十棗湯UPLC指紋圖譜化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

李文靜 ，王艷萍 ，劉榮宏 ，侯玉嬌 ，洪博 ，葛鵬玲 劉吉成

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006

十棗湯始載于《傷寒雜病論》，由甘遂、京大戟、大棗及芫花4味中藥組成，是治療水結(jié)懸飲證的經(jīng)典方劑，為攻下逐水之峻劑，在瀉水逐飲方面有顯著療效[1-2]。臨床研究表明，十棗湯在胸腔積液和肝硬化腹腔積液方面有較好的臨床療效[3-6]，用于肝硬化頑固性腹水也有較好療效[7-8]，但方中甘遂、芫花、大戟的毒性較大，限制了該方的臨床應(yīng)用。

目前關(guān)于十棗湯的研究大部分集中在臨床應(yīng)用、藥理毒理、單味藥化學(xué)成分種類和結(jié)構(gòu)方面，而對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究甚少，且目前尚未見有關(guān)十棗湯指紋圖譜的研究報(bào)道。因此，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）建立十棗湯指紋圖譜，指認(rèn)其藥效成分，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯質(zhì)量進(jìn)行比較，為十棗湯的內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-30AD超高效液相色譜儀（日本島津公司），METTLER TOLEDO精密天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)），KH-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司），TGL-18C-C型臺(tái)式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），SCT型數(shù)顯攪拌電熱套（菏澤市精科儀器有限公司）。

牡荊素對(duì)照品（批號(hào)190911）、異牡荊苷對(duì)照品（批號(hào)191218）、巨大戟醇對(duì)照品（批號(hào)200710）、咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)190503）、瑞香素對(duì)照品（批號(hào)200209）、傘形花內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)190621）、木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)190721）、槲皮苷對(duì)照品（批號(hào)191115）、木犀草素對(duì)照品（批號(hào)190711）、西瑞香素對(duì)照品（批號(hào)200516）、芫花素對(duì)照品（批號(hào)200518），北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不低于98%。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），美國(guó)Fairfield試劑有限公司；甲酸（色譜純），美國(guó)Dikma公司；超純水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。甘遂、京大戟、芫花、大棗均購(gòu)于其道地產(chǎn)地或主產(chǎn)區(qū)，經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院郭麗娜教授鑒定，京大戟為大戟科大戟屬大戟Euphorbia pekinensisRupr.的根，甘遂為大戟科大戟屬植物甘遂Euphorbia kansuiT.N.Liou ex S.B.Ho的塊根，芫花為瑞香科瑞香屬植物芫花Daphne genkwaSieb.et Zucc.的花蕾，大棗為鼠李科棗屬大棗Ziziphus jujubaMill.的果實(shí)。13批十棗湯編號(hào)為S1～S13，批號(hào)為2020091301～2020091313，配伍藥材產(chǎn)地信息見表1。

表1 13批十棗湯配伍藥材產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～12 min，10%～15%乙腈；12～16 min，15%～19%乙腈；16～23 min，19%～38%乙腈；23～29 min，38%～80%乙腈；29～35 min，80%～7%乙腈），柱溫40 ℃，流速0.4 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 十棗湯樣品溶液

取芫花、甘遂、京大戟各3 g，大棗10枚（約3～4 g/枚）。芫花、甘遂、京大戟研磨成粉末；大棗放入600 mL水中煎煮，待水約300 mL時(shí)熄火，去渣，加入芫花、甘遂、京大戟粉末，即得。按上述方法將不同產(chǎn)地藥材制成13批十棗湯樣品溶液。

2.2.2 供試品溶液

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下十棗湯300 mL，向其中加入無(wú)水乙醇700 mL，小火煮至微沸。冷凝回流1 h，冷凝結(jié)束后進(jìn)行脫水抽濾，利用濾紙除去濾渣，加熱將濾液濃縮至50 mL，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液

