氟苯尼考聯(lián)合銅環(huán)境脅迫對(duì)土壤固氮菌成膜能力及相關(guān)基因表達(dá)的研究

梁 儀，周 童，白 玲，王 美，孫永學(xué)

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià) (環(huán)境評(píng)估)實(shí)驗(yàn)室/廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642；2懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院,湖南 懷化 418400；3浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,浙江 杭州 311300)

氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)F)屬于酰胺醇類(lèi)動(dòng)物專(zhuān)用廣譜抗生素，廣泛用于防治畜禽消化道和呼吸道感染性疾病[1]，氟苯尼考經(jīng)動(dòng)物攝入后隨排泄物進(jìn)入環(huán)境中，造成潛在的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。呼秀智等[4]研究表明，氟苯尼考對(duì)土壤微生物的抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)。硫酸銅(CuSO4)作為一種促生長(zhǎng)、防腹瀉的添加劑用于養(yǎng)殖業(yè)，并發(fā)揮細(xì)胞電子傳遞、氧化還原等重要生理作用[5]，但動(dòng)物攝入后隨排泄物進(jìn)入環(huán)境中的高含量Cu可影響土壤微生物豐度、群落結(jié)構(gòu)及功能多樣性，導(dǎo)致土壤生態(tài)結(jié)構(gòu)破壞[6]。許多報(bào)道指出金屬與抗生素聯(lián)用后存在協(xié)同或拮抗作用，如：與單一處理相比，土霉素與鉛的交互作用使土壤細(xì)菌蔗糖酶活性明顯下降，表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)[7]；Fe(II)通過(guò)與土霉素形成復(fù)合物，降低其生物利用度，從而降低水稻對(duì)土霉素的吸收，表現(xiàn)為拮抗作用[8]。二者聯(lián)用效果與相關(guān)酶活性變化、是否形成復(fù)合物以及目標(biāo)物對(duì)重金屬耐受性差異等因素均相關(guān)。Wang等[9]報(bào)道，動(dòng)物糞便中氟苯尼考和Cu殘留不僅阻礙環(huán)境中細(xì)菌正常代謝，還可能增加細(xì)菌耐藥基因(Antibiotic resistance genes，ARGs)傳播到人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)。

土壤中固氮菌介導(dǎo)的生物固氮作用是生態(tài)系統(tǒng)中氮元素輸入土壤的主要過(guò)程，是全球氮循環(huán)至關(guān)重要的一步，獸用抗生素和重金屬殘留可能對(duì)固氮菌產(chǎn)生潛在影響[10]。本文對(duì)優(yōu)勢(shì)固氮菌RpEC2071進(jìn)行氟苯尼考聯(lián)合Cu脅迫處理，研究脅迫條件下對(duì)固氮菌胞外多糖產(chǎn)生及生物膜形成的影響，并分析固氮酶結(jié)構(gòu)基因、氮代謝調(diào)控基因以及生物膜基因mRNA表達(dá)水平，將為評(píng)估獸藥及添加劑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

固氮菌從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)廣東生物防治教育部工程研究中心無(wú)抗生素污染的花生根部附近土壤中分離純化后得到。

氟苯尼考原料藥購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司，純度99.5%；LB肉湯、LB瓊脂均購(gòu)自廣州環(huán)凱微生物有限公司；硫酸銅、異丙醇、NaOH、濃硫酸、葡萄糖、無(wú)水乙醇等均購(gòu)自廣州普智生物儀器有限公司，純度均為分析純；革蘭氏染色液購(gòu)自廣州翔博生物科技有限公司。

1.2 固氮菌分離鑒定與純化

1.2.1 花生根圍土中固氮菌的分離培養(yǎng) 稱(chēng)5.0 g

花生根圍土壤，加入50 m L無(wú)菌水振蕩搖勻，取10 m L懸濁液進(jìn)行梯度稀釋后分別取10?3、10?4、10?5g/m L土壤懸液0.1m L均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行純化，將純化菌株加入φ為10%的甘油水中，?20℃條件下保存。

