雄黃抗腫瘤作用及分子機(jī)制研究進(jìn)展

趙新月 ，田穎穎 ，左澤平 ，劉闖 ，于尚玥 ，李依林 ，田時(shí)秋 ，裴海鸞 ，王志斌，

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029； 2.北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，北京 100079

國際腫瘤研究所（International Agency for Research on Cancer）發(fā)布的GLOBOCAN 2020癌癥發(fā)病率和病死率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)提到，預(yù)計(jì)2040年全球癌癥患者將達(dá)2 840萬例[1]。根據(jù)全球疾病目前的排名和發(fā)展趨勢，癌癥可在本世紀(jì)超過心血管疾病，成為大多數(shù)國家公民過早死亡的主要原因[2]。盡管全球醫(yī)療手段的發(fā)展已使癌癥治療取得巨大進(jìn)步，癌癥的發(fā)展勢頭有所放緩[3]，但惡性腫瘤依舊是許多國家公民的第二大死亡原因。目前，外科手術(shù)和化療是主要的治療手段，但由于術(shù)后并發(fā)癥、化療藥物毒性及不良反應(yīng)，治療效果尚不理想。中醫(yī)藥作為我國防治腫瘤的重要方法，具有整體性、平衡性、多系統(tǒng)和多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[4]，以扶正、解毒、化痰、活血化瘀等治法抑制腫瘤細(xì)胞生長[5]。尋找新型、低毒、高效的抗腫瘤藥物已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和中醫(yī)藥領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。

雄黃始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為硫化物類礦物雄黃族雄黃，主含四硫化四砷（As4S4）。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，不同形式的砷化物包括雌黃（As2S3）和亞砷酸鹽（As2O3/ATO）被廣泛應(yīng)用，我國古代用其治療牛皮癬、梅毒、風(fēng)濕病、蛇蟲咬傷、驚癇及瘧疾等?，F(xiàn)代醫(yī)藥領(lǐng)域已有60多種砷劑應(yīng)用于臨床[6]，但因不良反應(yīng)問題，砷劑的抗腫瘤研究曾一度放緩[7]。直至ATO成功治療急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）的研究發(fā)布，方突顯了砷類藥物作為抗癌劑的藥用價(jià)值[8-10]。雄黃作為傳統(tǒng)中藥，在耐藥性、選擇性抑制腫瘤細(xì)胞等方面表現(xiàn)較好，且對正常細(xì)胞的毒性作用較輕微。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，各種納米雄黃不斷涌現(xiàn)[11]，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有較大應(yīng)用潛力。近年來國內(nèi)外對雄黃抗腫瘤研究頗多。本文重點(diǎn)綜述雄黃誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤干細(xì)胞分化和血管生成以及協(xié)同其他藥物抗腫瘤的作用及分子機(jī)制，以期為雄黃安全合理臨床應(yīng)用提供參考。

1 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種清除損傷細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡形式，由3個(gè)階段組成[12]：起始、轉(zhuǎn)運(yùn)和執(zhí)行。此過程在應(yīng)激刺激下誘導(dǎo)，癌前病變中的DNA損傷引起的細(xì)胞凋亡可去除潛在的有害細(xì)胞，從而阻止腫瘤生長。細(xì)胞凋亡的機(jī)制是復(fù)雜的，涉及許多觸發(fā)途徑，包括由Caspase介導(dǎo)的途徑、凋亡調(diào)控因子的表達(dá)途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑。

