大白公豬精漿外泌體miRNA表征鑒定及功能分析

孫艷梅，孫敬帥，秦佳麗，袁仁強，朱曉萍，趙云翔,3

(1佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院,廣東 佛山 528231；2廣西揚翔農(nóng)牧有限責任公司,廣西 貴港 537000；3廣西貴港秀博基因科技股份有限公司,廣西 貴港 537000)

外泌體(Exosome,EX)是指包含了復雜RNA和蛋白質(zhì)，直徑為30～150 nm的膜性小囊泡。外泌體存在于體液中，是多泡體(Multivesicular body，MVB)與細胞質(zhì)膜融合并且以胞外方式降解釋放的小泡[1]，參與調(diào)控精子體內(nèi)的生理活動[2]。由于細胞類型不同，外泌體通過旁分泌和自分泌的調(diào)節(jié)方式，與靶細胞融合或傳遞其內(nèi)載物，參與免疫應答等生理和病理過程[3-4]。外泌體攜帶細胞來源的多種蛋白質(zhì)、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，與細胞間通信、細胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過程有關(guān)。精液中富含的外泌體稱為精漿外泌體(Seminal plasma exosome，spEX)。研究表明，精漿和細胞外囊泡(外泌體和微囊泡)不僅是精子的載體，在其他生殖生理活動中也起著至關(guān)重要的作用[5]。spEX具有改善精液質(zhì)量、調(diào)節(jié)精子活力、影響精子受精能力的功能[6]。有研究表明，精漿外泌體產(chǎn)生的胞外三磷酸腺苷(Extracelluar adenosine triphosphate，exATP)可以通過孵育新鮮豬精子達到提高精子活力、調(diào)節(jié)線粒體代謝并控制精子運動的目的[7]。miRNA(microRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼、長度約為20～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[8]，廣泛存在于生物體各種組織或器官中，調(diào)控機體生長發(fā)育和細胞凋亡。哺乳動物中，miRNA與靶mRNA不完全互補，可在翻譯水平上抑制靶基因表達，調(diào)控生命活動[9]。有研究表明，miRNA通過識別并結(jié)合目標mRNA的部分互補位點，介導精子和精漿兩者細胞間的接觸，形成誘導的沉默復合物的一部分，miRNA通過翻譯抑制或降解靶mRNA而沉默基因[1]，具有調(diào)節(jié)基因表達的作用[10]。miRNA可以潛在地調(diào)控精子發(fā)生和成熟的許多方面，包括增殖、分化發(fā)育[11]和凋亡[12]。但目前對spEX與miRNA之間的調(diào)控關(guān)系研究較少。

隨著人工受精技術(shù)的普及，種公豬的地位顯著提高，公豬的精液品質(zhì)也愈發(fā)受人關(guān)注。中國是養(yǎng)豬大國，在繁育過程中，良好的豬精液質(zhì)量可以帶來更大的經(jīng)濟效益，深入了解精子活力的影響因素以及尋找決定精子活力的關(guān)鍵因子成為當前亟需解決的技術(shù)難題之一[13]。本研究通過對大白公豬精漿外泌體進行分離提取和鑒定[14]，測序分析spEX miRNA表達譜在精子受精中的調(diào)控作用，可以更好地了解精子獲能與精漿外泌體之間的表達情況，這些數(shù)據(jù)可為改善精液質(zhì)量、提高精子受精能力等方面的研究提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取5頭25～32月齡的優(yōu)秀大白公豬作為研究對象，所有公豬均來自同一豬場(廣西某豬場)，處于相同飼養(yǎng)管理條件下，按時接種疫苗。采精間隔5～7 d。室溫手握法進行采精，初次射出的5～10 mL的精液不收集。所有樣品均采用計算機輔助精液分析儀(CASA)檢測精子的活力和形態(tài)[2]。樣本在17 ℃、2840 r/min離心10min使精子和精漿初分離，精漿保存于?40℃，用干冰運回實驗室。

1.2 方法

1.2.1 外泌體分離37 ℃條件下解凍精漿，取10 m L精漿于4℃、5 620 r/min離心30min收集上清液，繼續(xù)在4℃、11240 r/min離心70min分離出細胞外大囊泡，得到的每份樣品液依次使用0.45μm、0.22 μm針孔濾器過濾，將過濾后的液體在4 ℃、33200 r/min離心80min，去除上清液后加入PBS溶液反復吹打，白色膠絮狀物質(zhì)即為外泌體，進一步在4 ℃、33 200 r/min離心80 min純化外泌體，加400μL PBS溶液于?80℃存放備用。

