紅壤中溶磷芽孢桿菌研究進展

林黎珍，任宗玲，王 佳，蔡燕飛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣州 510642）

中國紅壤類土壤約為128 萬km2，約占陸地總面積的13%，在國民經(jīng)濟的發(fā)展中占有重要地位［1-3］。中國紅壤中度脫硅富鋁，黏粒中游離鐵占全鐵的50%～60%，其黏土礦物以高嶺石、赤鐵礦為主，富含鐵鋁氧化物，其中鐵鋁氧化物的固磷能力很強，加上游離態(tài)鐵鋁的作用，將土壤中的磷酸根離子不斷吸附在鐵鋁氧化物表面，形成一層氧化鐵膜，封閉磷酸根與外界的作用，使固定的磷有效性較低［3，4］。在南方酸性紅壤中，閉蓄態(tài)的磷可達60%以上［5］，造成磷肥利用率低，中國主要谷類作物磷的季節(jié)利用效率僅為11.6%［6］。

磷是作物生長必需的營養(yǎng)元素，是作物進行生理代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，參與植物體內(nèi)各種生理生化活動，對促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力方面至關(guān)重要［7，8］。在土壤溶液中，植物吸收可溶性形式的磷，即正磷酸鹽（HPO42-、H2PO4-），僅占土壤總磷的0.1%～0.5%（＜10 μmol/L）［9，10］。施用磷肥是解決土壤缺磷的主要方式，但長期施用化肥會加劇旱地紅壤的酸化，降低土壤細(xì)菌多樣性［11］。且施用的肥料中超過80%的磷會發(fā)生吸附或沉淀反應(yīng)被固定，導(dǎo)致土壤中全磷含量增加，但土壤中磷素可利用率降低，施磷對作物的增產(chǎn)效果不顯著，甚至可能會由于淋失或地表徑流造成水體富營養(yǎng)化［5，12-14］。

溶磷微生物可以將土壤中難溶的磷素溶解，以供給植物吸收利用，此外還能分泌一些植物生長所需的生長激素，促進植物生長，從而減少化學(xué)磷肥的使用量［15-18］。溶磷微生物主要分為溶磷細(xì)菌和溶磷真菌，在土壤中，據(jù)估計有1%～50%的細(xì)菌和0.1%～0.5%的真菌具有溶磷效果［19］。其中芽孢桿菌在自然界中普遍存在，制成的菌劑具有營養(yǎng)簡單、耐熱、耐輻射、耐旱、性能穩(wěn)定、繁殖快、保質(zhì)期長、便于運輸?shù)忍攸c［20］，能產(chǎn)多種抗菌物質(zhì)和促進作物生長的激素等，是注冊并商品化生產(chǎn)使用最多的微生物菌劑。國家化肥質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心農(nóng)業(yè)部肥料登記證公告顯示，截至2020 年11 月，芽孢桿菌生物肥占已登記微生物肥的96.45%。Kour 等［19］綜述了約551 種不同來源的溶磷菌，其中溶磷細(xì)菌中最占優(yōu)勢的屬是芽孢桿菌屬。針對紅壤地區(qū)有效磷缺乏問題，本研究綜述了溶磷芽孢桿菌對紅壤中含磷礦物的研究情況，從有機酸、酶活性、基因工程等方面探究其對含磷礦物的溶解機制，以期為中國紅壤地區(qū)磷素活化與利用提供理論支撐，為提高酸性紅壤中磷的含量提供思路，對提高作物產(chǎn)量和科學(xué)使用磷礦資源具有重要意義。