1.1 影響Caspase依賴性凋亡通路

Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族的重要成員，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)分子、凋亡的執(zhí)行者，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信息時(shí)，兩者可被激活。活化的Caspase-3和Caspase-9通過激活、破壞某些酶或細(xì)胞骨架蛋白等方式，導(dǎo)致特征性DNA斷裂，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Cheng等[13]利用As4S4處理Siha宮頸癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其對Siha細(xì)胞系細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)呈劑量依賴性，且與細(xì)胞色素C（Cyt C）釋放增加和Caspase-3、Caspase-9激活相關(guān)。此外，As4S4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受廣譜Caspase抑制劑的抑制。Ding等[14]基于As4S4處理4種人實(shí)體瘤細(xì)胞系，包括MKN45胃癌細(xì)胞系、A375惡性黑色素瘤細(xì)胞系、8898胰腺癌細(xì)胞系及HepG2肝癌細(xì)胞系，結(jié)果表明，As4S4可顯著抑制實(shí)體瘤細(xì)胞的增殖，并通過激活Caspase-3和Caspase-9活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Gong等[15]發(fā)現(xiàn)As4S4可顯著抑制K562人慢性髓系白血?。–ML）細(xì)胞系的增殖。miRNA為內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，直接結(jié)合靶基因，對其mRNA進(jìn)行剪切修飾或抑制翻譯過程調(diào)控基因的表達(dá)[16]，As4S4通過下調(diào)miRNA表達(dá)，增加Caspase-3的活性及下調(diào)Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，以誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，從而靶向治療CML。

1.2 調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控因子表達(dá)

細(xì)胞凋亡可通過調(diào)節(jié)凋亡調(diào)控因子的表達(dá)，如通過凋亡因子誘發(fā)Bcl-2家族活化，誘導(dǎo)組蛋白γ-H2AX磷酸化[17]，調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)Prohibitin蛋白[18]和凋亡抑制因子Survivin[19]等實(shí)現(xiàn)，抗凋亡和促凋亡蛋白之間的平衡調(diào)節(jié)是決定細(xì)胞是否經(jīng)歷凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)。

1.2.1 誘發(fā)Bcl-2家族活化

目前認(rèn)為，線粒體凋亡通路是通過凋亡因子誘發(fā)Bcl-2家族的活化[20]，致線粒體膜損傷、膜電位下降而釋放Cyt C，Cyt C與凋亡酶激活因子結(jié)合可活化Caspase-9并最終激活效應(yīng)因子Caspase-3，觸發(fā)凋亡。王嫄等[21]使用As4S4（25 μmol/L）處理NB4-R1人急性早幼粒細(xì)胞細(xì)胞系，可使Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax表達(dá)上調(diào)，以及將Caspase-3活性切割成活性片段，表明As4S4可有效誘導(dǎo)NB4-R1細(xì)胞凋亡。石利利等[22]使用As4S4干預(yù)SU-DHL-4彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)所有給藥組均出現(xiàn)典型的凋亡小體，80 μmol/L組可見部分壞死細(xì)胞。同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，提示其可顯著誘導(dǎo)SU-DHL-4細(xì)胞凋亡。An等[23]通過共沉淀法制備直徑約80 nm的納米雄黃，用其干預(yù)大鼠膠質(zhì)瘤（C6）細(xì)胞，表明納米雄黃可通過誘導(dǎo)Bax表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。楊玥等[24]研究表明，納米雄黃可通過Caspase依賴途徑誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)P53和Bax表達(dá)。

1.2.2 促進(jìn)γ-H2AX蛋白磷酸化

當(dāng)DNA損傷導(dǎo)致雙鏈斷裂時(shí)[17]，組蛋白H2AX也會隨之磷酸化。H2AX是H2A蛋白家族的變體，是核小體中組蛋白八聚體的組成部分，可被PI3K通路中的激酶磷酸化，γ-H2AX新型磷酸化蛋白是DNA修補(bǔ)蛋白的第一步，可作為DNA損傷的生物標(biāo)志物。Karaolanis等[25]利用γ-H2AX檢測將正常組織轉(zhuǎn)化為癌前組織，并因此轉(zhuǎn)化為惡性組織的生物標(biāo)志物。低濃度的ATO和納米雄黃可增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量，上調(diào)γ-H2AX表達(dá)，提示ATO和納米雄黃可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

1.2.3 上調(diào)Prohibitin蛋白表達(dá)