1.2.2 透射電鏡分析取10μL外泌體樣品置于碳涂層銅網(wǎng)格上吸附20min，干燥后避光，用15μL醋酸雙氧鈾負染1min。在Hitachi H-7700透射電子顯微鏡下拍照，檢測外泌體的形態(tài)。

1.2.3 納米顆粒跟蹤分析取5μL外泌體樣品稀釋至30μL，用ZetaView Nanoparticle Tracker測量外泌體的平均直徑和濃度，分析外泌體的粒徑大小分布情況。

1.2.4 Western blot鑒定分析取外泌體樣品加入適量的SDS-PAGE緩沖液，99℃變性10min。用SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒(上海碧云天生物有限公司)，進行制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗Calnexin(Abcam，ab133615)、Hsp70(Abcam，ab181606)、β-Actin(Beyotime，ab8226)和Tsg101(Beyotime，ab125011)，一抗均已以1:1000的體積比稀釋，然后根據(jù)說明書配制顯色液，通過成像系統(tǒng)對條帶進行曝光拍照。

1.2.5 miRNA的提取用miRNeasy?mini試劑盒(Qiagen)從分離鑒定取得的樣品中提取和純化miRNA。提取后的miRNA用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)(Agilent Technologies)及配套的RNA Nano 6000 Assay Kit進行質(zhì)控。

1.2.6 cDNA文庫構(gòu)建及測序用QIAseq miRNA(Library Kit，Qiagen)構(gòu)建文庫。5個單獨測序樣品在屬性序列中額外加入索引代碼，最終經(jīng)Bioanalyzer 2100(Agilent)和qPCR評估m(xù)iRNA文庫構(gòu)建的質(zhì)量，并用Illumina Hiseq2000(Illumina)進行miRNA測序。

1.2.7 miRNA數(shù)據(jù)處理及分析用Bowtie軟件，將測序得到的miRNA分別與Silva、GTRNAdb、Rfam和Repbase數(shù)據(jù)庫進行序列比對，篩選出miRNA并計算miRNA的表達量(Transcript permillion，TPM)，公式為TPM=Readcount×106/Mapped Reads(Readcount表示比對到某一miRNA的Read數(shù)目；MappedReads表示比對到所有miRNA上的Read數(shù)目)。

1.2.8 miRNA靶基因的預測、GO分類及KEGG富集分析根據(jù)鑒定得到的高表達量的miRNA，基于3′UTR作為靶向序列，用miRanda和RNAhybrid軟件預測miRNA的靶基因，用GO(http://www.geneonUology.org)和KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)對預測的靶基因進行功能注釋和通路分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 精漿外泌體的鑒定

CASA系統(tǒng)對大白公豬原始精液的精子活力檢測(表1)，結(jié)果顯示精子活力良好，符合國家制定的種豬常溫精液質(zhì)量標準[15]。透射電子顯微鏡觀察精漿中所分離的細胞外囊泡，可見明顯的立體膜結(jié)構(gòu)散在分布，呈圓形或橢圓形，大小較為均一，其形態(tài)具有典型的茶杯托樣特征(圖1)；粒徑分析顯示囊泡粒子平均粒徑為96.9 nm，粒徑主峰占比為94.9%(圖2)；Western blot結(jié)果顯示囊泡包含Tsg101、Hsp70等外泌體標志性膜蛋白，Tsg101和Hsp70蛋白表達為陽性(圖3)。這些數(shù)據(jù)與前人的研究一致，表明精漿中所分離的細胞外囊泡為外泌體。

表1 精液質(zhì)量基本信息Table 1 Basic information of semen quality

圖1 精漿外泌體透射電鏡檢測結(jié)果Fig.1 Transmission electron microscopic detection of seminal plasma exosomes

圖2 精漿外泌體粒徑分析Fig.2 Particle size analysis of seminal plasma exosomes

圖3 精漿外泌體標志性蛋白的Western blot檢測Fig.3 Western blot assay of marker proteins in seminal plasma exosomes

