大豆GmMADS4基因克隆、亞細(xì)胞定位及功能分析

薛迎斌，宋 佳，李梟藝，李小豪，陳經(jīng)燁，伍萍珍，朱勝男，劉 穎

(1廣東海洋大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院,廣東 湛江 524088；2國家耐鹽堿水稻技術(shù)創(chuàng)新中心華南中心,廣東 湛江 524088；3廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江 524088；4嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,廣東 湛江 524048)

MADS是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其命名來源于釀酒酵母的mini chromosome maintenance 1(MCM1)、擬南芥AGAMOUS(AG)、金魚草DEFICIENS(DEF)和人類Serum response factor(SRF)基因，它們所編碼蛋白的N端都含有由50～60個(gè)氨基酸組成的MADS-box保守結(jié)構(gòu)域[1]。植物MADS家族從系統(tǒng)發(fā)育上可分為I型和II型(又稱M IKC型)2種，二者的區(qū)別主要在于有無K-box結(jié)構(gòu)域[2-3]。關(guān)于I型MADS基因家族成員的報(bào)道較少。在水稻中，I型的OsMADS78和OsMADS79在種子發(fā)育早期發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[4]；擬南芥中研究比較深入的I型MADS是AtAGL62，參與調(diào)控?cái)M南芥胚乳發(fā)育過程中的細(xì)胞分化[5]。II型MADS基因是植物所特有的，也是目前研究最多的，其中被廣泛熟知的是參與花器官的形成和發(fā)育，如經(jīng)典的花器官發(fā)育模型“ABC(D)E模型”中控制花萼和花瓣形成的AP1、控制花瓣和雄蕊形成的AP3、控制雄蕊和心皮形成的AG等基因，均屬于MADS家族成員[3]。除了參與調(diào)控開花，MADS基因還被報(bào)道參與植物多種生長發(fā)育過程。水稻的OsMADS25通過正調(diào)控生長素的累積參與促進(jìn)主根和側(cè)根的生長[6]；豆科作物大豆Glycine max的MADS成員GmNMH7能夠抑制結(jié)瘤相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而在根瘤的形成和發(fā)育過程中扮演負(fù)調(diào)控角色[7]。MADS家族基因還參與植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)性調(diào)控[8]。擬南芥AtAGL6通過抑制鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控植物耐鹽[9]；水稻OsMADS25響應(yīng)ABA信號(hào)，正調(diào)控植株對(duì)低溫的適應(yīng)性[10]；超量表達(dá)野生大豆MADS基因GsMAS1，增加了擬南芥對(duì)鋁毒的耐受性[11]。此外，多個(gè)MADS基因被報(bào)道參與缺磷的響應(yīng)，如水稻的OsMADS23、OsMADS25和OsMADS27[12]，但具體分子功能還有待進(jìn)一步研究。

大豆是我國重要的糧油作物，然而我國大豆生產(chǎn)嚴(yán)重不足，每年約1億噸需要進(jìn)口[13]。限制大豆生產(chǎn)的因素很多，其中，磷作為植物生長必需的大量營養(yǎng)元素，在土壤中很容易被吸附固定，導(dǎo)致土壤有效磷含量普遍偏低，低磷脅迫是限制我國大豆生長和產(chǎn)量的重要因素之一[14-15]。研究大豆磷營養(yǎng)調(diào)控機(jī)理，挖掘調(diào)控大豆適應(yīng)低磷脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于磷高效大豆品種的遺傳改良和培育具有重要意義[15-16]。MADS家族轉(zhuǎn)錄因子在大豆全基因組共有163個(gè)成員[17]，但是目前有功能報(bào)道尤其是有響應(yīng)低磷脅迫功能的相對(duì)較少。本研究克隆了1個(gè)大豆II型MADS成員?GmMADS4，并通過生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位、表達(dá)模式分析以及超量表達(dá)該基因?qū)Ω盗追€(wěn)態(tài)的影響分析，進(jìn)一步挖掘該基因可能的功能，為深入解析GmMADS4在大豆生長發(fā)育以及低磷脅迫適應(yīng)過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用植物材料為大豆品種‘粵春03-3’，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)根系生物學(xué)研究中心惠贈(zèng)；煙草Nicotiana benthamiana為本氏煙草。所用菌株為大腸埃希菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101、發(fā)根農(nóng)桿菌K599。

