高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同品種菊花中綠原酸和木犀草苷及異綠原酸A 含量

周瑞娜，楊瑩瑩，李國鵬，周 偉，程 敏

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西咸陽 712046；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530000；3.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000；4.陜西康城藥業(yè)股份有限公司，陜西商洛 726000；5.陜西香菊藥業(yè)集團(tuán)有限公司，陜西商洛 726000）

中藥材菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifoliumRamat.）的干燥頭狀花序，菊廣泛分布于中國東北、華北、華中以及西南地區(qū)。菊花味甘、苦，性微寒，歸肺、肝經(jīng)，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒的功效，是常用清熱瀉火的良藥［1］?！吨腥A人民共和國國藥典（2020 年版）》根據(jù)產(chǎn)地和加工方法不同，將其分為亳菊、滁菊、貢菊、杭菊和懷菊。菊花中化學(xué)成分含量復(fù)雜，黃酮類、揮發(fā)油、苯丙素類、萜類、氨基酸等是其主要成分，其中黃酮和苯丙素類化合物為菊花的主要藥效成分［2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，菊花的藥理作用廣泛，具有抗動(dòng)脈硬化、抗缺氧、降血脂、抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用［3-10］。此外，在心腦血管、免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)膽固醇代謝等方面，如高血壓、高血脂等疾病，臨床上應(yīng)用廣泛［11，12］?！吨腥A人民共和國國藥典（2020 年版）》將木犀草苷、綠原酸和異綠原酸A 這3 種成分作為菊花含量測(cè)定內(nèi)容。陜西香菊藥業(yè)有限公司大力發(fā)展菊花藥源基地品牌建設(shè)，大規(guī)模栽植兼具藥用和觀賞價(jià)值的杭白菊、懷菊（黃葉、白葉）、亳菊和金絲皇菊，年產(chǎn)值達(dá)百萬元。由于菊花品種繁多，所含化學(xué)成分有一定差異，品質(zhì)上參差不齊［13］，因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定［14］杭白菊、懷菊（黃葉、白葉）、亳菊和金絲皇菊［15］4 個(gè)不同品種菊花中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的含量，以期為不同品種菊花質(zhì)量控制方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杭白菊、黃葉懷菊、白葉懷菊、亳菊、金絲皇菊樣品均采自陜西香菊藥業(yè)有限公司藥源基地，經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院商洛中藥材GAP 科研工程中心李筱玲鑒定為菊科植物菊。藥材經(jīng)清洗、烘干、粉碎，過1號(hào)篩［內(nèi)孔徑（2 000±70）μm］待用。綠原酸對(duì)照品（批號(hào)110753-202119，含量98.70%）、木犀草苷對(duì)照品（批號(hào)111720-202111，含量98.65%）、異綠原酸A對(duì)照品（批號(hào)111782-202208，含量98.85%），中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為去離子水。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

LC-2030C 3D Plus 型高效液相色譜儀、ATX224型電子天平（SHIMADZU 公司）；KQ5200DB 型數(shù)控超聲波清洗器（上海楚定分析儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Alphasil VC-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫0～11 min，10%～18%A，90%～82%B，11～30 min，18%～29%A，82%～80%B，30～40 min，20%A，80%B；流 速 為1.0 mL/min，檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 為348 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

1.3.2 溶液制備

1）對(duì)照品溶液。精密吸取濃度為40.311 μg/mL的綠原酸溶液5 mL、濃度為23.167 μg/mL 木犀草苷溶液3 mL 和濃度為101.994 μg/mL 異綠原酸A 溶液10 mL，將其移入棕色容量瓶?jī)?nèi)，再加入70%的甲醇得到綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A 的混合對(duì)照品溶液，儲(chǔ)存在低于10 ℃的溫度下。

2）供試品溶液。分別精密稱取不同品種菊花樣品（過篩）約0.25 g，放入容量瓶中，加入25 mL 70%的甲醇，塞緊瓶塞，稱重，在300 W、45 kHz 下超聲處理40 min，待冷卻后，再次稱重，繼續(xù)將70%的甲醇加入到容量瓶中，補(bǔ)足失去的重量。將容量瓶充分搖勻后過濾，得到的濾液即是供試品溶液。

3）陰性樣品溶液。按“1.3.2”中供試品溶液的制備方法，分別制成缺綠原酸、缺木犀草苷、缺異綠原酸A 的陰性樣品溶液。

1.3.3 方法學(xué)考察

1）專屬性考察。精密量取適量綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“1.3.1”的色譜條件下進(jìn)樣，分析該方法的專屬性。

2）線性關(guān)系考察。將10、20、40、80、100、120 mL的綠原酸對(duì)照品，5、10、30、40、60 mL 的木犀草苷對(duì)照品，20、40、120、160、240 mL 的異綠原酸A 對(duì)照品溶液精密量取，分別轉(zhuǎn)移至25 mL 棕色容量瓶中，在盛有對(duì)照品的容量瓶?jī)?nèi)加入70%甲醇溶液，稀釋至25 mL，使之形成系列不同濃度梯度的溶液。按照“1.3.1”中的色譜條件進(jìn)樣5 μL 樣品溶液，對(duì)結(jié)果進(jìn)行回歸分析。

3）精密度試驗(yàn)。分別精密吸取綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A 的混合對(duì)照品10 μL，按照“1.3.1”中的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5 次（n=5），同時(shí)記錄各成分的峰面積，考察試驗(yàn)的精密度。

4）穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取7 份按照“1.3.2”所述方法制備的相同批次不同品種菊花樣品，分別于0、2、4、8、12、20、24 h 后加樣進(jìn)行測(cè)定，并記錄峰面積。

