與抗虹彩病毒和神經(jīng)壞死病毒抗性的關(guān)聯(lián)

黃健玲，楊子敏，王雨欣，李鑫帥，劉翠瑜，陳錦鵬，秦啟偉，楊敏

(海洋生物資源保護(hù)與利用粵港澳高校聯(lián)合實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,廣東 廣州 510642)

石斑魚Epinephelus spp.是亞洲許多國家最重要的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，其繁殖速度較快，肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)價值高，具有相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)價值。近年來，隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，細(xì)菌性和病毒性傳染病暴發(fā)的頻率急劇增加，對石斑魚養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的危害。目前已報道的感染石斑魚的致病性病毒主要是虹彩病毒和神經(jīng)壞死病毒[1]。

新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)隸屬于虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒屬Ranavirus，是從養(yǎng)殖石斑魚體分離得到的一種高致病性病原，由SGIV引起的疾病暴發(fā)多發(fā)生在仔魚和成年石斑魚中，患病魚脾臟腫大，并伴有出血等癥狀，病癥持續(xù)數(shù)周，患病仔魚死亡率超過90%，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。魚類病毒性神經(jīng)壞死病是由神經(jīng)壞死病毒引起的一類疾病，是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見的魚類流行性傳染病之一，患病魚苗體表異常著色，食欲不振，間歇螺旋運動，腦和視網(wǎng)膜有空泡化病[3-4]。而中國大多數(shù)海洋魚類病毒性神經(jīng)壞死病是由赤點石斑魚神經(jīng)壞死病毒(Redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)引起的，對石斑魚的成魚以及幼魚危害很大，嚴(yán)重時死亡率可達(dá)100%，嚴(yán)重威脅到石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。然而針對該病毒性疾病，目前還沒找到有效的防治方法。

單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)指生物體的基因組DNA序列中單個核苷酸發(fā)生突變而產(chǎn)生的多態(tài)性現(xiàn)象，其突變形式包括位點的轉(zhuǎn)換、顛換、插入及缺失等，一般情況下，等位基因的頻率在同物種的群體中不小于1%[5]。SNP作為一種理想的遺傳標(biāo)記，是基因和表型之間的研究載體，它拉近了分子遺傳標(biāo)記與育種的距離，成為研究疾病、生長和繁殖性能等經(jīng)濟(jì)性狀與相關(guān)候選基因關(guān)聯(lián)性的新工具。隨著SNP檢測技術(shù)的進(jìn)步，其在水產(chǎn)動物中的應(yīng)用也越來越廣泛，在水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物中進(jìn)行特定經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點的挖掘及功能驗證也越來越受到研究者們的重視。在水產(chǎn)動物抗病SNP分子標(biāo)記研究中，高煥等[6]對中國明對蝦Penaeus chinensis抗菌肽SNP位點進(jìn)行了篩查，并對與白斑綜合征病毒抗性的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其SNP位點很少，且在抗感和易感群體中無明顯偏向分布。Bao等[7]在海灣扇貝Argopecten irradians超氧化物歧化酶家族的3個基因的啟動子和基因組DNA序列區(qū)域均檢測到SNP位點，其中3個位于啟動子區(qū)域的SNP位點與鰻弧菌Vibrio anguillarum的抗性顯著相關(guān)。Fu等[8]在尖吻鱸Lates calcarifer的LECT2基因中發(fā)現(xiàn)了3個SNP位點，并發(fā)現(xiàn)其與瘦大肚皮病的抗性之間存在顯著的相關(guān)性。

PPAR-δ(Peroxisome proliferator-activated receptorsδ)是核受體超家族PPARs中的一員，是一類轉(zhuǎn)錄因子，其在多種生理刺激下調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的脂代謝、免疫反應(yīng)等多種生理過程。其中PPARs的免疫調(diào)節(jié)作用的研究得到了越來越多的關(guān)注[9-10]。在不同人體組織中，均發(fā)現(xiàn)PPAR-δ對炎癥反應(yīng)的密切調(diào)控關(guān)系[10]。除了保持穩(wěn)定的炎癥反應(yīng)，PPAR-δ也影響干擾素信號通路，在哺乳動物免疫細(xì)胞中，PPAR-δ抑制干擾素基因以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[9]，而在另外一些免疫細(xì)胞中PPAR-δ則會增強(qiáng)干擾素信號的強(qiáng)度，影響細(xì)胞凋亡[10-12]。前期研究也表明，魚類PPARs在抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[13]。