1.2 試驗(yàn)處理及樣品準(zhǔn)備

不同組織部位表達(dá)模式及缺素處理表達(dá)模式分析參考Yao等[18]的方法。挑選大小一致的大豆種子，播種于砂土中進(jìn)行萌發(fā)，5 d后選擇長勢一致的幼苗，轉(zhuǎn)移到1/2 Hoagland正常營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于不同組織部位樣品，分別在培養(yǎng)的第32天(大豆開花時(shí))收獲根、莖、葉、花，第50天收獲種子。對(duì)于缺素處理樣品，幼苗在正常營養(yǎng)液培養(yǎng)1周后，取部分幼苗分別轉(zhuǎn)移到無氮、無磷、無鉀的1/2Hoagland營養(yǎng)液(北京酷來搏公司)中處理24 h，然后收獲根和新葉以備分析。試驗(yàn)于2021年4—6月在日光溫室進(jìn)行，白天平均氣溫30℃，夜晚平均氣溫25℃，日平均光照時(shí)間為13 h。收獲后的樣品立即用液氮冷凍，之后放入?80℃條件下保存，用于RNA提取。

用Trizol試劑(Invitrogen公司)分別提取根、莖、葉、花和種子的總RNA，具體方法參照其說明書中的步驟。測定提取的總RNA的濃度和純度，檢測合格后，取1μL的總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)說明書去除基因組DNA后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得相應(yīng)的cDNA，保存于?20℃，作為載體構(gòu)建和RT-qPCR的模板。

1.3 生物信息學(xué)分析

GmMADS4基因基本信息包括開放閱讀框(Open reading frame,ORF)長度、外顯子/內(nèi)含子數(shù)目、氨基酸長度，從Phytozome數(shù)據(jù)庫(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)獲得。GmMADS4蛋白相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)通過Expasy數(shù)據(jù)庫(https://web.expasy.org/compute_pi/)獲得。GmMADS4蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測通過NCBI conserved domains(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行?；蚪Y(jié)構(gòu)通過GSDS網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)獲得。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)通過Prabi網(wǎng)站(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行預(yù)測。GmMADS4基因啟動(dòng)子(5′UTR上游2 000 bp的DNA序列)順式作用元件預(yù)測通過PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行。GmMADS4互作蛋白預(yù)測通過STRING網(wǎng)站(https://www.string-db.org/)根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析通過MEGA 5.05軟件完成，采用鄰接法(Neighbor-joining method)，Bootstrap設(shè)置為1 000次。

1.4 載體構(gòu)建

以大豆花的cDNA為模板，用基因特異引物(OE-GmMADS4-F/R)對(duì)GmMADS4基因ORF全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50μL的PCR反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer 5μL、dNTP 4μL、正反向引物各1μL、cDNA模板2μL以及ddH2O 37μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30 s、59℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃保溫10 min。擴(kuò)增出的目標(biāo)基因片段純化回收后，先連入pMD18-T載體，經(jīng)測序無誤后，用Sac I和Xba I進(jìn)行雙酶切，再通過T4 DNA連接酶將GmMADS4基因連入目標(biāo)載體pTF101s，獲得GmMADS4-pTF01s重組質(zhì)粒，檢測無誤后轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599備用。

構(gòu)建GmMADS4融合綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)載體，用基因特異引物GFP-GmMADS4-F/R(酶切位點(diǎn)為Kpn I和BamHI)擴(kuò)增GmMADS4基因ORF全長，并連入目標(biāo)載體pBEGFP，測序無誤后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101備用。引物設(shè)計(jì)通過PerlPrimer軟件完成，引物序列見表1。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

GmMADS4蛋白亞細(xì)胞定位通過煙草葉片表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)[19]進(jìn)行分析。將含有GmMADS4-pBEGFP載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101活化后擴(kuò)大培養(yǎng)，菌體收集后用重懸液(包含10mmol/LMgCl2、10mmol/LMES以及0.1 mmol/L乙酰丁香酮)重懸，使D600nm為0.5左右，靜置2～3 h，通過注射器導(dǎo)入生長3～4周的煙草葉片下表皮，轉(zhuǎn)化3 d后即可進(jìn)行觀察。以轉(zhuǎn)化空載體pBEGFP的葉片為對(duì)照。GFP熒光的觀察通過激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為507 nm。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 RT-qPCR分析

