重組人帕金森蛋白7基因在腎臟疾病中的研究進展

譚俊杰 江欣欣

清遠市婦幼保健院兒科，清遠 511510

重組人帕金森蛋白7（Parkinson's disease 7，PARK7）基因在1997 年被發(fā)現(xiàn)，是一種新的絲裂原依賴型癌基因。隨后在2003 年，被證實是帕金森?。≒arkinson's disease，PD）家族的致病基因之一［1］。PARK7廣泛存在于人體的腦、肝、腎、骨骼肌和生殖器官中，參與線粒體自噬途徑和細胞死亡、細胞氧化應激、抑制細胞凋亡、基因轉錄調控、信號轉導途徑、分子伴侶等生物功能，參與腫瘤細胞的生存、生長、抗氧化、轉移、侵襲及增殖，具有促進細胞的抗化療能力［2-5］。

PARK7基因及蛋白的結構特點

PARK7基因位于染色體1的P36.2～P36.3，長約24 kb，包含8 個外顯子，其中2 個外顯子不參與編碼，也不參與蛋白質翻譯。PARK7 mRNA含有567個編碼子，編碼189個氨基酸殘基的PARK7 蛋白［6］。PARK7 蛋白相對分子量約為20 kDa，有189個氨基酸，主要以二聚體形式存在，二級結構由8 個α 螺旋和11 條β 鏈組成的α∕β 折疊，屬于保守的PARK7∕ThiJ∕PfpI 蛋白超家族［7］。在原核及真核細胞中，PARK7 基因具有高度的保守性，在人類與大鼠的進化過程中，PARK7基因結構是密切相似的［1］。

PARK7的生理功能

1.參與線粒體自噬

線粒體自噬是一種特異選擇性清除損傷的線粒體自噬現(xiàn)象，即自噬過程大致為：在饑餓、炎癥損傷、敗血癥、氧化應激等情況下，DNA 突變、活性氧自由基產(chǎn)生增加、線粒體膜電位改變等共同作用下，線粒體出現(xiàn)功能障礙，進而引起線粒體自噬相關蛋白激活，形成隔離膜包裹線粒體，導致線粒體自噬體的形成，線粒體自噬體與溶酶體融合，進而形成線粒體自噬-溶酶體，線粒體在細胞溶酶體中完全降解，其降解產(chǎn)物可導致大量細胞因子的產(chǎn)生［8-9］。

PARK7 可通過參與PTEN誘導假定激酶1（PINK1）∕Parkin 經(jīng)典自噬通路［10-11］：PINK1 首先激活免疫復合物1（complex 1）、磷酸化Parkin 蛋白、鈣平衡調節(jié)及線粒體囊泡形成，進而通過調節(jié)線粒體融合和分裂平衡性，參與線粒體穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。同時，PINK1 能夠聚集電壓依賴性陰離子通道1（VDAC1）、miro 等蛋白，直接介導線粒體自噬過程。PINK1參與主要是通過抑制蛋白激酶A（PKA）的磷酸化，激活自噬蛋白LC-3 和裂解蛋白Drp-1。Parkin 蛋白具有4 個鋅指結構域：RING0、RING1、IBR 和RING2，但是只有Ring1 是經(jīng)典的Ring 泛素化連接酶組裝E2 泛素化連接酶，它能促進E2 泛素化連接酶結構域硫脂鍵的釋放。當線粒體受損時，PINK1 的MTS 序列會誘導線粒體膜電位的去極化，完整的PINK1穩(wěn)定地固定在線粒體外膜并自身激活，同時，它將細胞質中未被抑制的Parkin 招募并激活到受損的線粒體上，然后激活Parkin泛素化線粒體融合蛋白2（Mfn2）和線粒體電壓依賴性陰離子選擇通道1（VDAC1）等蛋白，再募集LC-3等蛋白家族，進而形成線粒體自噬-溶酶體，最后通過自噬作用將因老化受損的線粒體消除［12-13］。

小鼠過表達PARK7 蛋白可增加線粒體自噬標志蛋白LC3Ⅱ和Beclin-1的表達，激光共聚集及投射電鏡顯示自噬標志物微結構的改變及增加。當線粒體膜電位JC-1 下降時，PARK7 蛋白發(fā)生轉移，引起線粒體自噬，進一步清除老化受損的線粒體，說明PARK7 直接參與線粒體自噬［3，14］。Lopert 和Patel［15］研究表明敲除PARK7 基因后，小鼠早期線粒體中H2O2含量明顯升高，PARK7 依賴的線粒體缺失直接導致氧化應激誘導細胞死亡∕凋亡的敏感性增加。

