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    黃壤伯克氏溶磷細(xì)菌的篩選鑒定及溶磷特性

    2019-03-02 02:09:46喬志偉騰飛龍邵曉貴
    關(guān)鍵詞:溶磷氮源碳源

    喬志偉,騰飛龍,邵曉貴

    (1.安順學(xué)院 資源環(huán)境與工程學(xué)院,貴州 安順 561000;2.安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,貴州 安順 561000)

    磷是作物生長最重要的元素之一[1]?;瘜W(xué)磷肥中能被作物直接吸收的有效磷易與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等離子結(jié)合,轉(zhuǎn)化為植物不可利用的難溶性磷酸鹽,造成化學(xué)磷肥利用率很低,目前我國農(nóng)田磷肥利用率僅為30%左右[2]。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,為了保證作物生長過程中有充足的磷素供應(yīng),操作人員會施入過量的化學(xué)磷肥,進(jìn)而消耗大量的磷礦石,導(dǎo)致磷礦石面臨著被耗盡的危機(jī)[3];過量的化學(xué)磷肥還會造成磷素在土壤中的累積,對農(nóng)業(yè)環(huán)境和水體富營養(yǎng)化都有直接或間接的影響[4,5]。因此,將土壤中難溶磷酸鹽轉(zhuǎn)化成植物吸收的有效磷成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),利用溶磷細(xì)菌將土壤中難溶態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為有效磷,同時(shí)分泌促進(jìn)作物生長的物質(zhì),對土壤磷素的有效化過程起到積極作用。對于提高化學(xué)磷肥的利用率,增加土壤中有效磷含量,減少磷素累積,增加作物產(chǎn)量等方面都具積極的作用[6~8]。

    黃壤作為我國西南地區(qū)典型的地帶性土壤,集中分布在貴州、四川、重慶等地。其中,以貴州分布最為廣泛,全國25.3%的黃壤集中分布在貴州,其面積分別占貴州國土面積和土壤面積的41.9%和46.4%,是貴州主要的農(nóng)業(yè)土壤類型,在貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用,該區(qū)域化學(xué)磷肥利用率較低[9],且目前關(guān)于貴州黃壤區(qū)土壤溶磷細(xì)菌的研究資料且可利用的菌株資源都不足,本試驗(yàn)通過PVK平板培養(yǎng)法從貴州省安順市各縣區(qū)的黃壤中分離篩選溶磷細(xì)菌,并進(jìn)一步研究其溶磷特性,為該區(qū)域溶磷細(xì)菌的研究提供菌株資源,為溶磷細(xì)菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    1.1.1 土樣采集:

    土樣采自于貴州省安順市各縣區(qū)農(nóng)田作物根際,采樣地種植作物為玉米,蔬菜等,采集表層土壤,土壤質(zhì)地為黃壤,將采集的土樣除去雜草、植物根系等,24 h內(nèi)用于溶磷細(xì)菌的分離和篩選。

    1.1.2 培養(yǎng)基:

    (1)PVK培養(yǎng)基(用于溶磷細(xì)菌的分離篩選): 葡萄糖10 g, Ca2(PO4)35 g, (NH4)2SO40.5 g, NaCl 0.2 g, KCl 0.2 g, MgSO40.1 g, FeSO4·7H2O 0.002 g, MnSO4·4H2O 0.002 g, 0.4%溴酚藍(lán)(pH6.7)10 mL, 酵母浸膏0.5 g,蒸餾水1 000 mL,固體培養(yǎng)基加18~20 g瓊脂,pH自然;(2) NBRIP培養(yǎng)基:葡萄糖10 g, Ca2(PO4)35 g, MgCl25 g, (NH4)2SO40.1 g, KCl 0.2 g, MgSO40.25 g, 蒸餾水1 000 mL,固體培養(yǎng)基20 g瓊脂,pH自然;(3)溶磷細(xì)菌保存與活化培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g, 蛋白胨10.0 g, NaCl 5.0 g,蒸餾水1 000 mL,固體培養(yǎng)基加18~20 g瓊脂,pH調(diào)至7.0。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 溶磷細(xì)菌的分離篩選:

    稱取10 g采集的新鮮土樣放在盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中,放入幾顆滅菌的小玻璃珠,在150 r·min-1搖床上振蕩30 min,用10倍逐級稀釋法稀釋至10-7,均勻涂布在PVK培養(yǎng)基平板上,倒置于培養(yǎng)箱中,28 ℃培養(yǎng)3~5 d,待菌落長出后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色的暈圈對菌株進(jìn)行初步的篩選;在NBRIP固體平板培養(yǎng)基上多次劃線純化后,挑選出平板上仍產(chǎn)生透明圈層的菌株,將其保存置于4 ℃冰箱。

    1.2.2 溶磷細(xì)菌溶磷能力的測定:

    將溶磷細(xì)菌活化后將菌液按照1%的接種量接種于滅過菌的NBRIP液體培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng),將培養(yǎng)第7 d的培養(yǎng)液于4 ℃,6 000 r·min-1的條件下離心5~8 min,取上清液1 mL用鉬銻抗比色法測定有效磷含量,每株菌株重復(fù)3次,同時(shí)設(shè)置未接菌的空白對照,菌株溶磷能力即為接菌培養(yǎng)液有效磷含量與空白對照的差值。

    1.2.3 溶磷細(xì)菌菌體生長量(OD600)的測定:

    用移液管取培養(yǎng)好的液體發(fā)酵液5 mL于離心管中,在1 500 r·min-1的條件下離心3 min,在比色管中吸取上清液3 mL,并加入等量的1 mol·L-1的HCl, 以沒有接菌的空白培養(yǎng)液作為參比,在600 nm處比色測定菌液的光密度值,測定值即為OD600。

    1.2.4 溶磷細(xì)菌16sRNA序列的測定:

    采用引物7f (5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’),1 540 r (5’-AGGAGGTGATCCAGC CGCA-3’) 建立擴(kuò)增反應(yīng)體系并測序,將獲得的DNA序列輸入GenBank,用Blast 程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析,利用MEGA4.1的Neighbor-Joining 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

    1.2.5 培養(yǎng)基不同葡萄糖濃度對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中,葡萄糖的加入量分別是1、5、10、15、20 g·L-1,其它成分不變,接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力。

    1.2.6 培養(yǎng)基不同硫酸銨含量對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中,硫酸銨的加入量分別是0.05、0.067、0.1、0.2、1.0 g·L-1,其它成分不變,接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力。

    1.2.7 不同碳源氮源對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中,分別以蔗糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉等質(zhì)量代替葡萄糖為碳源,其它成分不變,接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力,確定最佳碳源;確定最佳碳源后,以氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉為氮源替換硫酸銨(氮摩爾質(zhì)量相同),接菌培養(yǎng)測定菌株在不同氮源條件下的溶磷能力。

    1.2.8 外加磷源對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中, 通過外加磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中有效磷的濃度,使其有效磷濃度分別為0、20、40、60、80、100 mg·L-1,接種菌液,研究外加磷源不同濃度對菌株溶磷能力的影響。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    本文數(shù)據(jù)采用方差分析的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法,分析軟件為Excel2003和SASV8.1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溶磷細(xì)菌的篩選及溶磷能力

    經(jīng)過初篩和多次劃線純化,最終得到14株溶磷能力大于395 mg·L-1的菌株,14株溶磷細(xì)菌溶磷圈及溶磷能力大小如表1所示,由表1可知14株菌株溶磷圈直徑大小在1.43~2.60 cm之間,菌株溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值介于1.73~3.00;14株菌株溶磷能力在395.30~564.07 mg·L-1,菌株W4的溶磷能力最強(qiáng),為564.07 mg·L-1,顯著高于其它菌株(P<0.05)。14株菌株溶磷能力大小與對應(yīng)菌株溶磷圈直徑(D)、溶磷圈直徑和菌落直徑比值(D/d)之間的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.1728、0.0028,相關(guān)性不顯著,因此菌落溶磷圈有無及大小僅做為初步篩選溶磷細(xì)菌的方法,不能作為衡量其溶磷能力大小的標(biāo)志。

    表1 14株溶磷細(xì)菌溶磷圈及溶磷能力Table 1 Phosphorus circle and the ability dissolved phosphorus of phosphorus bacteria in tricalcium medium

    注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

    Note:Different small letters show significant difference at the 0.05 level in the same row. The same below.