將大豆待測cDNA樣品稀釋10倍作為模板，RT-qPCR參考Liu等[20]的方法，試劑采用Go Taq qPCR Master Mix(Promega，美國)，通過StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國)完成，程序設(shè)置為95℃30 s；95℃5 s、60 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃30 s?；蚨恳颮T-GmMADS4-F/R和內(nèi)參基因GmEF-1α(Glyma17g23900)定量引物RT-GmEF-1α-F/R見表1。目的基因的相對(duì)表達(dá)量用2－ΔΔCt法計(jì)算。

1.7 大豆復(fù)合植株轉(zhuǎn)化

大豆復(fù)合植株轉(zhuǎn)化參考Zhuang等[21]的方法。種子萌發(fā)后，用注射器的針頭分別蘸取適量攜帶pTF101s空載體和GmMADS4-pTF101s的K599發(fā)根農(nóng)桿菌，然后在大豆幼苗子葉節(jié)的位置穿孔并涂抹菌體，進(jìn)行侵染。約10 d左右可以看到有毛根長出，待毛根長到10 cm左右，把原來的主根剪掉，留下毛根，即為轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株。將超量表達(dá)GmMADS4和對(duì)照轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株轉(zhuǎn)移到正常營養(yǎng)液中培養(yǎng)2周，收獲地上部和毛根進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.8 生物量的測定

植株生物量用干質(zhì)量表示，樣品收獲后立即在105℃烘箱殺青30min，然后調(diào)到75℃烘干至恒質(zhì)量，稱取植株總干質(zhì)量；每個(gè)處理有4次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。

1.9 可溶性磷含量的測定

將0.1 g毛根用液氮速凍并研磨至粉碎，加1 200μL雙蒸水繼續(xù)研磨以充分提取毛根中的可溶性磷；將研磨混合液轉(zhuǎn)入2 m L離心管，于4℃、14 000 r/min離心30min；取上清液采用鉬銻抗比色法[22]測定磷含量，測定波長為700 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmMADS4基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測

隨著基因組數(shù)據(jù)庫的更新，本研究獲得了1個(gè)大豆MADS成員，基因座位號(hào)為Glyma01g37470，命名為GmMADS4，該基因ORF長度為732 bp，編碼244個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為28 000，等電點(diǎn)為9.31。GmMADS4基因結(jié)構(gòu)如圖1A所示，該基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，兩端各有1段非編碼區(qū)。通過NCBI conserved domains保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測網(wǎng)站分析GmMADS4蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，該基因編碼蛋白N端第2—77個(gè)氨基酸，為保守的MADS結(jié)構(gòu)域，說明該基因?qū)儆贛ADS超家族，此外還含有1個(gè)K-box結(jié)構(gòu)域(圖1B)。

圖1 GmMADS4基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.1 Gene structure and conserved domain prediction of GmMADS4

2.2 GmMADS4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

進(jìn)一步分析了GmMADS4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)表明GmMADS4蛋白包含多個(gè)α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲(圖2)。其中，α螺旋最多，占51.44%；其次為無規(guī)則卷曲，占23.05%；延伸鏈占16.05%；β轉(zhuǎn)角最少，占9.47%(圖2)。

圖2 GmMADS4蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Secondary structure prediction of GmMADS4

2.3 MADS家族蛋白進(jìn)化樹分析

為了預(yù)測GmMADS4基因的功能，本研究將GmMADS4蛋白序列與已報(bào)道的模式植物擬南芥和水稻MADS家族成員，以及大豆MADS家族其他成員進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。這些MADS成員大致可以分成2個(gè)亞家族，分別為亞家族I和亞家族II(圖3)。I型MADS成員包括已報(bào)道的擬南芥的AtAGL 23/62和水稻的OsMADS78/79；Gm MADS4屬于II型MADS成員，該類型的MADS成員還包括擬南芥的AtAP1、AtAG、AtSOC1、AtANR1、AtP1、AtAP3、AtAGL 12/14/15/16/17/18/21，水稻的OsMADS20/23/25/26/27/62，大豆的GmNMHC5、GmNMH7、GmSEP1以及GmAGL1/11/15，其中GmMADS4與擬南芥的AtAP3序列相似性較高(圖3)。

