亞麻FAD基因家族的生物信息學鑒定分析

侯靜靜　趙利　王斌

摘要：不飽和脂肪酸為人體提供基本代謝所必需的能量，須從膳食中補充。脂肪酸去飽和酶FAD（fatty acid desaturase）是植物不飽和脂肪酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)脂肪酸的各組分比例和不飽和度與FAD的去飽和作用息息相關(guān)。為探究亞麻FAD基因家族的表達與進化，為其在亞麻高品質(zhì)育種中的應用提供理論依據(jù)。運用生物信息學方法對亞麻全基因組FAD基因家族的43個LuFADs基因進行分析。結(jié)果顯示，該家族成員編碼的蛋白質(zhì)大小為152～453個氨基酸，大部分為堿性不穩(wěn)定親水蛋白。與擬南芥FADs蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可分為4個主要亞家族：Δ12/ω-3去飽和酶、“前端”去飽和酶、Δ7/Δ9去飽和酶和SAD去飽和酶。保守結(jié)構(gòu)域和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析得出，同一亞組中的家族成員具有較為相似的基因結(jié)構(gòu)。染色體定位分析呈隨機性分布。亞細胞定位預測得出，葉綠體上的家族成員最多。啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該家族成員中抗氧化反應元件（ARE）數(shù)量最多。

關(guān)鍵詞：亞麻；FAD基因家族；生物信息學分析

中圖分類號：S565.9? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）03-0246-08

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.03.011

Abstract： Unsaturated fatty acids provide the human body with the energy necessary for basic metabolism and must be supplemented from the diet. FAD （fatty acid desaturase） is a key enzyme in the biosynthesis of unsaturated fatty acids in plants. The proportion and unsaturation of fatty acids in plants are closely related to the desaturation of FAD. In order to explore the expression and evolution of flax （Linum usitatissimum L.） FAD gene family and to provide theoretical basis for its application in high-quality flax breeding， in this study， bioinformatics method was used to analyze 43 LuFADs genes of flax. Results showed that the size of proteins encoded by the members of this family were between 152 to 453 amino acids， most of which were alkaline unstable hydrophilic proteins. The phylogenetic tree was constructed with the FADs protein sequence of Arabidopsis thaliana， which could be divided into four main subfamilies： Δ12/ω-3 desaturase， 'front-end' desaturase， Δ7/Δ9 desaturase and SAD desaturase. The analysis of conserved domain and exon-intron structure showed that the family members in the same subgroup had relatively similar gene structure. The chromosome localization analysis showed random distribution， and the subcellular localization predicted that the most family members were on the chloroplast. Analysis of promoter cis-acting elements showed that the number of antioxidant response elements （ARE） were the largest among this family.

Key words： Linum usitatissimum L.; FAD gene family; Bioinformatics analysis

亞麻（Linum usitatissimum L.） 是一年生自交草本植物，在我國甘肅、內(nèi)蒙古、山西、寧夏和河北等地廣泛種植［1 ］。亞麻可分為油用、纖維用和油纖兼用3種類型，其中油用亞麻俗稱胡麻，胡麻籽含油率為40%左右，具有較高的食用營養(yǎng)價值［2 ］。胡麻籽油的脂肪酸組成包括2種脂肪酸（棕櫚酸及硬脂酸）和3種不飽和脂肪酸 （油酸、亞油酸及α-亞麻酸），這5種脂肪酸占到胡麻油粗脂肪含量的99%，其中α-亞麻酸達到54%左右［3 ］。α-亞麻酸是人體必需脂肪酸，屬于ω-3系不飽和脂肪酸，具有降血脂、抗血栓腫瘤、健腦明目和改善肌膚等多種保健功能［4? ］。