1 溶磷芽孢桿菌的研究情況

自土壤中存在能夠溶解難溶性磷的微生物提出以后，便開展了較多關(guān)于溶磷微生物的研究，前人研究的芽孢桿菌菌株溶磷情況見表1。

不同研究者從土壤中篩選分離出的芽孢桿菌對磷酸鈣的溶磷量不同，對鋁磷和鐵磷溶解量的研究較少且溶磷量低于磷酸鈣。王呈玉等［21］從玉米根際土壤中分離出具有溶磷-聚磷能力的阿氏芽孢桿菌XF1，以磷酸三鈣、磷酸鋁和磷酸鐵為磷源的PVK培養(yǎng)基，溶磷量分別為891.60、205.42、27.17 mg/L，以磷酸鈣為磷源時的溶磷量顯著高于其他磷源，可能是菌株代謝物中的有機酸對Ca2+的螯合能力高于Fe3+和Al3+，以磷酸鋁、磷酸鐵和磷礦粉為磷源時，菌株溶解的磷很快又被發(fā)酵液中的Fe3+、Al3+及其他離子所固定，導(dǎo)致了以磷酸鋁和磷酸鐵為磷源的培養(yǎng)基中溶磷量顯著低于以Ca2+為磷源的培養(yǎng)基［21］。溶磷芽孢桿菌還具有分泌鐵載體、IAA、多種有機酸和脂類物質(zhì)等的功能，可預(yù)防病害和促進作物生長。

2 芽孢桿菌溶磷機理

2.1 有機酸對無機磷的增溶作用

磷增溶涉及多種機制，其中有機酸作用是主要的溶磷機制，有機酸通過降低根際土壤的pH 或螯合磷酸鹽中的陽離子，與磷爭奪土壤上的吸附位點或與不溶性磷化合物相關(guān)的金屬離子形成可溶性絡(luò)合物，如鋁、鈣和鐵的磷酸鹽，使其轉(zhuǎn)化為可溶形式，另外磷的溶解效果更多地取決于有機酸和磷源的質(zhì)量而非數(shù)量，常見的有機酸包括天冬氨酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、草酸和酒石酸等，這些有機酸在南方紅壤上能與Fe、Al 和Ca 等金屬離子間產(chǎn)生絡(luò)合反應(yīng)，顯著促進Fe、Al 等離子的釋放，從而降低土壤對磷的吸附［51-54］。Chawngthu 等［38］從農(nóng)田土壤中篩選出10 株溶磷芽孢桿菌，其中蠟樣芽孢桿菌MZLRPB6 有最大溶磷量，高效液相色譜分析顯示在培養(yǎng)基上清液中有多種有機酸的產(chǎn)生，如葡萄糖酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、甲酸和乙酸等，通過分析不同溶磷菌對磷酸鹽的增溶效果與有機酸生產(chǎn)、酸性磷酸酶活性間的關(guān)系，試驗證實溶磷菌株的主要溶磷機制是產(chǎn)生有機酸。Do Carmo 等［55］篩選出一株巨大芽孢桿菌ATCC14581，試驗證明該菌株產(chǎn)生有機酸使培養(yǎng)基pH 降低與溶解磷直接相關(guān)。Alemneh等從土壤中分離篩選出15 個溶磷細(xì)菌屬，向培養(yǎng)基中添加色氨酸后培養(yǎng)基pH 下降，菌株的溶磷效果提高，得出菌株產(chǎn)生的有機酸如α-酮戊二酸、順式烏頭酸、檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸等可促進磷酸鹽的溶解［56］。Kang 等［57］篩選分離出的溶磷巨大芽孢桿菌mj1212 通過分泌蘋果酸和奎寧酸溶解磷酸鹽?？莶菅挎邨U菌BPM12 的pH 從最初的7.00 降至4.25，隨著溶磷量的增加，pH 隨之下降，在pH 為4.25 時，磷酸鹽的最大增溶活性達到最大值。Wang 等［39］認(rèn)為初步磷酸鹽的增溶可能是pH 降低和有機酸產(chǎn)生聯(lián)合作用的結(jié)果。此外，有研究也表明菌株產(chǎn)生的小分子有機酸導(dǎo)致培養(yǎng)基上清液酸化是磷酸鹽溶解的主要原因［40，42］。吳海燕等［58］通過高效液相色譜法和傅里葉變換紅外光譜分析儀對解磷巨大芽孢桿菌發(fā)酵液代謝產(chǎn)物進行分析，確定該菌通過分泌葡萄糖酸溶解磷酸鈣。