取各對(duì)照品，精密稱定，置容量瓶中，加適量甲醇，混合后搖勻，得到濃度分別為巨大戟醇3 mg/mL、咖啡酸10 mg/mL、瑞香素1 mg/mL、傘形花內(nèi)酯1 mg/mL、牡荊素1 mg/mL、異牡荊苷1 mg/mL、木犀草苷1 mg/mL、槲皮苷1 mg/mL、木犀草素1 mg/mL、西瑞香素2 mg/mL、芫花素1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取同一份十棗湯供試品溶液（S1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄UPLC圖，以8號(hào)峰傘形花內(nèi)酯為參照峰（S），計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、傘形花內(nèi)酯、牡荊素、異牡荊苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素和芫花素保留時(shí)間RSD分別為0.18%、 0.10%、 0.11%、 0.33%、 0.44%、 1.48%、0.94%、0.40%、0.13%、0.11%、0.08%，峰面積RSD分別為 0.96%、0.96%、0.21%、1.17%、1.59%、0.76%、0.72%、1.03%、1.04%、1.19%、0.21%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取制備好的同一批十棗湯樣品溶液（S1）6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以8號(hào)峰傘形花內(nèi)酯色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、傘形花內(nèi)酯、牡荊素、異牡荊苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素和芫花素保留時(shí)間RSD分別為1.13%、0.77%、0.39%、 0.77%、 1.11%、 0.90%、 1.16%、 1.78%、1.37%、1.47%、0.79%，峰面積RSD分別為0.43%、1.91%、 1.05%、 1.81%、 1.28%、 1.93%、 1.69%、1.83%、0.54%、1.60%、1.86%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取制備好的同一批十棗湯樣品溶液（S1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以8號(hào)峰傘形花內(nèi)酯色譜峰為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD，巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、傘形花內(nèi)酯、牡荊素、異牡荊苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素和芫花素保留時(shí)間RSD分別為1.35%、0.91%、0.27%、0.94%、1.62%、 0.47%、 1.80%、 1.23%、 0.99%、 1.60%、1.45%，峰面積RSD分別為1.87%、1.00%、1.32%、1.02%、 1.37%、 1.10%、 1.82%、 1.79%、 1.02%、0.79%、1.92%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

取13批十棗湯樣品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012版），采用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜。共確定31個(gè)共有峰，綜合考慮峰面積及色譜峰分離度，確定8號(hào)峰傘形花內(nèi)酯色譜峰為參照峰（S），通過(guò)與對(duì)照品色譜圖比對(duì)，指認(rèn)出11個(gè)成分，分別為1號(hào)峰巨大戟醇、2號(hào)峰咖啡酸、4號(hào)峰瑞香素、8號(hào)峰傘形花內(nèi)酯、10號(hào)峰牡荊素、11號(hào)峰異牡荊苷、12號(hào)峰木犀草苷、15號(hào)峰槲皮苷、23號(hào)峰木犀草素、26號(hào)峰西瑞香素、29號(hào)峰芫花素。見圖1。以對(duì)照指紋圖譜為參照，計(jì)算13批十棗湯樣品圖譜相似度分別為0.958、0.905、0.911、0.955、0.879、0.957、0.941、0.907、0.914、0.924、0.926、0.915、0.906，相似度良好，均在0.85以上，表明所建立的十棗湯指紋圖譜質(zhì)量穩(wěn)定，可以反映其特征。

圖1 十棗湯UPLC圖譜

2.3.5 聚類分析

將13批不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯樣品中31個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS24.0軟件，對(duì)13批樣品的共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間連接法，測(cè)量區(qū)間為平方歐氏距離，聚類結(jié)果見圖2。當(dāng)平方歐氏距離為15時(shí)，可將13批十棗湯標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品分為2類，其中S1～S3、S5～S13聚為一類，S4為一類。

圖2 13批十棗湯樣品聚類樹狀圖

2.3.6 主成分分析

將13批十棗湯樣品指紋圖譜的共有峰峰面積通過(guò)SPSS24.0軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理后，通過(guò)降維因子分析，計(jì)算特征值、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果見表2。不同產(chǎn)地藥材制成的樣品中前4個(gè)成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為95.100%，能基本反映出樣品的主要信息。利用SIMCA-P14.1軟件繪制13批十棗湯樣品主成分得分圖，結(jié)果見圖3?？梢钥闯觯?3批不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯樣品明顯分布于上下2個(gè)區(qū)域，可將樣品分為2類，與聚類分析結(jié)果基本一致，表明不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯的成分存在差異。