2.參與氧化應激

PARK7 通過多種機制發(fā)揮抗氧化作用，包括可通過清除活性氧自由基直接發(fā)揮抗氧化活性。PARK7 通過Cys106 殘基與凋亡信號調節(jié)激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）結合，從而以兩種不同的方式阻止ASK1 的活化。首先，PARK7 阻止ASK1 的同源聚合化，從而阻止ASK1 激活凋亡途徑；其次，PARK7 通過調節(jié)另一種抑制劑血清硫氧還蛋白（thioredoxin，TRX）的結合來阻止ASK1 的活化。在正常靜息情況下，減少的TRX 與ASK1結合，抑制ASK1活性，使其處于非活性狀態(tài)。當細胞發(fā)生氧化應激時，TRX 被氧化并釋放ASK1，ASK1 促進細胞凋亡。當PARK7 與ASK1 結合，阻止TRX 釋放ASK1，從而為細胞提供抗氧化保護作用［16-17］。

PARK7 調節(jié)許多轉錄因子的活性，包括Nrf2、p53 和NF-κB 等［17］。核因子E2 相關因子2（Nrf2）是上調細胞中抗氧化基因表達的最相關轉錄因子，它與抗氧化反應元件（ARE）結合，包括TRX和谷胱甘肽系統(tǒng)等關鍵成員。其中，Nrf2∕ARE 參與細胞抗炎，亦在抗凋亡和免疫損傷中發(fā)揮重要作用。PARK7 在Nrf2 的調控中起著關鍵作用，通過激活Nrf2 有助于發(fā)揮抗氧化反應。研究表明，PARK7∕Nrf2 信號通路的激活對機體抗氧化應激損傷起到內源性保護作用，證實PARK7 和Nrf2 蛋白均是內源性保護蛋白［18］。此外，PARK7 通過降低Nrf2 的泛素化，穩(wěn)定Nrf2 蛋白及其下游的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶等表達。體外實驗報道，激活Nrf2 蛋白可有效保護糖尿病腎臟的氧化應激損傷，啟動內源性保護機制，在糖尿病早期階段PARK7 蛋白表達代償性增加，證明PARK7 激活Nrf2 相關信號通路可發(fā)揮內源性保護作用［19］。當PARK7 基因被敲除后，細胞的線粒體形態(tài)和功能受到影響，其中包含線粒體呼吸鏈損傷、活性氧產(chǎn)生增加、線粒體膜電位降低以及線粒體形態(tài)改變，導致溶酶體活性也下降，老化或損傷的線粒體使體內活性氧過量蓄積，部分線粒體發(fā)生自噬作用，進一步導致細胞凋亡或死亡［20］。

3.參與轉錄調控

PARK7通過參與調控細胞內外轉錄分子來發(fā)揮抗氧化應激和介導細胞存活等主要功能，常見下游分子包括人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）、Nrf2、胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、ASK、p53、Bcl-2 等［21］。PTEN 是PARK7 下游分子，Oswald 等［22］提出氧化后的PARK7 可與PTEN 緊密結合，抑制其功能，由此增加了磷脂酰肌醇3-激酶∕蛋白激酶B（PI3K∕Akt）的磷酸化的活性狀態(tài)，介導結構性突觸末端的可塑性。PARK7 通過激活ERK1∕2 途徑介導細胞存活和增殖，并通過抑制ASK1 激活來減弱細胞死亡信號傳導，在癌癥發(fā)病機理和神經(jīng)元存活中具有獨特作用［23］。p53蛋白是一種轉錄因子，可以誘導轉錄一些基因，參與DNA 修復、細胞周期調節(jié)和程序性細胞死亡等蛋白的編碼。PARK7可直接與p53結合，抑制p53的磺?；?，從而影響腫瘤抑制因子p53∕Bax-caspase 途徑觸發(fā)的細胞凋亡［21］。PARK7 還通過調節(jié)Bcl-2 基因家族編碼的凋亡分子調控細胞凋亡，如PARK7 降低凋亡效應分子Bax（BCL2-Associated X 蛋白）的表達，以氧化還原依賴性的方式誘導細胞存活［3，24］。