人類真核生物抑制素Prohibitin-1和Prohibitin-2是一種膜蛋白[18]，參與多種細(xì)胞功能，包括能量代謝、增殖、凋亡過程，調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運(yùn)的細(xì)胞信號、控制轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞周期、線粒體內(nèi)在凋亡途徑。He等[26]使用As4S4干預(yù)APL細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Prohibitin（PHB）在經(jīng)As4S4處理的細(xì)胞中表達(dá)增加，PHB過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低早幼粒細(xì)胞白血病-視黃酸受體-α（PML-RARα）融合蛋白的表達(dá)，表明PHB在促進(jìn)APL細(xì)胞凋亡中具有顯著抗腫瘤活性。此外，Tian等[27]發(fā)現(xiàn)，As4S4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡伴隨著視黃酸抗性NB4-R1細(xì)胞中SET基因的mRNA和蛋白表達(dá)降低。蛋白磷酸酶2（PP2A）是一種促凋亡因子，PML-RARα是一種抗凋亡因子，其結(jié)果提示As4S4誘導(dǎo)的NB4-R1細(xì)胞凋亡是通過下調(diào)SET蛋白表達(dá)，增加PP2A、降低PML-RARα表達(dá)，致細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

1.2.4 下調(diào)Survivin因子表達(dá)

Survivin是一種新的IAP基因，在腫瘤中顯著高表達(dá)，并且與其蛋白水平相關(guān)。因此，Survivin作為腫瘤治療的靶標(biāo)，是惡性腫瘤對因治療的理想選擇。王勝玫等[19]研究發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞經(jīng)納米雄黃處理24 h后，Survivin表達(dá)顯著下降，提示其可通過該靶點(diǎn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

1.3 誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種復(fù)雜的動態(tài)細(xì)胞器[28]，其功能包括蛋白質(zhì)折疊、Ca2+儲存、脂質(zhì)和碳水化合物代謝。氧化還原失衡、蛋白質(zhì)糖基化改變可導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，該情況稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），因此它與自噬、缺氧信號傳導(dǎo)或活性氧反應(yīng)密切相關(guān)。

1.3.1 上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白編碼基因表達(dá)

Wang等[29]利用具有改善的水溶性和生物利用度的雄黃量子點(diǎn)（RQDs），將人子宮內(nèi)膜癌JEC細(xì)胞暴露于不同濃度的RQDs中，其結(jié)果提示RQDs可誘導(dǎo)JEC細(xì)胞的抗增殖活性，引發(fā)JEC細(xì)胞的空泡化和ERS。GADD153為生長停滯/DNA損傷誘導(dǎo)基因153，也稱C/EBP同源蛋白，RQDs引起的ERS可上調(diào)GADD153和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78（GRP78）的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致JEC細(xì)胞凋亡和壞死。Qin等[30]使用RQDs干預(yù)HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)給藥濃度為15 μg/mL時(shí)，20%的細(xì)胞發(fā)生凋亡，30 μg/mL時(shí)60%的細(xì)胞壞死，并出現(xiàn)Bcl-2表達(dá)降低、Bax表達(dá)升高，線粒體膜電位喪失，應(yīng)激基因C/EBP-HP10和GRP78表達(dá)增加。提示ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死可有效致使RQDs抑制HepG2細(xì)胞增殖。

1.3.2 誘導(dǎo)活性氧積累

活性氧在腫瘤細(xì)胞的凋亡中扮演著重要角色[31]，可通過活化的氧化應(yīng)激來增強(qiáng)細(xì)胞毒性，破壞細(xì)胞大分子和DNA，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Wang等[32]基于As4S4和As3+組合對NB4和原代APL細(xì)胞凋亡和分化的影響，證實(shí)As4S4可誘導(dǎo)活性氧積累，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，Song等[33]使用微生物內(nèi)在的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，得到了As4S4轉(zhuǎn)化溶液（RTS），發(fā)現(xiàn)其可通過抑制細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致大量活性氧積累，阻斷G2/M進(jìn)程、激活細(xì)胞周期阻滯和線粒體凋亡通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬

自噬是一種分解代謝過程，將蛋白質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)成分和細(xì)胞器傳遞到溶酶體進(jìn)行降解和再循環(huán)，有30多個(gè)自噬相關(guān)基因控制自噬[28]，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2依賴性IRE1和c-JunN-末端激酶（JNK）的活化導(dǎo)致Bcl-2磷酸化，使自噬調(diào)節(jié)蛋白Beclin-1解離，PI3K復(fù)合物活化和自噬啟動。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)經(jīng)RQDs處理后的JEC細(xì)胞，自噬調(diào)節(jié)蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg12表達(dá)發(fā)生顯著變化，提示RQDs誘導(dǎo)JEC細(xì)胞自噬是其抗癌作用的機(jī)制之一，表明RQDs具有自噬誘導(dǎo)劑的應(yīng)用潛能。Wang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃可通過下調(diào)活性氧和缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α的水平來誘導(dǎo)自噬，導(dǎo)致BCR-ABL抗凋亡基因降解、CML細(xì)胞系分化，從而抑制白血病細(xì)胞增殖，改善CML患者的造血功能。Pastorek等[36]通過比較納米雄黃和ATO對人黑色素瘤細(xì)胞系BOWES和A375的作用，證實(shí)納米雄黃和ATO對細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)呈劑量依賴性，低劑量（0.3 μmol/L）時(shí)可增加溶酶體活性并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

3 阻滯腫瘤細(xì)胞周期

細(xì)胞周期阻滯是As4S4抗腫瘤作用的重要機(jī)制，研究表明As4S4可通過阻滯細(xì)胞于有絲分裂期[22]，并調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白實(shí)現(xiàn)[22，36]。石利利等[22]使用As4S4干預(yù)SU-DHL-4細(xì)胞株，結(jié)果表明20、40、80 μmol/L下均能抑制SU-DHL-4的增殖。經(jīng)As4S4處理細(xì)胞48 h后，Bcl-2表達(dá)下調(diào)、Bax和Caspase-3表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞周期受阻于S期。An等[23]研究表明納米雄黃可顯著增加S期和G2/M期細(xì)胞比例，降低G0/G1期細(xì)胞比例，從而抑制C6細(xì)胞增殖。Wang等[32]研究表明As4S4可阻止NB4和原代APL細(xì)胞G1/S轉(zhuǎn)換。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)RQDs可在JEC細(xì)胞中誘導(dǎo)G2期和S期阻滯。Pastorek等[36]研究顯示，BOWES和A375細(xì)胞經(jīng)納米雄黃處理后，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期G2/M期阻滯，以及改變IκB、Akt、ERK1/2、p38和JNK激酶的磷酸化，降低線粒體膜電位，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。李立杰等[37]使用不同濃度（5、10、20、40 mg/L）納米雄黃干預(yù)3種不同的宮頸癌細(xì)胞系（Caski/HPV16+，腺癌；Hela/HPV18+，鱗狀細(xì)胞癌；C33A/HPV-，腺癌），發(fā)現(xiàn)其均可抑制不同宮頸癌細(xì)胞系的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且高濃度納米雄黃（20、40 mg/L）可誘導(dǎo)HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的G2/M期阻滯。Wang等[38]通過構(gòu)建真核SET表達(dá)質(zhì)粒（pEGFP?N1?SET）并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T人胚腎細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)SET過表達(dá)增加了S期和G2/M期293T細(xì)胞百分比，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，且對As4S4誘導(dǎo)的凋亡的易感性降低。此外，使用As4S4（25 μmol/L）處理0、24、48 h的NB4-R1細(xì)胞，可增加S期細(xì)胞，減少G0/G1期細(xì)胞。