表2 不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯樣品主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率

圖3 13批十棗湯樣品主成分得分圖

2.3.7 偏最小二乘-判別分析

為進(jìn)一步比較不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯之間的差異，本研究采用偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）對(duì)不同批次十棗湯樣品進(jìn)行分析。在建立的PLS-DA模型中，R2X和R2Y分別為0.842和0.975，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q2為0.877，表明建立的模型預(yù)測(cè)能力較好。PLS-DA得分圖見圖4。13批不同產(chǎn)地藥材制成的十棗湯樣品被明顯劃分為2個(gè)區(qū)域，與聚類分析、主成分分析結(jié)果基本一致。

圖4 13批十棗湯樣品PLS-DA得分圖

3 討論

《本草綱目》言：“十棗湯驅(qū)逐里邪，使水氣自大小便而泄，乃《內(nèi)經(jīng)》所謂潔凈府，去菀陳莝法也。”芫花、大戟、甘遂三藥均性烈、有毒，逐水泄?jié)褡饔媚苤边_(dá)水飲窠囊隱僻之處，但可徐徐用之，取效甚捷，不可過(guò)劑，泄人真元也。本研究指認(rèn)的十棗湯中巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、傘形花內(nèi)酯、牡荊素、異牡荊苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素、芫花素成分為主要活性成分，具有攻逐水飲之功效。方中芫花、大戟、甘遂藥材的種植產(chǎn)地越來(lái)越多，但由于產(chǎn)地的氣候條件和地理?xiàng)l件等不同因素，藥材質(zhì)量有所差別，導(dǎo)致十棗湯質(zhì)量參差不齊。如何盡量減少或避免出現(xiàn)這種現(xiàn)象是目前亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測(cè)定等方法尚無(wú)法解決這一問(wèn)題。建立中藥指紋圖譜能較全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)。目前，十棗湯質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還不夠完善，未形成完整、統(tǒng)一、明確的制備工藝和治療規(guī)范，給該制劑的開發(fā)和推廣造成很大困難。

中藥指紋圖譜的建立方法有HPLC、UPLC、液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）等[9-10]，HPLC儀器分析成本相對(duì)較低，但分析時(shí)間較長(zhǎng)，且有成分存在拖尾現(xiàn)象；LC-MS分析成本較高，不適合廣泛推廣使用；UPLC靈敏度較HPLC有所提高，且提高了分析效率，使流動(dòng)相消耗減少，其色譜峰峰形也能較好地呈現(xiàn)出來(lái)。因此，本研究采用UPLC建立十棗湯的指紋圖譜，有較強(qiáng)的實(shí)用性。

前期研究分別對(duì)甲醇-水（70∶30）、乙腈-水（65∶35）、0.1%甲酸-水，乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動(dòng)相的組成進(jìn)行比較，結(jié)果表明乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，系統(tǒng)的分離效果最好且保留時(shí)間更理想，各峰的分離度及峰形都更好。因此，以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

前期通過(guò)查閱文獻(xiàn)，分別對(duì)柱溫38、39、40、41、42 ℃進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，色譜峰數(shù)量最多，各組的色譜峰與相鄰峰分離度均達(dá)到要求，各類成分也可得到較好分離，因此選擇柱溫為40 ℃。

通過(guò)前期研究考察，采用DAD在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，并參考芫花、大戟、甘遂及大棗的檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供試品在254 nm波長(zhǎng)處色譜峰數(shù)量最多，各峰之間的分離度較理想，故選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究建立的UPLC十棗湯指紋圖譜分析方法簡(jiǎn)單方便、準(zhǔn)確、可靠，可有效反映十棗湯的定性特征，能夠?qū)κ畻棞馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，可為進(jìn)一步探究十棗湯的藥理作用和臨床應(yīng)用提供依據(jù)，也為經(jīng)典名方的開發(fā)和研究提供思路。