4.參與抑制凋亡

PTEN 基因作為PI3K∕Akt 信號通路的主要負性調控因子，是一個具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因。在外界因素刺激下，細胞中的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）可被激活，并使磷酯酰肌醇4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3 可使PKD 聚集并使活化的激酶PKB∕Akt磷酸化，形成有利于細胞生長的微環(huán)境，促進細胞生長和增殖。實驗表明，PTEN 基因可以抑制PIP2 磷酸化，從而減少PIP3 產(chǎn)生，阻斷PI3K∕PKB∕Akt 通路的激活，抑制生長和增殖。PARK7 是PTEN∕PI3K∕Akt 信號通路上游的負性調控因子，通過干擾沉默PARK7 后，PTEN 基因被釋放，PTEN∕PKB∕Akt 通路被阻斷激活，抑制細胞的生長和增殖，從而促進細胞凋亡［14，25-26］。在活性氧刺激下，細胞胞核中的PARK7 蛋白能夠與死亡域相關蛋白（DAXX）結合，抑制DAXX 出細胞核，并阻止DAXX 與細胞質中的ASK1結合，從而抑制細胞凋亡［27］。

5.參與分子伴侶

Knobbe 等［28］對細胞進行質譜定量分析，結果表明PARK7 可與糖酵解酶、熱休克蛋白Hsp70∕Hsp90 和過氧化物酶發(fā)生相互作用，Hsp70 可被PARK7 特異性識別結合后直接相互作用，在氧化應激下PARK7 可抑制錯誤折疊蛋白的積累，并通過與Hsp90 相互作用調節(jié)Akt 信號通路。此外，在氧化應激狀態(tài)下，PARK7蛋白被激活，并抑制殼聚糖、谷胱甘肽S-轉移酶和突觸核蛋白等分子形成多聚復合物的形成，直接參與分子伴侶的作用［29-30］。

6.PARK7參與其他通路

PARK7 還與許多細胞信號通路相互作用，參與細胞的生存，如Akt、HER3 等。其中，HER3 蛋白在細胞增殖和存活中起著至關重要的作用，乳腺癌患者的腫瘤組織HER3 和PARK7 的顯著共表達。PARK7 與HER3 結合的神經(jīng)蛋白（NRG）可誘導HER3 與其他靶向表皮生長因子受體家族受體的異構化，導致其磷酸化。癌細胞中PARK7 的過度表達可以增加HER3 的水平，促進細胞增殖和腫瘤生長。因此，PARK7 在乳腺癌細胞中的高表達預示HER3 信號轉導增加［31］。此外，PARK7 還能調節(jié)轉錄因子核因子-κB（NF-κB），增強其核運輸和細胞存活率，NF-κB亦參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展［32-33］。

PARK7與腎臟疾病的關系

1.PARK7與糖尿病腎病

糖尿病腎病可引起腎小球病變的主要病理變化為腎小球基底膜增厚，腎小球系膜肥大擴張，系膜細胞外基質和蛋白質的積聚，導致腎小球濾過功能受損。Wu 等［34］研究中，研究組蛋白在高誘導的足細胞損傷中，發(fā)現(xiàn)沉默Pim1（原癌基因蛋白質c-pim-1）基因后可逆轉組蛋白誘導的足細胞內PARK7 下降，同時發(fā)現(xiàn)組蛋白誘導的保護性自噬分子機制與雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路相關，證明PARK7∕mTOR通路參與了糖尿病腎病的發(fā)病。Das 等［35］體外應用葡萄糖孵育腎小球系膜細胞，發(fā)現(xiàn)高糖可誘導PARK7 刺激Akt 激酶磷酸化，激活mTOR。當沉默PARK7 基因后，Akt 磷酸化隨之下降，高葡萄糖誘導的TORC1 活化被逆轉，說明三者呈正相關關系。此外，實驗發(fā)現(xiàn)PARK7 和PTEN 聚合增加，加強了高糖環(huán)境下PTEN 的下調，由此推斷，高糖環(huán)境下腎小球足細胞和系膜細胞內上調的PARK7 可通過PARK7∕mTOR 途徑減少高糖誘導的氧化損傷。Sun 等［36］在研究糖尿病大鼠心肌缺血∕再灌注（MIR）引起的急性腎損傷（AKI）發(fā)生機制時，與空白組、MIR 組和糖尿病組相比，糖尿病+MIR 組的PARK7 和Nrf2 表達顯著增加。在糖尿病條件下，MIR 誘發(fā)加劇腎功能下降，引起PARK7∕Nrf2 信號通路的上調，表明由MIR 誘導的糖尿病大鼠AKI可能與PARK7∕Nrf2途徑的激活有關。