開展石斑魚抗病品系的選育研究是解決石斑魚病毒性病害的重要途徑之一，開發(fā)抗病相關(guān)分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記定向選育石斑魚抗病品系，可以有效避免選育的盲目性，從而加快選育進(jìn)程。本研究分別針對石斑魚虹彩病毒感染群體和神經(jīng)壞死病毒感染群體進(jìn)行PPAR-δ基因組DNA序列的SNP位點篩選，并對篩選到的SNP位點進(jìn)行抗病毒關(guān)聯(lián)分析，以期獲得與抗病毒性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點或基因型，為石斑魚抗病選育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

斜帶石斑魚E.coioides，體質(zhì)量40～60 g，體長10～14 cm，購自福建省廈門市小嶝島水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，在25～30℃的海水循環(huán)系統(tǒng)中馴化并飼養(yǎng)2周，每天以3%的體質(zhì)量作為喂食量，密切監(jiān)測海水的溶解氧、pH和氨濃度。

攻毒用SGIV和RGNNV分別從發(fā)病石斑魚中分離獲得，后利用實驗室構(gòu)建的石斑魚脾臟細(xì)胞系(Grouper spleen,GS)進(jìn)行病毒的培養(yǎng)與制備，GS細(xì)胞系用含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清(Invitrogen)的Leibovitz’s L15培養(yǎng)基放置于28℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)[14]。利用TCID50法對制備的SGIV和RGNNV進(jìn)行滴度測定。制備后的病毒于?80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 半致死濃度的測定

為了獲得感染石斑魚苗的SGIV和RGNNV的最適濃度，隨機(jī)選取210尾石斑魚苗進(jìn)行濃度梯度腹腔注射感染試驗，2周后統(tǒng)計每組累計死亡率，選取可導(dǎo)致50%～80%石斑魚死亡率的SG IV和RGNNV感染濃度，進(jìn)行抗感與易感群體篩選的正式試驗。

試驗結(jié)果顯示當(dāng)SG IV的滴度為1×1 07TCID50/m L時，其感染魚苗后的死亡率為72%，當(dāng)RGNNV滴度為1×105TCID50/m L時，其感染魚苗后的死亡率為65%，因此選擇上述2個病毒滴度進(jìn)行正式感染試驗。

1.3 石斑魚抗感和易感群體的采集

隨機(jī)選取520尾魚苗進(jìn)行攻毒感染試驗，共分為3組，對照組40條魚腹腔注射100μL PBS溶液，SGIV感染組240尾魚腹腔注射100μL病毒滴度為1×107TCID50/m L的SGIV溶液，RGNNV感染組240尾魚腹腔注射100 μL病毒滴度為1×105TCID50/m L的RGNNV溶液，感染后每隔6 h觀察1次魚苗死亡情況，參考前期研究中評判抗感和易感樣品的標(biāo)準(zhǔn)[15-16]，將感染后5 d內(nèi)死亡的個體作為易感個體，感染后14 d后還存活的個體作為抗感個體，采集易感、抗感個體的尾鰭樣品，于樣品穩(wěn)定劑(TaKaRa)中，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA提取

基因組DNA提取使用Trelief ?Animal Genomic DNA Kit(TsingKe)試劑盒，具體方法步驟參考試劑盒說明書，并用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA提取質(zhì)量。

1.5 石斑魚PPAR-δ基因組DNA序列的克隆與SNP位點篩選

以斜帶石斑魚鰭條DNA為模板，根據(jù)石斑魚基因組中的PPAR-δ基因gDNA序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，由北京擎科生物有限公司合成，以上述易感和抗感個體基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[15]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收以后，克隆至pMD19-T載體，抗感組和易感組各送5個陽性克隆樣品至北京擎科生物有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多重比對，觀察測序結(jié)果峰圖，預(yù)測SNP位點。同一位點不同堿基出現(xiàn)比例大于30%則認(rèn)定為SNP位點。

表1 PPAR-δ基因組DNA序列擴(kuò)增引物Table 1 Primers for PPAR-δ genomic DNA sequence amplification