1.2.2 固氮菌鏡檢與16S rDNA菌種鑒定 制備固氮菌革蘭氏染色涂片，油鏡(100×)觀察染色后細(xì)菌形態(tài)。提取固氮菌DNA模板，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送樣廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.3 固氮菌生物膜形成能力測(cè)試

供試菌活化：取保存的固氮菌劃線(xiàn)接種LB板，經(jīng)28℃培養(yǎng)48 h后純化2次備用。

生物膜生長(zhǎng)情況觀察：挑取固氮菌單菌落于5 mL改良LB肉湯，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)，記錄0、12、24、36、72、120、132、144、156和168 h時(shí)的試管生物膜生長(zhǎng)情況。

1.4 固氮菌生物膜形成變化

96孔板內(nèi)設(shè)置4組處理：空白組(CK)、氟苯尼考組(FF)、銅組(Cu)及混合組(FF+Cu)，各處理組組分添加量見(jiàn)表1，28 ℃條件下孵育120、132、144、156和168 h進(jìn)行采樣。樣品采用結(jié)晶紫法進(jìn)行處理[11]，每組3個(gè)重復(fù)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定孔中溶液D590nm。另外，以未接種供試菌的改良肉湯作為陰性對(duì)照，以陰性對(duì)照D590nm(Dc)的2倍作為界限值，根據(jù)D590nm進(jìn)行生物膜形成能力結(jié)果判斷：生物膜形成力強(qiáng)(D590nm>2Dc)；生物膜形成力弱(Dc

表1 96孔板中處理組各組分添加量Table1 Addition of each component in a 96-well plate of treatment group μL

1.5 固氮菌脅迫模型構(gòu)建

設(shè)置4組處理：空白組(CK)、氟苯尼考組(FF)、銅組(Cu)及混合組(FF+Cu)，各處理組組分添加量見(jiàn)表2，每組3個(gè)重復(fù)，于給藥后0、12、24、36、72、120、132、144、156和168 h測(cè)定各組菌液的D600nm，并采集后5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌沉淀和上清液于–80℃保存，用于后續(xù)測(cè)定固氮菌胞外多糖含量。

表2 脅迫模型組各組分添加量Table 2 Addition of each component in stress model groups mL

1.6 固氮菌胞外多糖含量測(cè)定

分別取“1.5”各樣品上清液2m L至離心管中，加入乙醇，4℃條件下靜置24 h后離心，洗滌沉淀后60℃干燥至恒質(zhì)量。將各組干燥樣品溶于2m L蒸餾水中，另以蒸餾水作為陰性對(duì)照，使用苯酚硫酸法及紫外分光光度計(jì)估算胞外多糖濃度[12]。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

采用TRIzol法[13]抽提固氮菌樣品RNA后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參考全基因組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表3，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以獲得的cDNA為模板，16S rDNA為內(nèi)參基因，采用Bio-Rad CFX 96檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)運(yùn)用2?△△Ct法進(jìn)行分析計(jì)算。

表3 引物序列Table 3 Primer sequences

1.8 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)，GraphPad Prism 7.0軟件繪圖，各指標(biāo)用One-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果采用平均數(shù)±SD表示，P <0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。所有數(shù)據(jù)均為3次或3次以上試驗(yàn)的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色與菌種鑒定

2.1.1 革蘭氏染色鏡檢經(jīng)革蘭氏染色后，染色結(jié)果如圖1，在100倍光學(xué)顯微鏡下鏡檢細(xì)菌呈紅色、棒狀，判定該菌為革蘭陰性菌。

2.1.2 16S rDNA菌種鑒定將分離得到的菌株序列上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與固氮菌的匹配度最高，將該菌命名為RpEC2071。繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)，發(fā)現(xiàn)固氮菌RpEC2071與根瘤菌NRCPB10相似度高達(dá)99%，進(jìn)一步鑒定其屬于根瘤菌。