2.2 豬精漿外泌體中miRNA測序和鑒定

對5頭大白公豬spEX樣品miRNA測序，檢測到Raw read數(shù)量為108849665，Clean read數(shù)量為60 882 083，堿基質(zhì)量值(Q 30)范圍為96.89%～97.40%，共鑒定出329個已知miRNA。miRNA片段長度為19～24 bp，其中22 bp的片段占比超過45%。根據(jù)計算miRNA的表達量TPM，篩選前20個代表性miRNA(表2)。

表2 精漿外泌體中標志性miRNATable 2 Representative miRNAs in seminal plasma exosomes

2.3 miRNA靶基因預測

用miRanda和RNAhybrid軟件預測和篩選得到miR-10家族(miR-10b和miR-10a-5p)、let-7家族(let-7c、let-7a、let-7f-5p和let-7e)等前10個高表達miRNA的靶基因。利用Cytoscape軟件對miRNA與靶基因互作分析進行可視化(圖4)。富集結(jié)果顯示，miRNA中高表達的miR-let-7c-5p潛在調(diào)控染色質(zhì)重塑蛋白MORC家族CW型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白2(MORC family CW-type zinc finger 2，MORC2)、人轉(zhuǎn)化生長因子β受體3(Transforming growth factor beta receptor 3，TGFBR3)、DEAD-box RNA解旋酶3(DEAD-box RNA helicase 3 Xlinked，DDX3X)、核糖核苷酸還原酶M 2(Ribonucleotide reductase regulatory subunit M2，RRM 2)等多個靶基因；MiR-125a-5p潛在調(diào)控鎂離子依賴的蛋白磷酸酶(Protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent 1D，PPM 1D)和雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶?2(Dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 2，DYRK2)，且和miR-let-7c-5p聯(lián)合調(diào)控靶基因鼠雙微體4(Murine doubleminute 4，MDM 4)、鋅指基質(zhì)蛋白型蛋白3(Zinc finger matrin-type protein 3，ZMAT3)和胰島素樣生長因子1(Insulin like growth factor 1，IGF1)；miR-16-5p潛在調(diào)控血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor subunit B，PDGFB)、核糖體蛋白S6激酶多肽3(Ribosomal protein S6 kinase A3，RPS6KA3)、神經(jīng)母細胞瘤鼠肉瘤同系物(NRAS proto-oncogene,GTPase，NRAS)、胰島素樣生長因子1受體(Insulin like growth factor 1 receptor，IGF1R)等多個靶基因；miR-let-7a-5p潛在調(diào)控活化白細胞黏附分子(Activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)、精子相關(guān)抗原9(Sperm associated antigen 9，SPAG9)、肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)、類劍蛋白p60亞基A 1(Katanin catalytic subunit A1 like 1，KATNAL1)等多個靶基因；miR-let-7i-5p潛在調(diào)控靶基因Th2型炎癥因子(Interleukin 13，IL13)、α?心臟肌動蛋白(Actin alpha cardiac muscle 1，ACTC1)、脂聯(lián)素2型受體(Adiponectin receptor 2，ADIPOR2)和B淋巴細胞瘤?2(BCL2 apoptosis regulator，BCL2)；miR-125b-5p潛在調(diào)控E2F家族轉(zhuǎn)錄因子2(E2F transcription factor 2，E2F2)、受體亞家族2C成員2(Nuclear receptor subfamily 2 group C member 2，NR2C2)、堿性神經(jīng)酰胺酶2(Alkaline ceramidase 2，ACER2)、Ⅲ型纖維連接蛋白域蛋白3A(Fibronectin type III domain containing 3A，F(xiàn)NDC3A)等多個靶基因；其中泛素特異性蛋白酶47(Ubiquitin specific peptidase 47，USP47)、B細胞淋巴瘤?2(BCL2 apoptosis regulator，BCL2)、細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑1A(Cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)被多個miRNA聯(lián)合調(diào)控。

圖4 精漿外泌體miRNA與靶基因互作分析Fig.4 Interaction analysis between miRNAs in seminal plasma exosomes and target genes