不飽和脂肪酸的合成以飽和脂肪酸硬脂酸為底物，在脂肪酸延長酶（fatty acid elongase，F(xiàn)AE）和脂肪酸去飽和酶FAD（fatty acid desaturase）的作用下，通過一系列的脫氫、延長、去飽和作用形? ? 成［5 ］。其中FAD是植物不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)脂肪酸各組分的比例及其不飽和度與FAD的去飽和作用息息相關(guān)［6 ］。FAD家族主要在質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化油酸生成亞油酸、亞油酸生成亞麻酸［7 ］。依據(jù)輔因子和亞細胞定位的不同，F(xiàn)AD可劃分為膜結(jié)合和可溶性2種類型。膜結(jié)合FAD包括ω-6 FAD（催化油酸形成亞油酸）和ω-3 FAD（催化亞油酸形成a-亞麻酸），可溶性FAD包括Δ4 FAD（催化二十碳五烯酸EPA生成十二碳六烯酸DHA）、Δ6 FAD（催化亞油酸生成γ-亞麻酸）及Δ9 SAD（催化硬脂酸生成油酸）［8 ］。學者們對芝麻、油菜、向日葵、油茶等油料作物的FAD基因家族進行了生物信息學分析［9 - 12 ］，在其他作物中，例如藜麥、蕎麥、茄子等植物中也有該基因家族分析相關(guān)報道［13 - 15 ］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD與細胞膜的穩(wěn)定性和流動性也相關(guān)，進而對植株抗逆性產(chǎn)生影響［16 ］。亞麻FAD基因家族研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析［17 ］，但隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及亞麻全基因組數(shù)據(jù)的更新，對于脂肪酸合成途徑相關(guān)基因家族的分析有待進一步完善。我們運用生物信息學方法對亞麻全基因組的FAD基因家族進行分析，包括蛋白理化性質(zhì)分析、系統(tǒng)進化分析、保守結(jié)構(gòu)域及基因結(jié)構(gòu)分析、染色體定位分析、亞細胞定位預測和啟動子順式作用元件分析，以期為其在亞麻高品質(zhì)育種中的應用提供理論依據(jù)。

1? ?材料與方法

1.1? ?序列來源

從NCBI上獲得亞麻（version 2.0）15條染色體的基因序列（登錄號為CP027619-CP027633）［18 ］，從 phytozome數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/ portal.html#）中下載蛋白質(zhì)序列。

1.2? ?研究方法

1.2.1? ? LuFADs基因家族成員篩選與鑒定? ? 使用以下2種方法鑒定亞麻FAD蛋白基因。第1種是基于擬南芥基因組（Version10.0，https：//www.arabidopsis.org/）中的27個參考序列，通過BLASTP來鑒定亞麻基因組中的FAD蛋白，E值設置為1.0E-10。第2種是從Pfam蛋白家族數(shù)據(jù)庫 （http：//pfam.xfam.org/）下載與FA_Desaturase （PF00487）、FA_Desaturase 2（PF03405）和TMEM189（PF10520）結(jié)構(gòu)域?qū)碾[馬爾可夫模型（HMM）文件作為query，使用HMMER v3.3（http：//eddylab.org/software/hmmer/hmmer-3.3.tar.gz）中的hmmsearch工具來查找亞麻蛋白數(shù)據(jù)庫中所有可能的FAD蛋白序列，E值 < 1e-5。

1.2.2? ? 亞麻LuFADs基因的生物信息學分析? ? 利用ClustalW對亞麻、擬南芥FAD蛋白序列進行多重序列比對，接著在MEGA11軟件中使用鄰接法進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。使用Bioperl工具（https：//bioperl.org/）計算亞麻FAD家族成員的氨基酸數(shù)量、蛋白理論等電點（PI）和分子量大?。∕w）等指標［19 ］。利用本地MEME工具（版本 4.11.2，http：//alternate.meme-suite.org/tools/meme）搜索亞麻FAD家族成員序列中的保守基序。通過在線軟件（MG2C， http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）和（GSDS， http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/） 分別構(gòu)建亞麻FAD家族成員的染色體位置圖和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖。使用CELLO （http：//cello.life.nc-tu.edu.tw/）進行LuFAD家族成員亞細胞定位預測。采用Perl腳本提取亞麻FAD家族成員基因編碼區(qū)上游1 500 bp的序列，并利用在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE（http： //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 對該基因家族成員中的順式作用元件進行鑒定［20 ］。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?LuFADs基因家族成員鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

綜合2種方法的篩選結(jié)果，運用SMART （http：//smart.embl.de/）和NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）數(shù)據(jù)庫進一步驗證篩選結(jié)果中是否具有FAD結(jié)構(gòu)域組成，去除有錯誤、短小 （<100 aa）和沒有FAD結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列，最終鑒定了43個LuFADs基因，并依據(jù)它們在15條染色體位置信息和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果進行命名（表1、圖1）。編碼的蛋白質(zhì)范圍為152～453個氨基酸。LuFADs的理論分子量為17.243 9（LuFAD6-3）～51.246 8 kD（LuSLD2），等電點（pI）為6.07～10.26，LuSTAD（1～4）系列的pI < 7.00，呈酸性，其余39個成員pI均大于7，呈堿性。LuFADs基因蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)范圍為76.96～91.61，均為不穩(wěn)定蛋白。親水性平均值 （GRAVY）為正數(shù)的有5個，分別為LuSLD（1～4）系列和LuFAD6-4，表現(xiàn)為不親水性，其余38個家族成員均為親水蛋白（表1）。