圖2 菌株RpEC2071的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain RpEC2071 16S rDNA

2.2 RpEC2071生物膜形成能力表型分析

根據(jù)生物膜試管形成試驗(yàn)結(jié)果(圖3)，發(fā)現(xiàn)0～36 h未能明顯觀察到生物膜，表明分離菌株在前36 h生物膜形成能力弱；培養(yǎng)至72 h時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)較為明顯的生物膜，且生物膜形成能力隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)增加而逐漸增強(qiáng)。

圖3 菌株RpEC2071的生物膜試管形成試驗(yàn)Fig.3 Biofilm formation experiment of strain RpEC2071 in test tube

2.3 RpEC2071生物膜形成能力分析

采集4種脅迫條件下RpEC2071菌液，測(cè)定D600nm得到生長(zhǎng)曲線(xiàn)，如圖4所示，4組模型均表現(xiàn)為前期生長(zhǎng)較為緩慢，在120 h處生長(zhǎng)速度明顯加快，之后逐漸趨于穩(wěn)定，最終呈現(xiàn)衰退現(xiàn)象，故選取后面5個(gè)時(shí)間點(diǎn)做進(jìn)一步分析。

圖4 脅迫模型下的菌株RpEC2071生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.4 growth curve of strain RpEC2071 under stress model

96孔板內(nèi)生物膜形成能力定量測(cè)定結(jié)果如圖5所示。在156 h時(shí)，F(xiàn)F+Cu組的生物膜形成能力最低，CK組的生物膜形成能力最強(qiáng)，是FF+Cu組的3.1倍；在168 h時(shí)，F(xiàn)F+Cu組生物膜形成能力最低，F(xiàn)F組生物膜形成能力最強(qiáng)，是FF+Cu組的3.1倍。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F組和CK組生物膜形成能力均在156 h時(shí)急劇增強(qiáng)，Cu組在168 h時(shí)急劇增強(qiáng)，而FF+Cu組變化穩(wěn)定且生物膜形成能力最低。綜上生物膜的形成能力：FF組 > Cu組 > CK組 > FF+Cu組。

圖5 菌株RpEC2071的生物膜形成能力測(cè)定結(jié)果Fig.5 Test results of biofilm formation capacity of strain RpEC2071

2.4 胞外多糖含量測(cè)定

根據(jù)“2.3”生長(zhǎng)曲線(xiàn)選擇的5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)胞外多糖含量進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。由圖6可得，4個(gè)試驗(yàn)組在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的胞外多糖平均分泌量表現(xiàn)為：FF組>CK組>Cu組>FF+Cu組。表明Cu的添加對(duì)固氮菌存在抑制作用，且氟苯尼考能促進(jìn)Cu的抑制作用。

圖6 菌株RpEC2071胞外多糖含量測(cè)定分析圖Fig.6 Analysis chart for determination of extracellular polysaccharide content of strain RpEC2071

2.5 相關(guān)性分析

基于全基因組測(cè)序結(jié)果，定量測(cè)定固氮基因nifH、4個(gè)氮代謝調(diào)控基因ntrY、ntrX、glnK、nnrR及7個(gè)生物膜相關(guān)功能基因flaF、fliL、flhA、fliP、fliQ、fliR、flbT，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，flaF、fliL、flhA、fliQ這4種生物膜相關(guān)基因分別與固氮基因nifH、氮代謝調(diào)控基因ntrX呈現(xiàn)正相關(guān)(r=0.548～0.832，P<0.05)；另外發(fā)現(xiàn)nifH基因的表達(dá)可能受到ntrY、ntrX、glnK、nnrR這4種調(diào)控因子的調(diào)控(r=0.590～0.827，P<0.01)。