    2.2 溶磷細(xì)菌W4的16sRNA序列測定

    以W4的總DNA為模板,利用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到擴(kuò)增產(chǎn)物,將W4測序結(jié)果采用BLAST 軟件與Genbank 中的序列比較,W4菌株與Burkholderiasp.(HQ704712.1)及Burkholderiasp.(KX161744.1)的序列同源性均大于99%,鑒定其屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp.),其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

    圖1 溶磷細(xì)菌W4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of phosphate solubilizing bacteria W4

    2.3 菌株W4溶磷特性的研究

    2.3.1 培養(yǎng)基不同葡萄糖濃度對W4溶磷能力的影響

    培養(yǎng)液中不同葡萄糖濃度下W4的菌體生長量(OD600)及溶磷能力見表2。由表2可知,培養(yǎng)液中葡萄糖濃度分別為1、5、10、15、20 g·L-1時(shí),W4的溶磷能力分別為107.61、419.38、564.07、570.20、580.06 mg·L-1。葡萄糖濃度為1 g·L-1時(shí),菌株溶磷能力最小,培養(yǎng)液中碳源含量不足時(shí)對溶磷細(xì)菌溶磷能力影響較大,當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度從1 g·L-1增加到10 g·L-1時(shí),W4溶磷能力從107.61 mg·L-1顯著增加到564.07 mg·L-1,增加了456.46 mg·L-1,可見當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度小于10 g·L-1時(shí),隨著葡萄糖濃度的增加,W4溶磷能力呈顯著增加的趨勢;當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度從10 g·L-1增加到20 g·L-1時(shí),W4溶磷能力從564.07 mg·L-1增加到580.06 mg·L-1,增加量僅為15.93 mg·L-1,培養(yǎng)液中葡萄糖濃度大于10 g·L-1時(shí),隨著葡萄糖濃度的增加,W4溶磷能力增加不顯著;當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度大于15 g·L-1時(shí),菌體活動產(chǎn)生的葡萄糖酸增加進(jìn)而抑制菌株的生長受到抑制。

    2.3.2 培養(yǎng)基不同硫酸銨濃度對W4溶磷能力的影響

    培養(yǎng)液中不同硫酸銨濃度下W4的菌體生長量(OD600)及溶磷能力見表3。由表3可知,培養(yǎng)液中硫酸銨濃度分別為0.05、0.067、0.10、0.20、1.00 g·L-1時(shí),W4的菌體生長量(OD600)分別為0.23、0.31、0.42、0.55、0.69,溶磷能力分別為604.18、589.81、564.07、532.24、491.33 mg·L-1。當(dāng)培養(yǎng)液中硫酸銨濃度從0.05 g·L-1增加到1.00 g·L-1時(shí),菌株W4 菌體生長量(OD600)從0.23增加到0.69,增加了0.46,呈顯著增加的趨勢,溶磷能力從604.18 mg·L-1降低到到491.33 mg·L-1,減少了112.85 mg·L-1,與表2培養(yǎng)液葡萄糖濃度對菌株生長量和溶磷能力的影響比較,碳源含量對菌株溶磷能力影響較大,氮源含量對菌體生長量影響較大。

    表2不同葡萄糖濃度下菌株W4的OD600與溶磷能力

    Table2 OD600and phosphate solubilizing capacity of W4 under different glucose concentrations

    不同葡萄糖濃度/g·L-1Different glucose concentrationOD600溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability10.36±0.01b107.61±7.21c50.40±0.01a419.38±4.10b100.36±0.02b564.07±10.31a150.35±0.01b570.20±7.68a200.29±0.02c580.06±7.21a

    表3不同硫酸銨濃度下菌株W4 OD600和溶磷能力

    Table3 OD600and phosphate solubilizing capacity of W4 under different ammonium sulphate concentrations