圖3 MADS家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of MADS family proteins

2.4 GmMADS4基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

取GmMADS4基因5'UTR上游2 000 bp的序列為啟動(dòng)子，分析其中的順式調(diào)控元件，結(jié)果表明，在GmMADS4基因啟動(dòng)子中含有多種類型的順式調(diào)控元件。其中最多的是典型的光響應(yīng)元件，有22個(gè)，包括9個(gè)Box 4、5個(gè)G-Box、3個(gè)GT1-motif、2個(gè)TCCC-motif、2個(gè)AE-box和1個(gè)LAMP-element元件。其次是植物激素響應(yīng)相關(guān)的元件，有9個(gè)，其中響應(yīng)茉莉酸甲酯的有4個(gè)，包括2個(gè)CGTCA-motif和2個(gè)TGACG-motif；還有4個(gè)脫落酸響應(yīng)元件ABBRE和1個(gè)赤霉素響應(yīng)元件P-box。除了光響應(yīng)和激素響應(yīng)元件外，還包括胚乳表達(dá)相關(guān)元件GCN4_motif、分生組織表達(dá)相關(guān)元件CAT-box等參與生長發(fā)育調(diào)控的元件，厭氧感應(yīng)元件ARE，以及MYB和MYC轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的多種逆境脅迫響應(yīng)元件。

2.5 GmMADS4互作蛋白預(yù)測

通過STRING網(wǎng)站對(duì)GmMADS4的互作蛋白進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有5個(gè)候選蛋白可能與GmMADS4(GLYMA 01G37470.1)存在互作關(guān)系(圖4)。其中，GmMADS8(GLYMA 13G09660.1)、GmMADS9(GLYMA 14G24590.1)、GmMADS10(GLYMA04G42420.1)、GmMADS7(GLYMA06G12380.1)為MADS家族蛋白，GmLFY1(GLYMA04G37900.2)為LEAFY家族蛋白。

圖4 GmMADS4互作蛋白預(yù)測Fig.4 Interaction protein prediction of GmMADS4

2.6 GmMADS4基因克隆及超量表達(dá)載體構(gòu)建

為了分析GmMADS4基因功能，本研究用特異性引物OE-GmMADS4-F/R通過PCR克隆了GmMADS4基因ORF全長，結(jié)果如圖5A所示；PCR擴(kuò)增獲得1條單獨(dú)的條帶，位置在750 bp左右，與GmMADS4基因ORF全長732 bp大小一致。經(jīng)測序無堿基突變后，進(jìn)一步連接到超量表達(dá)載體pTF101s上。圖5B為GmMADS4-pTF101s重組質(zhì)粒酶切檢測，與重組質(zhì)粒酶切前(泳道1)相比，經(jīng)Sac I和Xba I限制性內(nèi)切酶雙酶切后(泳道2)在略低于800 bp的位置出現(xiàn)了1個(gè)條帶，大小與GmMADS4基因ORF全長一致，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 GmMADS4基因克隆及酶切檢測Fig.5 Cloning and enzyme digestion of GmMADS4

2.7 GmMADS4在大豆不同部位的表達(dá)模式

為了分析GmMADS4基因主要在大豆哪個(gè)部位發(fā)揮功能，本研究通過RT-qPCR分析了該基因在大豆根、莖、葉、花和種子中的表達(dá)量(圖6)。在大豆根、莖、葉、花和種子中都能檢測到GmMADS4基因的表達(dá)；值得注意的是，GmMADS4主要在花和種子中有較高的表達(dá)量，尤其在花中的表達(dá)量最高，而在根、莖和葉中表達(dá)量相對(duì)較低，尤其在莖中表達(dá)量最低(圖6)。GmMADS4基因在花中的表達(dá)量約是種子中的1.7倍，同時(shí)約是根、莖和葉中表達(dá)量的50倍以上。