2.6 基因表達(dá)差異分析

基因熒光定量表達(dá)差異分析比較發(fā)現(xiàn)，生物膜相關(guān)基因表達(dá)受Cu的影響不大，然而其中的fliQ基因在混合或者Cu單獨(dú)施壓作用下，與氟苯尼考單獨(dú)施壓作用下存在顯著的差異(圖7 D)，但均與CK組無(wú)明顯差異。而在氮代謝相關(guān)基因的分析中，發(fā)現(xiàn)氟苯尼考與Cu混合后顯著促進(jìn)了nnrR基因的表達(dá)(圖8 D)，表明Cu與氟苯尼考對(duì)該調(diào)控基因存在協(xié)同作用，然而它們對(duì)ntrX存在拮抗作用。

圖7 菌株RpEC2071的生物膜基因表達(dá)比較Fig.7 Expression comparison of biofilm gene of strain RpEC2071

圖8 菌株RpEC2071的氮代謝調(diào)控基因表達(dá)比較Fig.8 Expression comparison of nitrogen metabolism regulation gene of strain RpEC2071

對(duì)固氮菌中重要固氮酶的代表基因nifH進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如圖9所示。其中Cu的添加顯著升高了nifH基因的表達(dá)，而Cu與氟苯尼考聯(lián)用時(shí)又減弱該過(guò)程。

圖9 菌株RpEC2071的固氮基因nifH表達(dá)比較Fig.9 Expression comparison of nitrogen fixation gene nifH of strain RpEC2071

3 討論與結(jié)論

生物膜有助于細(xì)菌承受饑餓、干燥等惡劣環(huán)境條件，使其能夠適應(yīng)變化的條件，在其面對(duì)環(huán)境壓力、免疫反應(yīng)和抗生素時(shí)提供保護(hù)性環(huán)境[14]。本研究結(jié)果表明，4種不同處理對(duì)生物膜的影響不同，F(xiàn)F組生物膜形成能力最強(qiáng)，Cu組次之，說(shuō)明在氟苯尼考和Cu單獨(dú)加入時(shí)，均對(duì)固氮菌產(chǎn)生壓力，且氟苯尼考對(duì)固氮菌的脅迫壓力較大，使固氮菌在脅迫環(huán)境下形成生物膜以保護(hù)自身，與馮世文等[15]的研究結(jié)果相符，而在氟苯尼考和Cu混合添加時(shí)則會(huì)抑制固氮菌生物膜的形成，其原因本試驗(yàn)沒(méi)有闡明，可以做進(jìn)一步的深入研究。與此同時(shí)，結(jié)果顯示隨脅迫時(shí)間增加固氮菌生物膜形成能力也逐步增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)菌在暴露于壓力條件下會(huì)產(chǎn)生更多的生物膜。

在4種不同處理下，固氮菌胞外多糖的分泌量明顯不同，氟苯尼考組最高，混合組最低，與生物膜測(cè)定結(jié)果基本吻合，亦與杜心恬等[16]的研究結(jié)果相符，說(shuō)明胞外多糖是生物膜重要組成部分[17]，并與生物膜形成緊密相關(guān)。進(jìn)一步分析Cu組發(fā)現(xiàn)，由于胞外多糖形成是細(xì)菌的主要防御機(jī)制之一[18]，固氮菌在Cu的單一脅迫下會(huì)對(duì)胞外多糖的合成產(chǎn)生輕微抑制作用，但不對(duì)生物膜的形成能力產(chǎn)生抑制作用，此現(xiàn)象可從另一個(gè)方面說(shuō)明，胞外多糖的分泌會(huì)影響生物膜的形成，但不是其決定性因素，可能與載體表面性質(zhì)及環(huán)境因素等因素相關(guān)。