1.6 SNP的基因分型及與SGIV和RGNNV抗性的關(guān)聯(lián)分析

依據(jù)上述方法預(yù)測的PPAR-δ基因SNP位點，采用SNaPshot法[17]，分別對SGIV感染組和RGNNV感染組的易感樣品和抗感樣品進(jìn)行SNP分型，其中SGIV易感組、SGIV抗感組、RGNNV易感組和RGNNV抗感組的樣品數(shù)目均為50尾。SNaPshot分型由北京擎科生物有限公司完成。

使用Popgen 32和PIC軟件分析SNP位點的觀測雜合度(Observed heterorozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、哈迪?溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)，使用Cervus 3.0軟件計算位點的多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)等。使用Haploview 4.2軟件進(jìn)行各個SNP位點間的連鎖不平衡和單倍型的分析。使用SPSS17軟件中的χ2檢驗對SNP位點在抗病組和易感組群體中的基因型頻率和單倍型頻率進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斑魚PPAR-δ基因結(jié)構(gòu)圖以及篩查的SNP位點信息

根據(jù)石斑魚基因組中的PPAR-δ基因gDNA序列和轉(zhuǎn)錄組中的cDNA序列，以斜帶石斑魚鰭條DNA為模板，使用4對引物(表1)對PPAR-δ基因的內(nèi)含子及外顯子序列進(jìn)行擴(kuò)增，對克隆進(jìn)行測序比對，繪制PPAR-δ基因結(jié)構(gòu)圖(圖1)。以易感組和抗感組各5個基因組DNA樣品作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對測序結(jié)果進(jìn)行多重比對分析。在SGIV感染的易感組和抗感組樣品中共篩查到9個SNP位點，分別將其命名為SNP-S1(g.940T>A)、SNP-S2(g.994C>G)、SNP-S3(g.1644A>C)、SNP-S4(g.2541C>T)、SNP-S5(g.4188A>T)、SNP-S6(g.4479G>A)、SNP-S7(g.4595T>A)、SNP-S8(g.4791T>A)和SNP-S9(g.4852T>A)，所有SNP位點均位于內(nèi)含子中(圖1A)。在RGNNV感染的易感組和抗感組樣品中共篩查到8個SNP位點，分別將其命名為SNP-N 1(g.32 4G>A)、SNP-N 2(g.883A>G)、SNP-N 3(g.1140A>T)、SNP-N 4(g.1702A>T)、SNP-N 5(g.2510C>T)、SNP-N 6(g.5253G>C)、SNP-N 7(g.5522G>A)和SNP-N8(g.5564T>C)，其中SNP-N1位于外顯子中，屬于同義突變，沒有改變編碼的氨基酸，其余SNP均位于內(nèi)含子中(圖1B)。

圖1 石斑魚PPAR-δ基因結(jié)構(gòu)及SNP位點Fig.1 DNA structure of PPAR-δ gene and its SNP loci of grouper

2.2 石斑魚PPAR-δ基因組SNP的遺傳多態(tài)性分析

采用SnaPshot分型法對石斑魚群體進(jìn)行基因分型分析。在SGIV感染組中，100個送樣樣品中共獲得100個有效結(jié)果，其中SGIV抗感組50個，SGIV易感組50個。使用Popgen32和PIC軟件對9個SNP位點在SGIV抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果(表2)顯示：在SGIV抗感組中，PIC的范圍為0.136～0.370，SNP-S1屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP位點屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)；在SGIV易感組中，PIC的范圍為0.177～0.375，其中SNP-S1屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP位點屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)(表2)。χ2檢驗結(jié)果表明，在SGIV抗感組中，除SNP-S4、SNP-S5、SNP-S6、SNP-S7、SNP-S8、SNP-S9不符合Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05)，其余SNP均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)；在SGIV易感組中，除SNP-S9不符合Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05)，其余SNP均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表2 9個SNP在石斑魚SGIV抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性信息Table2 Genetic polymorphisms of nine SNPs in SGIV resistant and susceptible grouper groups