2.2 其他代謝物質(zhì)對無機磷的增溶作用

磷溶解與溶磷菌分泌有機酸致土壤pH 降低沒有相關(guān)性，該菌的溶磷過程可能涉及其他機制，包括微生物細(xì)胞同化銨后釋放質(zhì)子、產(chǎn)生無機酸（即硫酸和硝酸）以及產(chǎn)生作用于兩親性脂肪物質(zhì)的特定酶等機制［59］。此外，菌株的溶磷能力還與生長環(huán)境有關(guān)。有些溶磷菌在培養(yǎng)過程中通過呼吸代謝吸收NH4+，產(chǎn)生碳酸，由碳酸釋放出的H+，導(dǎo)致培養(yǎng)基pH 下降，從而發(fā)揮溶磷作用［60］。王同等［61］從紅壤茶園土中篩選出1 株溶磷效果較強的蘇云金芽孢桿菌，在適宜條件下，其溶磷量為292.8 mg/L，在培養(yǎng)過程中能分泌草酸和蘋果酸，但外加等量的草酸和蘋果酸以及二者的混合液對磷酸鹽的活化能力遠(yuǎn)低于菌株自身的溶磷能力，推斷該溶磷菌還存在其他的溶磷機制。Rojas 等［50］從酸性土壤中篩選出的枯草芽孢桿菌UNB2 在以磷酸三鈣為磷源的培養(yǎng)基中釋放有機酸（葡萄糖酸、乳酸和檸檬酸等）的種類和數(shù)量均高于以鋁磷和鐵磷為磷源的培養(yǎng)基，其溶磷量也顯著高于其余2 個培養(yǎng)基，但其溶磷量與有機酸的產(chǎn)量間沒有顯著差異，研究者認(rèn)為溶磷量的差異除酸溶外，還與培養(yǎng)基中NH4+和磷酸鹽的比表面積有關(guān)。杜慧慧等［25］研究發(fā)現(xiàn)，從不同根際土壤中篩出的41 株菌株發(fā)酵液上清液中pH 均有所下降，但增磷量最大的菌株其發(fā)酵液pH 并不是最低，表明發(fā)酵液pH 變化與溶磷量無顯著相關(guān)性。駱韻涵等［62］從紅樹林酸性土壤中分離出一株短小芽孢桿菌，在該菌的上清液中檢測到少量的葡萄糖酸，解磷量為90.79 mg/L，在固體培養(yǎng)上，短小芽孢桿菌發(fā)酵上清液和外加的等量有機酸并沒有解磷圈出現(xiàn)，說明短小芽孢桿菌所產(chǎn)的有機酸并不能較好地溶解磷酸鈣，其溶磷能力可能是通過其他代謝作用，如呼吸與同質(zhì)化作用產(chǎn)生的質(zhì)子、蛋白質(zhì)等溶解部分磷酸鈣的物質(zhì)。

2.3 酶活性對有機磷的增溶作用

在土壤中，高分子量有機形式的磷不能被植物直接吸收，通常在礦化后轉(zhuǎn)化為無機形式［63］。有機磷的礦化由不同的土壤酶催化，土壤中的磷酸酶能夠水解磷酸酯和酸酐鍵，包括酸性和堿性磷酸酶、四磷酸腺苷酶、外切酶、磷蛋白磷酸酶、磷酸二酯酶、核苷酸酶、植酸酶和酸性磷酸單酯酶等，將土壤中的有機磷水解成無機形式，然后被植物根系利用和吸收［59，64，65］。此外，大多數(shù)植酸酶是催化P 從植酸中釋放的高分子量酸性磷酸酶，植酸是一種肌醇酯，是種子和花粉中儲存的主要P 形式［66，67］。土壤中的微生物通過生產(chǎn)植酸酶使植酸鹽礦化和產(chǎn)生有機酸以溶解無機磷，從而提高作物對有機磷的利用［68］。江威等［69］分離的一株具有產(chǎn)磷酸酯酶和有機酸能力的溶磷菌YP6，用磷酸酯酶處理磷礦粉24 h 后，培養(yǎng)基中的有效磷顯著增加，推斷該解淀粉芽孢桿菌YP6 的主要溶磷機理為有機酸、植酸酶及磷酸酯酶的作用。