4 抑制腫瘤細(xì)胞增殖

抑制腫瘤細(xì)胞增殖可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路、NFATc3/c-Myc通路、STAT3信號通路實(shí)現(xiàn)。Hu等[39]用As4S4處理胃癌細(xì)胞，結(jié)果表明其可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。胃癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路的活性受到過表達(dá)circRNA_ASAP2靶點(diǎn)和As4S4的影響，Wnt激動劑SKL2001可逆轉(zhuǎn)由低表達(dá)circRNA_ASAP2引起的胃癌細(xì)胞行為變化，從而證實(shí)As4S4可通過調(diào)節(jié)circRNA_ASAP2/Wnt/β-catenin通路在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用，進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。齊元富等[40]研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃對A549人肺癌細(xì)胞系的β-catenin和c-Myc表達(dá)均有明顯抑制作用。初步揭示納米雄黃可阻斷Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低其關(guān)鍵因子β-catenin及下游c-Myc基因的表達(dá)，從而有效抑制A549細(xì)胞增殖。Zhang等[41]通過探討NFAT在胃癌中的作用，發(fā)現(xiàn)As4S4可抑制NFATc1、NFATc3和NFATc4表達(dá)，調(diào)節(jié)p53和NFATc2表達(dá)，并在不同的胃癌細(xì)胞系（AGS、MGC803、MKN28、MKN45和SGC7901）中表現(xiàn)不同。此外，NFATc3的表達(dá)水平與As4S4的敏感性有關(guān)，可調(diào)節(jié)c-Myc表達(dá)，提示As4S4可通過NFATc3/c-Myc通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖。Wu等[42]發(fā)現(xiàn)As4S4可通過抑制細(xì)胞因子信號通路抑制因子1甲基化和下游JAK2/STAT3信號通路，對U266人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞表現(xiàn)出良好的抑制作用。Wang等[43]通過使用氧化亞鐵硫桿菌的微生物浸出工藝，得到As4S4浸出液，用于干預(yù)CML細(xì)胞系K562和MDR-CML細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其可下調(diào)K562/ADM細(xì)胞中多藥耐藥基因MDR1的mRNA和P-糖蛋白（P-gp）過表達(dá)，同時(shí)調(diào)節(jié)As4S4浸出液轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白水通道蛋白9的表達(dá)，從而產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。

5 調(diào)控腫瘤細(xì)胞分化

細(xì)胞分化在腫瘤生長過程中的作用機(jī)制可分為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化[32]和抑制腫瘤干細(xì)胞分化[44]2個(gè)層面，腫瘤細(xì)胞分化有利于降低患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞數(shù)量，而腫瘤干細(xì)胞/癌癥干細(xì)胞（TSC/CSC）是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，因此抑制TSC分化可減少腫瘤細(xì)胞的生成。

5.1 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化

隨著臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)室研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)雄黃干預(yù)腫瘤細(xì)胞存在劑量依賴的雙重效應(yīng)[32]，即高濃度可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，低劑量長時(shí)間作用則可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的不完全分化。Wang等[32]研究As4S4和As3+組合對NB4和原代APL細(xì)胞的影響，低濃度時(shí)（0.1～0.4 μmol/L）可誘導(dǎo)2種細(xì)胞分化，與As4S4或As3+處理組相比，聯(lián)合用藥明顯促進(jìn)2種細(xì)胞的凋亡和分化。Wang等[45]將納米雄黃應(yīng)用于ML細(xì)胞系K562、K562/AO2和CML患者骨髓原代細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其可通過誘導(dǎo)CD11b、CD235a、Ter119和CD41a水平上調(diào)，降低骨髓中白血病細(xì)胞的百分比，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多向分化和凋亡。