對(duì)4種不同處理下不同類(lèi)型基因的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，生物膜與胞外多糖無(wú)明顯的相關(guān)性，再次驗(yàn)證胞外多糖對(duì)生物膜的形成有影響作用，但不是其決定性因素這一觀點(diǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)固氮酶基因nifH的表達(dá)可能受到ntrY、ntrX、glnK、nnrR這4種調(diào)控因子的調(diào)控，并與flaF、fliL、flhA、fliQ這4種生物膜相關(guān)基因呈現(xiàn)正相關(guān)。此外，4種生物膜相關(guān)基因還與氮代謝調(diào)控基因ntrX呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，這與Li等[19]的研究結(jié)果相符。說(shuō)明氮循環(huán)功能跟生物膜形成之間有明顯的相關(guān)性，故評(píng)價(jià)氮循環(huán)的功能過(guò)程不僅應(yīng)關(guān)注其遺傳潛力，還應(yīng)關(guān)注其生物膜的生理活性。

差異性分析中，與Ⅲ型分泌系統(tǒng)中鞭毛蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的生物膜相關(guān)基因fliQ[20]，在氟苯尼考和Cu混合作用或者Cu單獨(dú)作用下，與氟苯尼考單獨(dú)作用存在顯著的差異，說(shuō)明氟苯尼考與Cu對(duì)該基因表達(dá)的影響差異較大，且對(duì)其表達(dá)存在明顯拮抗作用。Cu2+可能使固氮菌鞭毛組成紊亂，進(jìn)而削弱RpoN2因子功能，導(dǎo)致fliQ基因表達(dá)下降[21]；而氟苯尼考對(duì)固氮菌的脅迫使得其鞭毛運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)而使得fliQ基因表達(dá)上升。同理，二者對(duì)參與控制鞭毛和胞外多糖的ntrX基因的表達(dá)同樣存在拮抗作用[22]。nifH是負(fù)責(zé)編碼固氮酶鐵蛋白的基因[23]，Cu的添加顯著提高了nifH的表達(dá)，而氟苯尼考會(huì)削弱這一過(guò)程，存在拮抗作用。Cu蓄積對(duì)固氮菌產(chǎn)生不利影響，脫毒過(guò)程會(huì)增加能源消耗和氮需求，從而可能通過(guò)其共生作用促進(jìn)nifH表達(dá)；而氟苯尼考可能與Cu形成絡(luò)合物，降低Cu濃度，故相較于Cu組，F(xiàn)F+Cu組nifH表達(dá)減弱。與之相反，分析氮代謝相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考與Cu混合后顯著促進(jìn)了反硝化作用中負(fù)責(zé)催化NO轉(zhuǎn)化為N2O的反硝化酶的調(diào)控基因nnrR的表達(dá)，表明Cu與氟苯尼考對(duì)該調(diào)控基因存在協(xié)同作用，可能是由于在氟苯尼考聯(lián)合Cu的雙重脅迫下迫使固氮菌需要更加快速地進(jìn)行反硝化作用以保護(hù)自身，進(jìn)而使得nnrR的表達(dá)增加[24-25]。

本文通過(guò)從花生根圍土中分離出一株優(yōu)勢(shì)固氮菌，以養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用的廣譜類(lèi)抗菌藥物氟苯尼考和飼料添加劑Cu作為脅迫因子，分別從表型水平和基因水平探究二者單獨(dú)或聯(lián)合處理對(duì)優(yōu)勢(shì)固氮菌產(chǎn)生的影響以及生物固氮主要功能基因分子響應(yīng)特征。發(fā)現(xiàn)二者單獨(dú)使用均會(huì)使固氮菌生物膜形成能力增強(qiáng)，但聯(lián)用時(shí)產(chǎn)生拮抗作用；二者對(duì)胞外多糖形成的影響與生物膜測(cè)定結(jié)果基本一致；二者單獨(dú)或聯(lián)用均改變相關(guān)功能基因表達(dá)水平，且對(duì)fliQ、nifH基因產(chǎn)生拮抗作用、對(duì)nnrR基因產(chǎn)生協(xié)同作用。氟苯尼考及Cu均影響著固氮菌生物膜的形成，說(shuō)明二者的存在威脅著土壤中固氮菌的生存，長(zhǎng)期以往將破壞環(huán)境土壤生態(tài)系統(tǒng)。