圖6 GmMADS4在大豆不同部位的表達(dá)分析Fig.6 Expression pattern analysis of GmMADS4 in different soybean organs

2.8 GmMADS4在大豆根和葉中響應(yīng)缺素的表達(dá)模式

進(jìn)一步分析了GmMADS4基因?qū)θ钡⑷绷?、缺鉀脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明GmMADS4在大豆葉和根中響應(yīng)多種非生物脅迫(圖7)。GmMADS4在大豆根中主要受缺氮和缺磷處理上調(diào)表達(dá)，而對(duì)于缺鉀處理沒有響應(yīng)；與正常處理的對(duì)照組相比，GmMADS4在缺氮和缺磷處理下的表達(dá)量分別提高了11.2和6.6倍(圖7A)。在大豆葉部，缺氮、缺磷和缺鉀處理均上調(diào)GmMADS4的表達(dá)；與正常處理的對(duì)照組相比，GmMADS4在缺氮、缺磷和缺鉀處理葉中的表達(dá)分別提高了12.0、0.7和5.2倍(圖7B)。

圖7 GmMADS4在大豆根和葉中響應(yīng)缺素的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression pattern analysis of GmMADS4 in response to element deficiency in soybean roots and leaves

2.9 GmMADS4亞細(xì)胞定位分析

為了研究GmMADS4蛋白在亞細(xì)胞水平的具體定位，本研究通過煙草葉部瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，將攜帶GmMADS4融合GFP(GmMADS4-GFP)的農(nóng)桿菌GV 3101轉(zhuǎn)化煙草葉片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光位置，其中以GFP空載體為對(duì)照。轉(zhuǎn)化GFP空載體的葉片在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜都有較強(qiáng)的綠色熒光，而轉(zhuǎn)化GmMADS4的葉片主要在細(xì)胞核有較強(qiáng)綠色熒光，此外在細(xì)胞膜也有微弱的綠色熒光(圖8)。這些結(jié)果表明GmMADS4主要定位在細(xì)胞核。

圖8 GmMADS4亞細(xì)胞定位分析Fig.8 Subcellular localization analysis of GmMADS4

2.10 超量表達(dá)GmMADS4影響大豆可溶性磷濃度

為了研究GmMADS4基因的功能，本研究進(jìn)一步利用發(fā)根農(nóng)桿菌K599，通過下胚軸復(fù)合植株轉(zhuǎn)化法，獲得超量表達(dá)GmMADS4的大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株，即根系為轉(zhuǎn)基因毛根、地上部位正常的大豆植株。將超量表達(dá)株系與轉(zhuǎn)化空載體的對(duì)照株系在大豆?fàn)I養(yǎng)液中培養(yǎng)14 d，觀察表型。與對(duì)照相比，超量表達(dá)GmMADS4有促進(jìn)毛根生長、減緩地上部生長的趨勢，但是從毛根、地上部以及整株干質(zhì)量上看差異均不明顯(圖9)。超量表達(dá)GmMADS4雖然沒有改變復(fù)合植株的生物量(圖10A)，但是顯著增加了毛根的可溶性磷含量(圖10B)，與對(duì)照相比，超量表達(dá)GmMADS4轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株毛根中的可溶性磷含量顯著增加51%(圖10B)。

圖9 超量表達(dá)GmMADS4轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株的生長表型Fig.9 growth phenotypes of overexpressing GmMADS4 transgenic composite plants

圖10 超量表達(dá)GmMADS4對(duì)大豆復(fù)合植株生物量和可溶性磷含量的影響Fig.10 Effects of overexpressing GmMADS4 on biomass and soluble phosphorus content of soybean composite plants