采用SnaPshot分型法對石斑魚群體進(jìn)行基因分型分析。在RGNNV感染組中，100個送樣樣品中共獲得97個有效結(jié)果，其中RGNNV抗感組48個，RGNNV易感組49個。使用Popgen32和PIC軟件對8個SNP位點在抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)顯示：在RGNNV抗感組中，PIC的范圍為0.136～0.358，SNP-N1和SNP-N2屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)；在RGNNV易感組中，PIC的范圍為0.106～0.317，其中SNP-N1和SNPN2屬于低度多態(tài)(PIC<0.25)，其余SNP屬于中度多態(tài)(0.25≤PIC<0.50)。χ2檢驗結(jié)果表明，在RGNNV抗感組中，SNP-N1、SNP-N2和SNP-N4處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)，其余SNP均不符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；在RGNNV易感組中，除SNP-N 3不符合Hardy-Weinberg平衡外(P<0.05)，其余SNP均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。

表3 8個SNP在石斑魚RGNNV抗感組和易感組中的遺傳多態(tài)性信息Table 3 Genetic polymorphisms of eight SNPs in RGNNV resistant and susceptible grouper groups

2.3 石斑魚PPAR-δ基因組SNP的連鎖不平衡分析及與病毒抗性的關(guān)聯(lián)分析

PPAR-δ基因在SG IV抗感組和易感組的SNP統(tǒng)計分析結(jié)果(表4)顯示：SNP-S7基因型頻率在抗感組和易感組中存在顯著差異分布(P<0.05)；SNP-S7的TT基因型在抗感組中分布頻率為60%，易感組中分布頻率為40%，AT基因型在抗感組中分布頻率為24%，易感組中分布頻率為52%，而AA基因型在抗感組中分布頻率為16%，在易感組中分布頻率為8%，表明TT和AA這2種純合子基因型與SGIV抗感性狀相關(guān)，而AT雜合子基因型與SGIV易感性相關(guān)。

表4 石斑魚PPAR-δ基因在2種病毒抗感組和易感組的SNP統(tǒng)計分析Table 4 PPAR-δ gene SNPs analysis in resistant and susceptible grouper groups infected by two viruses

使用Haploview 4.2軟件中的Four Gamete Rule計算方法對9個SNP位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示：SNP-S4、SNP-S5和SNP-S6這3個位點高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TTT、AAA、TAA和TAT共4個單倍型；SNP-S7、SNP-S8和SNP-S9這3個SNP位點高度連鎖，構(gòu)成單倍塊2，可形成CAG、TTA和CAA共3個單倍型(圖2)。將上述單倍型與石斑魚抗虹彩病毒抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示上述單倍型與石斑魚抗虹彩病毒抗性性狀均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)(表5)。

圖2 石斑魚SGIV和RGNNV感染組中篩選出PPAR-δ基因SNP標(biāo)記的連鎖不平衡分析Fig.2 Linkage disequilibrium analysis of PPAR-δSNP markers screened from SGIV and RGNNV infected groupers

PPAR-δ基因在RGNNV抗感組和易感組的SNP統(tǒng)計分析結(jié)果(表4)顯示：SNP-N5基因型頻率在易感組和抗感組中存在顯著差異分布(P<0.05)；SNP-N5的CC基因型在易感組中分布頻率為57.1%，在抗感組中分布頻率為37.5%，表明CC基因型與RGNNV易感性狀相關(guān)；而CT基因型在易感組中分布頻率為38.8%，在抗感組中分布頻率為60.4%，表明CT基因型與RGNNV抗性相關(guān)。

對8個SNP位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果(表5)顯示：SNP-N3、SNP-N4、SNP-N5、SNP-N6、SNP-N7和SNP-N8 這6個SNP位點高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TACGGT、AGTCAC、TGCGGT、TACCAT、AGTCAT、AACGGT和TGTCAT共7個單倍型(圖2)。將上述單倍型與石斑魚抗神經(jīng)壞死病毒抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示7個單倍型與石斑魚抗神經(jīng)壞死病毒抗性性狀均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。

表5 石斑魚PPAR-δ基因SNP連鎖單倍型與2種病毒抗性的關(guān)聯(lián)分析Table5 Association analysis between PPAR-δ SNPs linked haplotype and resistance of two viruses