2.2? ?LuFADs家族成員系統(tǒng)進化分析

運用鄰接法將LuFADs蛋白序列（43）與擬南芥FADs蛋白序列（27）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），可分為4個主要亞族：Δ12/ω-3去飽和酶亞族、“前端”去飽和酶亞族、Δ7/Δ9去飽和酶亞族和SAD去飽和酶亞族。

Δ12/ω-3去飽和酶亞家族包括3個分支：FAD6、FAD3和FAD6C。其中FAD6分支包括擬南芥的AtFAD6和亞麻的LuFAD6（1-13）；FAD3分支為膜結(jié)合ω-3FAD系列基因，包括擬南芥的AtFAD3、AtFAD3C、AtFAD3D和亞麻的LuFAD3C、LuFAD3D、LuFAD3-1、LuFAD3-2、LuFAD3-3、LuFAD3-4；FAD6C分支包括擬南芥的AtFAD6C和亞麻的LuFAD6C-1、LuFAD6C-2。其余3個亞族中，亞麻基因成員和擬南芥基因成員均表現(xiàn)較高的聚集性，特別是在Δ7/Δ9去飽和酶亞族中，亞麻基因LuADS（1-10）和擬南芥AtADS系列基因分別各自聚為1個分支。

2.3? ?亞麻FAD家族保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

對亞麻LuFADs基因家族進行保守結(jié)構(gòu)域分析 （表2，圖2）可知，同一亞族中保守結(jié)構(gòu)域的分布較為相似，LuADS亞組中均包含motif-1、motif-3和motif-7；LuSTAD亞組中均只含motif-10；LuDES和LuSLD亞組中含有motif-2；LuFAD6亞組中，除LuFAD6-3外其他基因均含有motif-1、motif-2、motif-4、motif-5、motif-6、motif-8和motif-9；LuFAD4-1和LuFAD4-2不含有motif。

對LuFADs基因家族進行外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析（圖2）顯示，在LuFAD6亞組中，只有LuFAD6-4含有2個內(nèi)含子，其余12個基因均只有外顯子；LuFAD4-1、LuFAD4-2和LuSLD系列沒有內(nèi)含子，剩余基因有不同數(shù)量（1～7，9）內(nèi)含子。LuSLD（1～3）的CDS區(qū)最長，大于1 000 bp；LuADS10的基因長度最長，約為4 500 bp，LuFAD6-3基因最短，不足500 bp。

綜合家族系統(tǒng)進化可以看出，同一亞組中的基因具有較為相似的結(jié)構(gòu)。LuSTAD亞組中均含有2個內(nèi)含子。LuADS亞組中，除LuADS8的顯子數(shù)量為4外，其余均為5。LuFAD6C-1和LuFAD6C-2內(nèi)含子最多，具有9個。LuADS10的內(nèi)含子序列最長。

2.4? ?LuFADs基因家族成員染色體定位和亞細胞預測

由圖3可知，LuFADs基因家族隨機分布于除第2號和5號染色體（Chr2、Chr5）之外的所有亞麻染色體上，分布廣泛。Chr4、Chr9、Chr10和Chr13上各自有1個基因成員，Chr7上有2個基因，Chr3、Chr11和Chr12上各分布著3個基因，Chr14上有4個基因，Chr1和Chr15各為5個基因。Chr6和Chr8的LuFADs家族成員最多，均為7個，其中在Chr6上LuFAD6-1、LuFAD6-4、LuFAD6-6、LuFAD6-8、LuFAD6-10和LuFAD6-12距離較近，在Chr8染色體上LuFAD6-2、LuFAD6-5、LuFAD6-7、LuFAD6-9、LuFAD6-11和LuFAD6-13的距離較為接近。