3 溶磷芽孢桿菌基因工程研究

多數(shù)細(xì)菌的溶磷能力與菌株產(chǎn)有機酸的能力相關(guān)，其中葡萄糖酸是最常見的磷酸鹽溶劑，在吡咯喹啉醌（PQQ）和葡萄糖脫氫酶（GDH）的作用下，形成葡萄糖酸。Islam 等［10］將地衣芽孢桿菌中編碼PQQ的基因經(jīng)體外擴增后在大腸桿菌中成功表達，接種大腸桿菌后，培養(yǎng)基pH 下降，有效磷含量提高，證實了PQQ 對磷酸鹽增溶的作用。Huang 等［70］在巨大芽孢桿菌JX285 的基因組中也檢測到編碼PQQ 的基因pqq。Hanif等［71］無法使用通用引物擴增具有溶磷能力的枯草芽孢桿菌KPS-11 中的pqq基因，而擴增出編碼植酸酶的基因bpp。江威等［69］從具有高溶磷能力的解淀粉芽孢桿菌YP6 中克隆出編碼磷酸酯酶的基因AP3，并將其轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21 中，通過試驗證實了AP3對磷礦粉的溶磷能力。利用分子生物學(xué)技術(shù)進行溶磷相關(guān)基因的研究，通過克隆溶磷相關(guān)基因明確其功能，豐富溶磷芽孢桿菌對難溶性磷酸鹽溶解機制的認(rèn)識，對提高溶磷菌的利用效率具有重要意義。

4 小結(jié)

溶磷芽孢桿菌是廣泛存在于自然界中的重要微生物，可溶解難溶性磷酸鹽以釋放出可溶性磷供作物生長，特別是在南方酸性紅壤地區(qū)，在減少化學(xué)磷肥施用、促進作物生長等方面具有重要作用。有關(guān)溶磷芽孢桿菌的溶磷機制主要集中于菌株分泌有機酸來溶解難溶性磷酸鹽等研究方向，且不同芽孢桿菌的溶磷機制不同，未來可以從以下方面進行探索。

溶磷芽孢桿菌在不同環(huán)境下的溶磷效果具有差異性，南方紅壤中以鐵磷和鋁磷為主，大部分菌株對磷酸鐵和磷酸鋁的溶解性都較低，有些菌株在酸性土壤中的定殖能力較差。此外，溶磷菌的豐度從富磷地區(qū)的2.0%到貧磷地區(qū)的22.1%，在貧磷土壤中存在選擇壓力，溶磷菌豐度更高，盡管豐度相對較高，但其總?cè)芰琢枯^低，可以從紅壤較肥的地區(qū)取土，增加以AlPO4、FePO4·4H2O 為無機磷源的培養(yǎng)基進行篩菌，選出對鐵磷和鋁磷溶解效果較好的菌株［72］。

已有大量研究將溶磷菌與其他菌株進行聯(lián)合施用，其效果均優(yōu)于菌株單獨施用處理，但二者間的作用機理尚未明確，因此可將已有的菌株與其他菌株或土壤調(diào)理劑進行復(fù)配，并闡明二者及以上相互作用的機理，以提高菌種資源的利用率。

溶磷菌株的溶磷機理以產(chǎn)有機酸和提高土壤酶活性為主進行研究，有研究提到溶磷菌通過產(chǎn)有機酸與磷酸鹽中的金屬離子螯合，從而增加土壤中有效磷的含量，但其螯合機制尚未明確，在溶磷菌基因方面的研究較少，下一步應(yīng)從螯合機制、基因組分析和其他方面探索溶磷菌的溶磷機制，為提高溶磷菌的效果提供更大空間。