3 討論與結(jié)論

3.1 PPAR-δ基因的SNP位點分布分析

在本研究中，在石斑魚對SGIV的易感和抗感群體中共篩查到9個SNP位點，全部位于內(nèi)含子區(qū)域，在石斑魚對RGNNV的易感和抗感群體中共篩查到8個SNP位點，除SNP-N 1位于外顯子區(qū)域外，其余均分布在內(nèi)含子區(qū)域，且SNP-N1產(chǎn)生的突變?yōu)橥x突變，對氨基酸編碼并不造成影響。盡管對SNP的研究表明，SNP位點既可能發(fā)生在編碼區(qū)也可能發(fā)生在非編碼區(qū)，但其發(fā)生在非編碼區(qū)的機(jī)率更大，這是由于相較于具有編碼功能的外顯子，內(nèi)含子在進(jìn)化上受到的壓力更小一些，故內(nèi)含子的核苷酸多態(tài)性和變異度會明顯高于外顯子[18]。盡管內(nèi)含子不參與基因的編碼功能，但其在機(jī)體中仍發(fā)揮著重要作用，內(nèi)含子對機(jī)體的mRNA前體起著調(diào)節(jié)其剪接、運輸和降解的作用，此外，近年來的研究還表明內(nèi)含子對基因的表達(dá)也起著重要的調(diào)控作用[19]。因此我們推測，本研究中在PPAR-δ基因內(nèi)含子中發(fā)現(xiàn)的SNP位點，也許與該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)，其不同突變體通過影響PPAR-δ的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來發(fā)揮免疫調(diào)控功能，從而影響宿主的抗病性狀，在我們今后的研究中，會對該機(jī)制進(jìn)一步深入分析。

3.2 SNP位點在不同群體中的多態(tài)性分析

Botstein等[20]對SNP位點進(jìn)行分類時提出，當(dāng)PIC大于0.50時，該位點為高度多態(tài)性位點；PIC大于或等于0.25而小于0.50時為中度多態(tài)性位點；PIC小于0.25時為低度多態(tài)性位點。對本試驗中發(fā)現(xiàn)的SNP位點進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示石斑魚PPAR-δ基因SNP位點在抗感組和易感組中均表現(xiàn)為低度或中度多態(tài)，并未出現(xiàn)高度多態(tài)位點。而在草魚、羅非魚等的免疫基因SNP位點分析中也發(fā)現(xiàn)，中度多態(tài)性位點較多，低度和高度多態(tài)性位點偏少，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于SNP位點為典型的二等位基因表達(dá)，本身多態(tài)性不高[21]，此外，用于篩選抗病性狀的群體會在養(yǎng)殖過程中經(jīng)過自然選擇和人工選擇，淘汰掉抗病能力差的個體，導(dǎo)致群體多樣性下降，因此SNP位點的整體多態(tài)性不高。

Hardy-Weinberg平衡分析表明，在不同感染組群體中均檢測到不符合Hardy-Weinberg平衡的SNP位點，由于本研究中的試驗群體均來自養(yǎng)殖場，而養(yǎng)殖場的親本是經(jīng)過了長期人工選育過程而獲得的，因此群體遺傳多態(tài)性在選育過程中會逐漸降低，從而導(dǎo)致部分SNP偏離Hardy-Weinberg平衡。

3.3 SNP位點與病毒抗性性狀的關(guān)聯(lián)分析

SNP是第3代分子標(biāo)記技術(shù)，其具有分布廣泛、遺傳穩(wěn)定性高，易于分型等特點。近年來，SNP標(biāo)記技術(shù)在水產(chǎn)動物育種中得到廣泛應(yīng)用[22]。在草魚中，采用Snapshot法篩選與草魚呼腸弧病毒(GCRV)抗感/易感性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點，結(jié)果表明在RIG-I(視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I)、TLR3(Toll樣受體3)和補(bǔ)體C6等許多重要免疫基因中均篩選到多個抗病相關(guān)SNP位點和單倍型，可以作為草魚抗出血病品系的構(gòu)建提供技術(shù)手段[23-25]。在羅非魚中，同樣利用Snapshot分型法，在LBP(脂多糖結(jié)合蛋白)、NOD 1(核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域1)和MCP-8(肥大細(xì)胞蛋白酶?8)等基因中篩選出多個與無乳鏈球菌抗性關(guān)聯(lián)的SNP位點和單倍型[26-28]。此外，基于高通量測序，全基因組數(shù)據(jù)庫分析等其他技術(shù)手段也分別在異育銀鯽、牙鲆、虹鱒、鯉魚等重要經(jīng)濟(jì)魚類中分別篩選獲得與鯽皰疹病毒(CaHV)，鰻弧菌、傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)和鯉皰疹病毒(CyHV-3)等病原抗性關(guān)聯(lián)的SNP位點。