2.4 豬精漿外泌體中miRNA功能分析

GO和KEGG富集分析結(jié)果顯示，spEX中miRNA的調(diào)控功能主要表現(xiàn)在射精、P53信號通路、前列腺癌、細胞對DNA損傷刺激的反應、負調(diào)控凋亡過程、跨膜運輸、質(zhì)膜外側(cè)、頂體膜結(jié)合、受精等通路中發(fā)揮潛在調(diào)控作用(圖5)。其中，射精通路中，miR-16-5p的靶基因包括ACVR2A和SLC6A4；P53信號通路中，let-7c-5p的靶基因包括BCL2L1、IGF1、CCND 1和CDKN 1A；細胞對DNA損傷刺激反應通路中，miR-125a-5p的靶基因包括MORC2、BTG2和TRAF6；精子受精通路中，let-7c-5p的靶基因包括BCL2L1和FNDC3A；質(zhì)膜外側(cè)的通路中，miR-16-5p的靶基因是TGFBR3，miR-200b-5p的靶基因是IL12RB2，miR-148a-3p的靶基因是ALCAM，let-7i-5p的靶基因是IL13，let-7a-5p的靶基因是THBS1，miR-125a-5p的靶基因是LIFR，miR-125b-5p的靶基因是CDH5。

圖5 精漿外泌體miRNA靶基因功能GO和KEGG富集分析Fig.5 GO and KEGG enrichment analyses of miRNA target gene functions of seminal plasma exosomes

3 討論與結(jié)論

外泌體可攜帶多種核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及小分子物質(zhì)等重要信息物質(zhì)，形成細胞間通信，直接影響細胞遷移、免疫反應和細胞分化生長等過程。外泌體具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，其組成成分和功能具有特異性，被其包裹的內(nèi)容物可穩(wěn)定存在[16]。外泌體的形成以及被包裹內(nèi)容物的分揀、釋放是一系列精細調(diào)控的過程，需要很多蛋白質(zhì)和能量的參與。細胞通過不斷吸收釋放外泌體，實現(xiàn)了與外界微環(huán)境的信息交互，參與到各種生理病理疾病中。本研究提取的大白豬spEX平均粒徑約為96.9 nm，電鏡下形態(tài)呈茶杯托狀結(jié)構(gòu)，Western blot結(jié)果顯示大白公豬精漿外泌體中Tsg101和Hsp70蛋白表達為陽性，這與其他報道EX的特征結(jié)果一致[17]，表明已成功提取到大白豬精液中的spEX。

精液中的EX主要是睪丸、附睪、副性腺分泌物的混合物，即精漿外泌體。其成分因動物物種而異[18]。在外泌體運載的生物分子中，越來越多miRNA的作用被發(fā)掘關(guān)注。有研究表明miRNA是外泌體中含量最豐富的細胞間信息交流的主要分子之一[19]，外泌體攜帶的生物活性調(diào)節(jié)分子參與精子發(fā)生、修飾加工及受精能力的調(diào)控[20]。一些miRNA的數(shù)量和種類一旦改變會導致配子發(fā)育停滯、精卵受精障礙和各種生殖系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生，顯示出EX攜帶的miRNA在配子發(fā)育和精子加工中起重要作用[20-21]。本研究主要對大白公豬spEX miRNA的表達情況進行檢測，并對前10個高豐度的miRNA相關(guān)功能進行預測，分析發(fā)現(xiàn)高表達的前10個miRNA中l(wèi)et-7家族占了4個(let-7c、let-7a、let-7 f-5p、let-7e)，顯著高于其他miRNA。其中，let-7家族在哺乳動物、昆蟲和植物中高度表達和保守，是基本生物學過程中最重要的miRNA調(diào)節(jié)因子之一[22]。有研究表明在公豬睪丸中miR-let-7家族的成員(let-7a-5p、let-7f-5p、let-7c-5p)高度表達，這與本研究預測結(jié)果基本一致，let-7家族可能與公豬睪丸的發(fā)育和睪丸中精子發(fā)生有關(guān)[23]，在生精過程中，高水平的let-7表達可能會改變正常生精所需的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而影響與精子形態(tài)和運動性相關(guān)的蛋白質(zhì)[24]。miR-let-7a在豬睪丸[23]、小鼠附睪精液[25]、人精漿[26]中均有發(fā)現(xiàn)，提示其可抑制維甲酸誘導的精原細胞分離并介導胚胎附著[27]。精子獲能的過程需要能量，miR-26a與精子能量代謝有關(guān)，其可能影響精子活力和凋亡[28]，有研究表明PDHX基因可能是miR-26a的潛在靶點，其參與丙酮酸氧化脫酸連接糖酵解和氧化磷酸化的關(guān)鍵步驟，可以調(diào)節(jié)糖代謝途徑，最終影響公豬精子的活力和存活率[29]。范宇[30]研究表明，miR-26a可以調(diào)節(jié)PTEN表達，通過靶向調(diào)控PTEN減少精子細胞凋亡和促存活作用，這可能是雄性不育的原因。在公豬中，miR-26a被多個環(huán)狀RNA靶向以調(diào)節(jié)精子活力，這也表明miR-26a 具有作為精子質(zhì)量和雄性生育能力的非侵入性生物標志物的潛力[31]。精子的發(fā)生包括3個主要發(fā)育階段：精原干細胞自我更新、精原干細胞分化和精子細胞變形，在每個階段中均檢測到miRNA表達，許多miRNA參與調(diào)節(jié)睪丸的發(fā)育階段和控制精子發(fā)生[32-33]。有研究報道血漿外泌體中高表達的miRNA沒有發(fā)現(xiàn)miR-10家族[34]，這排除了miR-10家族來自血漿的可能性。有研究分析miR-10b在不同年齡的小鼠睪丸中表達，且在睪丸發(fā)育過程中表達降低[35]，Li等[36]研究發(fā)現(xiàn)miR-10b主要在thy1細胞中表達，并且在出生后第6天的小鼠睪丸中高表達，這些結(jié)果表明miR-10b在精原干細胞有絲分裂的調(diào)節(jié)中起作用，可能與精子發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示spEX也檢測到miR-10家族，說明了miR-10家族可能是在附睪或副性腺等生殖器官中特異性表達。