對LuFADs家族成員進行亞細胞定位預測（表3）可知，定位結(jié)果分為4類，包括葉綠體、細胞質(zhì)、細胞核和線粒體。定位在葉綠體上的家族成員最多，共32個基因。細胞質(zhì)上7個基因成員，細胞核上3個基因，線粒體上1個基因。其中LuFAD6、LuFAD4和LuSTAD成員的基因均定位在葉綠體上。

2.5&nbsp; ?LuFAD啟動子順式作用元件分析

對LuFADs進行啟動子順式作用元件分析 （圖4）可知，該基因家族含有的元件可分為4類，光響應元件（G-box、Box 4、GATA-motif、I-box、TCT-motif、Sp1、TCCC-motif、GT1-motif）、激素響應元件（TGACG-motif、CGTCA-motif、ABRE、TGA-element、AuxRR-core、TCA-element、P-box、GARE-motif、TATC-box）、脅迫響應元件（MBS、TC-rich repeats、LTR、ARE、GC-motif）和生長發(fā)育相關(guān)元件（A-box、O2-site、CCAAT-box）。其中抗氧化反應元件ARE數(shù)量最多（89），其次是G-box（77），Box 4（74）排第3，TGACG-motif和CGTCA-motif在基因家族中的含量分布數(shù)量相同（72）?；騆uFAD3-3含元件數(shù)最多，為35個；LuADS3和LuADS7的元件數(shù)最少，均為6個。

3? ?討論與結(jié)論

近年來，F(xiàn)AD基因家族在多種植物物種中得到鑒定驗證，其家族成員數(shù)量不盡相同，如甜蕎麥中10個［14 ］，大豆中29個［21 ］，陸地棉中41個［22 ］。本研究分析鑒定了亞麻43個LuFADs基因家族成員，gDNA長度為456～4 547 bp，編碼的氨基酸為152～453個。等電點（pI）6.07～10.26。除LuSLD（1～4）系列和LuFAD6-4，其余38個家族成員均為親水蛋白。有研究者對茄子的FAD家族序列進行理化性質(zhì)分析，表明分子量與成員所含氨基酸數(shù)量成正比，大部分家族成員為親水性蛋白，這與本研究結(jié)果相似［15 ］。系統(tǒng)發(fā)育樹分析聚為4類，同一亞族中保守結(jié)構(gòu)域的分布較為相似，在Δ7/Δ9去飽和酶亞族中均含motif-1、motif-3和motif-7，在SAD去飽和酶亞族中均只含motif-10；在“前端”去飽和酶亞族中只含motif-2，在Δ12/ω-3去飽和酶亞族中LuFAD6、LuFAD6C、LuFAD3C和LuFAD3D各分支的保守結(jié)構(gòu)域相似。Liu等［23 ］用最大似然法將核桃FADs蛋白序列與擬南芥FADs蛋白序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析JrFADs基因家族，也分為4個亞家族，與本研究相一致。

對基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析表明，同一亞組中的基因具有較為相似的基因結(jié)構(gòu)。Xue? ? ? 等［10 ］對油菜FAD基因家族進行基因結(jié)構(gòu)分析，各個FAD亞家族的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)高度保守。Liu等［23 ］分析JrFADs基因家族，結(jié)果表明同一亞家族中的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)。Cheng等［24 ］對香蕉同一亞科中的MaFAD家族成員進行分析，顯示出相似的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和內(nèi)含子相，并且它們編碼的蛋白質(zhì)由相似的基序組成。

染色體定位和亞細胞預測發(fā)現(xiàn)，LuFADs基因家族隨機地分布在除Chr2和Chr5之外的所有亞麻染色體上。亞細胞定位在葉綠體上的家族成員最多，共有32個基因。Xue等［10 ］ 的研究表明，油菜3個蕓薹屬物種中FAB2、FAD4、FAD6和FAD8蛋白質(zhì)的所有成員均位于葉綠體中。啟動子順式作用元件分析得出，抗氧化反應元件ARE的數(shù)量最多，為89個，基因LuFAD3-3所含元件數(shù)最多。Yasemin等［25 ］對向日葵的FAD基因家族的研究表明，主要定位在葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中，其中FAB2家族成員位于葉綠體中，可能與FAD在細胞不同部位脂肪酸去飽和中的作用有關(guān)。綜合分析向日葵、芝麻、油菜、可可樹和亞麻的FAD基因家族，在氧化還原過程、脂肪酸生物合成過程或脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮作用，這與本研究結(jié)果相似。

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