在PPARs基因SNP分子標(biāo)記研究方面，目前在人、鼠以及牦牛上已有相關(guān)研究，而在低等脊椎動物上的研究鮮有報道。有研究對黑線倉鼠繁殖相關(guān)基因PPAR-δ部分序列進(jìn)行SNP分析，發(fā)現(xiàn)其外顯子區(qū)域發(fā)生堿基突變的概率較大，與人類研究結(jié)果一致，猜測與其功能有密切關(guān)系[29]。PPARs基因作為調(diào)控牦牛肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)候選基因，分析其基因多態(tài)性，并與生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為牦牛分子育種提供了科學(xué)依據(jù)[30]。

在本試驗中，在SGIV感染組中篩選到9個SNP位點，與抗病性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNPS7基因型頻率在易感組和抗感組中存在顯著差異分布(P<0.05)。該位點的TT和AA 2種純合子基因型與SGIV抗感性狀相關(guān)，而AT雜合子基因型與SGIV易感性相關(guān)。對9個SNP位點進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示：SNP-S4、SNP-S5和SNPS6這3個位點高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TTT、AAA、TAA和TAT共4個單倍型；SNP-S7、SNP-S8和SNP-S9這3個SNP位點高度連鎖，構(gòu)成單倍塊2，可形成CAG、TTA和CAA共3個單倍型。將上述單倍型與石斑魚抗虹彩病毒抗性性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示上述單倍型與石斑魚抗虹彩病毒抗性性狀均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。在RGNNV感染群體中篩選到8個SNP位點，與抗病性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNP-N 5(g.2510C>T)基因型頻率在抗感組和易感組中存在顯著差異分布(P<0.05)，該位點的CC基因型與RGNNV易感性狀相關(guān)，CT基因型則與RGNNV抗性相關(guān)。連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，SNP-N3、SNP-N4、SNPN5、SNP-N6、SNP-N7和SNP-N8這6個SNP位點高度連鎖，構(gòu)成單倍塊1，可形成TACGGT、AGTCAC、TGCGGT、TACCAT、AGTCAT、AACGGT和TGTCAT共7個單倍型。將上述單倍型與石斑魚抗RGNNV性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示7個單倍型與石斑魚抗神經(jīng)壞死病毒抗性性狀均無顯著的相關(guān)性(P>0.05)。上述研究結(jié)果中篩選出來的與抗SGIV和RGNNV關(guān)聯(lián)的SNP位點及其基因型可以作為石斑魚抗病品種選育的候選分子標(biāo)記。

在本試驗中，雖然抗性關(guān)聯(lián)SNP位點與其他位點形成了高度連鎖的單倍塊，但并沒有單倍型與抗病性狀顯著關(guān)聯(lián)，通常情況下，將位于1條染色體上某一區(qū)域的1組相關(guān)聯(lián)的多個SNP等位位點稱作為單倍型，其經(jīng)常被用于基因組關(guān)聯(lián)研究、復(fù)雜的致病基因或者重要經(jīng)濟(jì)性狀基因的定位以及多態(tài)性篩選研究中，相較于單個SNP位點的分析，其效應(yīng)分析更為可靠，基因型檢測工作也更為高效[31]。因此本研究這些單倍塊暫時無法用于石斑魚抗病品系的構(gòu)建工作中。

3.4 總結(jié)

本研究分析了石斑魚PPAR-δ基因組多態(tài)性及其與SGIV和RGNNV抗感/易感性狀的相關(guān)性，研究發(fā)現(xiàn)SNP-N5(g.2510C>T)與石斑魚RGNNV抗性顯著相關(guān)，SNP-S7(g.4595T>A)與SGIV抗性顯著相關(guān)(P<0.05)，該研究結(jié)果為石斑魚病毒性疾病的抗病選育工作提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。