3 討論與結(jié)論

MADS轉(zhuǎn)錄因子家族在植物多個(gè)生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究克隆了大豆II型MADS成員?GmMADS4，從進(jìn)化關(guān)系上，GmMADS4與擬南芥MADS家族成員AP3的序列相似性最高。AP3屬于經(jīng)典的ABC模型中的B型基因，在花器官識(shí)別中扮演重要角色[23-24]，同時(shí)，不同部位表達(dá)模式分析表明GmMADS4基因在大豆花中表達(dá)量最高，暗示GmMADS4可能在花器官形成和發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在擬南芥花分生組織發(fā)育的調(diào)控過程中，擬南芥MADS成員SEP3與AG、AP3和PI均存在明顯互作，以異源二聚體的形式發(fā)揮功能[25]。本研究通過互作蛋白預(yù)測發(fā)現(xiàn)GmMADS4與其他4個(gè)MADS成員GmMADS7/8/9/10存在相互作用，表明GmMADS4可能以復(fù)合體的形式參與調(diào)控作用。雖然關(guān)于大豆GmMADS7/8/9/10的具體功能還未見報(bào)道，但表達(dá)模式分析表明GmMADS7/8/9/10這4個(gè)成員均主要在花中特異表達(dá)[17]。這些結(jié)果表明，GmMADS4可能與其他蛋白互作，以異源二聚體的形式調(diào)控花器官的形成和發(fā)育。除了在花中高表達(dá)，GmMADS4在大豆種子中也有較高的表達(dá)量，且GmMADS4啟動(dòng)子中含有胚乳表達(dá)相關(guān)元件GCN4_motif，暗示GmMADS4還參與大豆種子發(fā)育。互作蛋白預(yù)測發(fā)現(xiàn)GmMADS4與GmLFY 1也存在互作，GmLFY1被報(bào)道主要在發(fā)育中的豆莢和種子中表達(dá)，而在莖尖分生組織中不表達(dá)，可能參與大豆的種子發(fā)育而不是開花[26]。這些結(jié)果表明，GmMADS4可能在大豆種子發(fā)育調(diào)控中也發(fā)揮重要功能。

MADS轉(zhuǎn)錄因子已被報(bào)道參與植物多種非生物脅迫，并在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演關(guān)鍵角色[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，GmMADS4在根和葉中響應(yīng)缺氮和缺磷脅迫上調(diào)表達(dá)，同時(shí)在葉中也受缺鉀脅迫上調(diào)表達(dá)，暗示GmMADS4可能參與氮、磷或鉀元素缺乏脅迫的適應(yīng)性調(diào)控。在擬南芥中，MADS家族成員AtAGL14/19/20/21/44均在根部受缺氮脅迫上調(diào)表達(dá)，其中，AtAGL20同時(shí)還受缺磷脅迫上調(diào)表達(dá)[28-29]。超量表達(dá)AtAGL44 (也即AtANR1)能夠促進(jìn)擬南芥根系發(fā)育，增加側(cè)根數(shù)目和長度，且這種調(diào)控方式依賴于硝酸根離子的存在[30]。水稻OsMADS61在根部受缺氮脅迫上調(diào)表達(dá)[12]，相反，OsMADS27/57在根部受缺氮脅迫下調(diào)表達(dá)[12,31]。其中，OsMADS57已被證明通過直接調(diào)控OsNRT2.3a的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控水稻中硝酸根離子從根往地上部的長距離運(yùn)輸[32]。此外，在水稻中多個(gè)MADS基因在根部受缺磷脅迫下調(diào)表達(dá)，如OsMADS23/25/27/57[12,31]。除了擬南芥和水稻，在小麥180個(gè)MADS成員中有54個(gè)MADS基因的表達(dá)在根部響應(yīng)缺磷，其中TaMADS21/93/121這3個(gè)成員受缺磷脅迫上調(diào)表達(dá)超過4倍[33]。但是，關(guān)于MADS基因參與磷信號(hào)調(diào)控功能的報(bào)道較少。本研究發(fā)現(xiàn)，在大豆毛根中超量表達(dá)GmMADS4能夠增加毛根中可溶性磷的含量，暗示GmMADS4可能參與調(diào)控大豆根系磷穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，大豆GmMADS4在花和種子中高表達(dá)，可能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子互作參與調(diào)控花和種子發(fā)育。另一方面，低磷脅迫上調(diào)GmMADS4在根系中的表達(dá)，且超量表達(dá)GmMADS4增加了轉(zhuǎn)基因毛根的可溶性磷含量。因此，GmMADS4可能在大豆耐低磷脅迫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。