5.2 抑制腫瘤干細(xì)胞分化

近年來，癌癥生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，代謝性葡萄糖重編程是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)，而通過藥物干預(yù)TSC的葡萄糖代謝及其相關(guān)的潛在機(jī)制仍然有待發(fā)掘[44]。Yang等[46]使用納米雄黃干預(yù)肺癌干細(xì)胞（LCSCs），發(fā)現(xiàn)其可抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)葡萄糖代謝，抑制代謝重編程相關(guān)蛋白表達(dá)，在體外和體內(nèi)均可下調(diào)HIF-1α和PI3K/Akt/mTOR通路的表達(dá)，并通過抑制腫瘤生長改變腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，從而抑制HIF-1α的表達(dá)。李慧杰等[47]研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃可抑制代謝重編程關(guān)鍵因子HIF-1α表達(dá)，下調(diào)c-Myc基因、上調(diào)p53基因表達(dá)，同時(shí)抑制PI3K/Akt/mTOR通路，GLUT1、PDK1、PFK、PKM、PDH、LDH等相關(guān)蛋白及相關(guān)酶的表達(dá)，從而降低LCSCs的葡萄糖消耗。LCSCs以CD133+為主，約4%的CD133+細(xì)胞可表達(dá)P-gp及乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）。結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的納米雄黃作用后，CD133+細(xì)胞的相對比例增加，P-gp和BCRP的表達(dá)降低。

6 降低腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲能力

在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中，除黏附能力缺失[48]，腫瘤細(xì)胞還通過破壞細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接及廣泛的細(xì)胞骨架重組，獲得侵襲及轉(zhuǎn)移的能力。Zhang等[49]選擇人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS和MGC803作為研究對象，經(jīng)As4S4處理后，E-cadherin和KLF4表達(dá)上調(diào)，而β-catenin、VEGF、CD34和Sp1表達(dá)下調(diào)，且體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致，表明As4S4通過阻斷腫瘤細(xì)胞黏附，降低腫瘤細(xì)胞破壞基底膜的能力，從而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Xi等[50]通過納米雄黃干預(yù)小鼠乳腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制乳腺癌4T1細(xì)胞的遷移和侵襲，下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)。同時(shí)，在小鼠乳腺癌轉(zhuǎn)移模型中，納米雄黃可有效抑制腫瘤細(xì)胞向肺、肝組織轉(zhuǎn)移。

7 抑制腫瘤血管生成

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在調(diào)節(jié)血管生成的過程中起到重要作用[33]，能抑制體內(nèi)及體外新生血管形成。腫瘤血管生成系統(tǒng)中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9[49]與堿性成纖維細(xì)胞生長因子（b-FGF）[33]聯(lián)合作用，可作為血管生成與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Zhang等[49]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，As4S4可明顯抑制MMP-2和MMP-9活性，下調(diào)VEGF表達(dá)，從而抑制其血管生成。劉寨東等[51]研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃能抑制A549細(xì)胞的MMP-9表達(dá)，且隨濃度增加其抑制效果愈顯著，與順鉑聯(lián)用的效果最顯著。此外，齊元富等[52]研究發(fā)現(xiàn)納米雄黃可顯著降低VEGF、HIF-1在A549細(xì)胞中的表達(dá)，從而減少血管生成。Song等[33]發(fā)現(xiàn)RTS對抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）增殖、遷移、侵襲和血管形成具有很強(qiáng)的活性，可通過抑制VEGF/b-FGF的表達(dá)，導(dǎo)致VEGFR-2和下游蛋白激酶（包括ERK、FAK和Src）磷酸化。斑馬魚和雞絨毛尿囊膜模型實(shí)驗(yàn)表明，RTS顯著阻斷了血管生成；在昆明種小鼠中，2.5 mg/kg的RTS對H22同種異體移植瘤的抑制作用達(dá)到50%以上，表明其可有效抑制腫瘤血管生成。Lee等[53]研究發(fā)現(xiàn)As4S4與白花蛇舌草和丹參提取物混合物可通過降低VEGFR2、Src和STAT3的磷酸化抑制VEGF誘導(dǎo)的HUVEC增殖、遷移和腫瘤血管形成，并抑制絨毛尿囊膜的血管生成。此外，其可減弱A549和H460細(xì)胞中pro-PARP、Bcl-2、Cyclin E、Cyclin A、CDK2、E2F1、p-Src、p-STAT3、p-ERK、p-AKT、COX-2和SOCS-1的表達(dá)，并破壞STAT3與CDK2或VEGF的結(jié)合，提示As4S4可通過抑制STAT3/VEGF/CDK2發(fā)揮抗血管生成作用。