2.PARK7與急性腎損傷

Leeds等［37］研究表明，膿毒癥相關性急性腎損傷是一種自身炎癥失衡，導致組織氧化應激和自由基形成增加，從而使多種形式的細胞死亡。PARK7 是一種過氧化物酶蛋白，具有多種生物功能，包括抗細胞氧化應激的能力，并證實膿毒血癥在PARK7 基因缺陷小鼠中引起更嚴重的腎損傷。實驗證實PARK7 缺失會增加腎臟氧化應激，與腎小管凋亡和DAXX 的表達增加有關。與體內模型相似，使用髓樣收集導管細胞系（mIMCD3）和細胞毒性血清進行的體外實驗顯示，從野生型小鼠獲得的血清可使s100A8∕s100A9、DAXX的表達增加。研究表明膿毒血癥中PARK7 通過控制氧化應激，腎臟炎癥和DAXX 依賴性細胞凋亡，進一步說明對腎小管具有保護作用。PARK7 缺失會增加腎臟氧化應激，與腎小管凋亡和DAXX的表達增加有關。

3.PARK7與腎小管疾病

Shen等［38］通過大鼠腎小管近曲小管細胞在模擬不同糖濃度下，發(fā)現(xiàn)較低糖濃度時，PARK7 蛋白表達增加，但在暴露于高糖48 h 后，細胞中PARK7 蛋白表達降低。當血糖濃度過高時，PARK7表達的降低可增加糖尿病患者對腎缺血∕再灌注損傷的脆弱性。當質粒轉染過表達PARK7 后，相關腎臟損傷指標被逆轉，Nrf2 表達上升，證明PARK7 的過表達及PARK7∕Nrf2 途徑參與腎近曲小管細胞的氧化應激損傷。Yao 等［39］研究表明上調PARK7 后可通過抑制細胞質PTEN 表達和Akt 活化來促進腎小管間充質轉化，進一步解釋了PARK7的表達和PTEN在纖維化中關系的調控作用。

4.PARK7與常染色體顯性多囊腎?。ˋDPKD）

Li 等［3］通過在IMCD3 細胞中敲除PARK7 以評估PARK7 對體外細胞表型和線粒體功能的影響。PARK7 在ADPKD 模型中被下調，依據(jù)p53 信號通路介導的增殖、凋亡、氧化應激和線粒體代謝，減輕腎臟功能障礙和病理損害。

5.PARK7與腎臟纖維化

Eltoweissy 等［40］用促纖維化激動劑血管緊張素Ⅱ處理腎臟成纖維細胞和上皮細胞，使PARK7 的表達明顯上調，監(jiān)測腎臟纖維化小鼠模型的腎臟提取物和組織切片中的PARK7 表達，揭示了該蛋白的疾病分級調控。通過研究促纖維化激動劑對PARK7的影響，PARK7及其突變體的相互作用配偶體的親和沉淀，揭示了膜聯(lián)蛋白在PARK7 抗氧化應激反應機制中的重要作用，并明確了該蛋白在腎纖維化中的作用。

6.PARK7與腎臟腫瘤

腎透明細胞癌是成人的一種高度惡性腫瘤。Trivedi等［41］的研究表明，通過siRNA 敲除PARK7 和使用質粒過表達，PARK7 基因被顯著下調，突顯了PARK7 在腎細胞癌中對順鉑誘導的細胞凋亡反應。PARK7的過表達導致細胞凋亡顯著減少，而蛋白敲除則伴隨著順鉑處理的Caki-2 和A498細胞凋亡的增加，強調了PARK7在順鉑誘導的癌細胞凋亡中的重要作用。

雖然PARK7 在腎臟疾病中的作用尚未完全明確，但PARK7 作為新的多功能絲裂原依賴型癌基因，參與機體許多生理過程的調控，并參與腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程。因此，隨著對PARK7 的不斷深入研究，加深了我們對于腎臟疾病的認識及理解，確定PARK7 能否作為特異性生物標志物或治療靶點，將為新的潛在治療方案提供科學依據(jù)。

作者貢獻聲明譚俊杰：實施研究，起草文章，對文章的知識性內容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，行政、技術或材料支持；江欣欣：分析∕解釋數(shù)據(jù)，對文章的知識性內容作批評性審閱，行政、技術或材料支持