5）重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.3.2”中的方法取同一批不同品種菊花粉末樣品，制備4 份供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分的含量，測(cè)試重復(fù)性。

6）加樣回收試驗(yàn)。取6 份已知含量的藥材樣品粉末（過篩），每份約0.25 g，精密稱量后，再將按照“1.3.2”的方法配制好混合的對(duì)照品溶液加入到樣品溶液中，按照“1.3.2”的方法制備供試品溶液，取10 μL，將樣品進(jìn)樣，并記錄峰面積。

1.3.4 樣品含量測(cè)定 稱取菊花樣品粉末（過篩）約0.25 g，按照“1.3.2”中供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，不同品種菊花平行制備3 份供試品溶液，每份樣品進(jìn)樣5 μL，測(cè)定菊花中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 專屬性考察 由圖1 可知，混合對(duì)照品溶液中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的保留時(shí)間分別為9.407、19.637、24.699 min。樣品中3 個(gè)成分的保留時(shí)間與對(duì)照品一致，且都能夠完全被分離，陰性樣品溶液未受到干擾，供試品溶液的雜質(zhì)對(duì)綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的色譜峰也未構(gòu)成干擾。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法具有良好的專屬性。

2.1.2 線性關(guān)系考察 以綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰值積分值（y）為縱坐標(biāo)。得到綠原酸的線性回歸方程y=14 927.7x-54 252.0（R2=0.999 8）。木犀草苷的線性回歸方程為y=46 822.1x+51 597.2（R2=0.999 3）。異綠原酸A的為y=21 455.1x-96 399.3（R2=0.997 4）。結(jié)果顯示，綠原酸在9.674～120.930 μg/mL、木犀草苷在4.344～57.918 μg/mL、異綠原酸A 在19.124～254.985 μg/mL水平上均表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。得到的回歸方程見表1。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 結(jié)果顯示，綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 峰面積的RSD分別為0.087%、0.322%和0.340%，表明該儀器性能穩(wěn)定。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的峰面積RSD分別為0.352%、0.794%和1.124%。表明供試品溶液在24 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 結(jié)果顯示，4 個(gè)樣品（n=4）中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的含量平均值分別為1.995%、15.596%和41.965%，RSD分別為0.211%、0.750%和0.794%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的平均回收率分別為97.65%、96.40%和98.07%，RSD分別為1.27%、0.69%和1.81%。表明該方法準(zhǔn)確性良好，結(jié)果見表2。

表2 菊花中3 個(gè)活性成分的加樣回收率（n=6）

2.2 菊花樣品3 個(gè)活性成分含量測(cè)定

通過對(duì)4 個(gè)不同品種菊花中3 個(gè)成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果（表3）顯示，綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.357 5%～0.787 2%、0.187 9%～0.823 9%、0.761 1%～1.616 9%，均高于《中華人民共和國藥典（2020 年版）》規(guī)定的菊花含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，且3 個(gè)組分在不同品種中的含量有較大差異。其中，綠原酸含量最高的是亳菊（0.787 2%），其次是懷菊、杭白菊、金絲皇菊；木犀草苷含量最高的為金絲皇菊（0.823 9%），其次是杭白菊、懷菊、亳菊；異綠原酸A 含量最高的是亳菊（1.616 9%），其次是懷菊、杭白菊、金絲皇菊。另外，亳菊中綠原酸、異綠原酸A 2 種成分含量均高于其他3 個(gè)品種，而金絲皇菊中這2 種成分含量則較低。以上結(jié)果可能與不同品種菊花中所含活性物質(zhì)含量本身存在差異有關(guān)，也可能與其種植、加工炮制工藝有關(guān)。

表3 不同菊花樣品3 個(gè)活性成分含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

前期預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果表明，通過使用二極管陣列檢測(cè)器來檢測(cè)3 種成分在200～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸收峰，綠原酸、木犀草苷以及異綠原酸A 分別在327、350、348 nm 處有最大吸收值。檢測(cè)不同波長(zhǎng)的峰面積、雜質(zhì)峰的干擾和基線的平滑度，最終將檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為348 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

前期預(yù)備試驗(yàn)比較了不同A、B 相甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-水以及乙腈甲酸等的分離效果。甲醇-水和乙腈-甲酸在洗脫過程中由于雜質(zhì)的強(qiáng)烈干擾而顯示出較差的分離效果。使用甲醇-0.1%磷酸溶液時(shí)，色譜峰很弱，理論塔板數(shù)也很低。當(dāng)使用乙腈溶液和0.1%的磷酸溶液時(shí)，色譜峰與相鄰的色譜峰完全分離，雜質(zhì)沒有干擾到被測(cè)組分的色譜峰。因此，本試驗(yàn)選擇0.1%磷酸溶液和乙腈作為試驗(yàn)條件。此外，色譜圖顯示，部分色譜峰的保留時(shí)間不同，這可能與色譜柱的效率有關(guān)。

3.3 提取溶劑的選擇

預(yù)備試驗(yàn)研究了提取溶劑甲醇、乙醇和70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇和50%乙醇對(duì)待測(cè)成分含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用70%甲醇提取菊花樣品時(shí)，綠原酸、木犀草苷和異綠原酸A 3 個(gè)參數(shù)最高，因此，試驗(yàn)確定70%甲醇作為提取溶劑。

4 小結(jié)

試驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同菊花品種中綠原酸、木犀草苷以及異綠原酸A 3 種指標(biāo)性成分的含量，并對(duì)其進(jìn)行了分析驗(yàn)證。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，本試驗(yàn)所采用的方法具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好的特性，并且回收率與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)相符，可以作為菊花的定量控制方法，同時(shí)該方法也為建立不同品種菊花質(zhì)量評(píng)價(jià)、檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。