8 協(xié)同用藥

現(xiàn)代醫(yī)療在抗腫瘤治療上已取得一定成效，而傳統(tǒng)中藥與化學(xué)療法聯(lián)合可進(jìn)一步增加治療效果，并在藥物毒性、耐藥性方面有一定改善。Zhang等[54]使用胃癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系研究As4S4與BRD4抑制劑JQ1或化療藥物順鉑和伊立替康或COX2抑制劑塞來昔布聯(lián)合使用的抗腫瘤作用，結(jié)果表明聯(lián)合用藥可激活p53表達(dá)，同時(shí)抑制BRD4、c-Myc、COX2和cyclinD1表達(dá)，增強(qiáng)對COX2、BCL2和p38表達(dá)的抑制作用，激活Caspase-3等多種細(xì)胞凋亡途徑，表達(dá)顯著的細(xì)胞毒性。Tan等[55]研究發(fā)現(xiàn)，BRD4抑制劑JQ1與As4S4協(xié)同使用時(shí)，可降低活化T細(xì)胞（NFAT）的核因子-κB（NF-κB）表達(dá)、上調(diào)凋亡蛋白及下游癌基因c-Myc，并通過線粒體途徑，即降低線粒體膜電位、減少Cyt C釋放和激活Caspase-3活性來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而有效增強(qiáng)BET抑制劑在胃癌和結(jié)腸癌等晚期實(shí)體瘤中的細(xì)胞毒性。Wang等[32]證實(shí)As4S4與As3+協(xié)同作用時(shí)，可下調(diào)Bcl-2和NF-κB的表達(dá)，上調(diào)Bax和p53的表達(dá)，并激活Caspase-12和Caspase-3。此外，低濃度As4S4和As3+的組合促進(jìn)了PML-RARα癌蛋白的降解。Lee等[52]研究發(fā)現(xiàn)As4S4和PROS混合物具有顯著的細(xì)胞毒性，可誘導(dǎo)亞G1期和S期阻滯，增加凋亡小體。劉寨東等[51]以不同濃度的納米雄黃（25、100 μg/mL）與順鉑（2 μg/mL）單用或聯(lián)用干預(yù)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞，提示納米雄黃可抑制b-FGF表達(dá)，聯(lián)合應(yīng)用抑制強(qiáng)度隨濃度的增加而增強(qiáng)。

9 展望

中醫(yī)防治腫瘤具有堅(jiān)實(shí)的歷史基礎(chǔ)，而現(xiàn)代科技為其發(fā)展創(chuàng)造了有利條件[56]。雄黃作為從古代沿用至今的中藥，在現(xiàn)代臨床研究中應(yīng)用廣泛，并在多種癌癥類型中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗癌作用。其抗腫瘤機(jī)制主要分為靶向作用于腫瘤細(xì)胞和間接抑制腫瘤細(xì)胞生長兩方面，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤血管生成，抑制腫瘤干細(xì)胞分化等。采用現(xiàn)代制劑技術(shù)將其制成低毒、高效、生物利用度高且具有良好抗腫瘤功效的納米顆粒，與其他抗癌藥物協(xié)同用藥時(shí)可顯著增強(qiáng)抗腫瘤活性、提升藥敏性、克服耐藥性并減緩藥物毒性。近年來關(guān)于雄黃As4S4其納米雄黃、微生物轉(zhuǎn)化液等抗腫瘤相關(guān)文獻(xiàn)顯示，其可通過多條信號通路發(fā)揮抗腫瘤活性。

雄黃治療惡性腫瘤研究中取得了較大進(jìn)展，但其安全性和療效尚待進(jìn)一步研究。建議今后研究更系統(tǒng)地闡明中藥雄黃在不同人類腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)理及使用安全性，使其在臨床更大程度地發(fā)揮抗癌活性，提高癌癥患者生存質(zhì)量。