GO和KEGG通路分析表明，高表達miRNA的靶基因在P53信號通路、精子受精、負調(diào)控凋亡過程、跨膜運輸和能量代謝等方面具有潛在的調(diào)控作用。P53是細胞內(nèi)最重要的蛋白之一，能介導細胞應答諸多類型的應激信號。P53蛋白通過參與促進DNA損傷修復、誘導細胞周期阻斷、細胞衰老凋亡等通路來維持基因組的穩(wěn)定性和完整性[37]。有研究表明，P53信號通路與男性生殖能力有關(guān)[23]，這也說明了精漿外泌體中的miRNA可能與公豬繁育有關(guān)。有些前列腺小體(前列腺分泌的外泌體)可以特異性地將遺傳物質(zhì)和生物活性物質(zhì)傳遞給精子，隨后可以提高精液質(zhì)量和公豬的受精率[38]。有研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者血清中miR-141的含量明顯增高，且與特異性抗原(PSA)相比較，兩者具有相關(guān)性，表明miRNA在前列腺癌的發(fā)生中起著非常重要的作用[39]。因此這些表達失調(diào)的miRNA可能可以用于癌癥的診斷、治療以及治療效果的評價。此外，通路分析表明，高表達miRNA的靶基因參與了氧化磷酸化和泛素介導的蛋白水解等活動。蛋白質(zhì)磷酸化對精子活力至關(guān)重要，研究顯示，核糖體蛋白S6激酶A3(RPS6KA3)與磷酸化(V-ATPase)運輸調(diào)節(jié)有關(guān)，RPS6KA3磷酸化各種底物，這種蛋白質(zhì)的活性與控制細胞生長和分化有關(guān)[40]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)可通過降解有毒蛋白質(zhì)聚集體和錯誤折疊的蛋白質(zhì)來參與調(diào)節(jié)精子蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)[41]。在附睪運輸過程中，附睪起始段的精子蛋白與附睪尾段的精子蛋白不一致，意味著運輸過程中精子蛋白選擇性丟失[42]。泛素介導的蛋白水解過程可能在精子附睪成熟階段發(fā)揮作用。

綜上，本研究報道大白公豬精漿外泌體高表達的前10個miRNA，通過靶基因預測和通路富集分析，預測了這些miRNA可能與精子的發(fā)生、P53信號通路、線粒體外膜調(diào)節(jié)、精細胞發(fā)育等過程有關(guān)，為大白公豬精漿外泌體中miRNA基因表達調(diào)控研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，這將有助于確定與精子的生育能力有關(guān)的基因及利用miRNA作為生物標志物預測公豬的生育力。但本研究結(jié)果基于生物信息學預測，所涉miRNA、靶基因及其相關(guān)通路還需進一步試驗驗證。