    不同硫酸銨濃度/g·L-1Different ammonium sulphate concentrationOD600溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability0.05023±0.01e604.18±10.79a0.0670.31±0.01d589.81±22.45ab0.100.42±0.02c564.07±10.31b0.200.55±0.02b532.24±18.08c1.000.69±0.03a491.33±9.35d

    2.3.3 不同碳氮源對W4溶磷能力的影響

    培養(yǎng)液中不同碳氮源對W4溶磷能力的影響見表4。由表4可知,W4對不同碳源的利用能力為葡萄糖>甘露醇>蔗糖>麥芽糖>淀粉,以葡萄糖為碳源,溶磷能力最強(qiáng),為564.07 mg·L-1,顯著高于其它碳源,以淀粉為碳源,溶磷能力最低,為59.41 mg·L-1,W4對單糖利用效果最好,多糖最差;

    以葡萄糖為碳源,選擇硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀作為不同氮源,W4在以硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀為氮源的條件下,溶磷能力分別為564.07、579.33、605.97、611.96、640.10 mg·L-1;W4以硝態(tài)氮為氮源溶磷能力顯著高于銨態(tài)氮。

    表4 不同碳氮源菌株W4 的溶磷能力Table 4 Phosphate solubilizing capacity of strain W4 with different carbon and nitrogen sources

    2.3.4 外加磷源濃度對W4溶磷能力的影響

    外加磷源濃度對W4溶磷能力的影響見表5。由表5可知,隨著培養(yǎng)液中外加磷源濃度的增加,W4的溶磷能力呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,外加磷源濃度從0 mg·L-1增加到100 mg·L-1,W4的溶磷能力從564.07 mg·L-1下降到493.43 mg·L-1,培養(yǎng)環(huán)境中有效磷濃度對菌株溶磷能力也有一定的限制作用。

    表5外加磷源濃度菌株W4溶磷能力

    Table5 Phosphate solubilizing capacity of strain W4 with different added phosphorus concentration

    不同磷源濃度/mg·L-1Different added phosphorus concentration溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability0564.07±10.31a20558.68±15.27ab40547.90±5.49b60523.06±21.46bc80510.19±7.74c100493.43±11.25c

    3 討論與結(jié)論

    溶磷微生物最明顯的標(biāo)志是可以在PVK固體培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生溶磷圈,這也是目前篩選溶磷微生物最常用的方法之一,但是在試驗(yàn)篩選過程中,由于在平板上長出的菌落較多且相互之間的競爭關(guān)系,大多數(shù)菌株的溶磷能力受到抑制,并不是所有的菌株都會出現(xiàn)溶磷圈,且溶磷圈大小與溶磷能力之間是否存在相關(guān)性還有待研究,Nautial[10]、馮哲葉[11]、馬驄毓[12]等研究表明,溶磷圈的大小不能代表其溶磷能力的大小,本試驗(yàn)中14株菌株溶磷能力與溶磷圈大小之間的關(guān)系并不顯著,因此溶磷圈僅是作為識別溶磷微生物的標(biāo)志之一,在篩選溶磷能力強(qiáng)的微生物時(shí),必須對其溶磷能力進(jìn)行培養(yǎng)測定。

    培養(yǎng)液中葡萄糖濃度或者硫酸銨濃度不同時(shí),培養(yǎng)基中的碳氮比不同,對菌株生長量及溶磷能力影響不同。試驗(yàn)研究表明W4培養(yǎng)液中氮源增加,菌體大量生長,氮源對菌體的生長有決定作用;培養(yǎng)液中碳源缺乏時(shí),溶磷能力急劇下降,碳源對菌株溶磷能力起決定性作用,但是培養(yǎng)液中碳源濃度過高時(shí),溶磷能力增加不明顯,菌體卻大量減少,對菌體生長起到限制作用,這是因?yàn)槿芰孜⑸锟梢苑纸馓荚串a(chǎn)酸溶解難溶態(tài)磷酸鹽,碳源濃度過多導(dǎo)致產(chǎn)酸增加,對菌株生長不利[13]。培養(yǎng)基中碳源和氮源的種類和含量通過影響產(chǎn)生有機(jī)酸的種類和濃度進(jìn)而影響其溶磷能力[14],不同菌株對碳源和氮源的利用率不盡相同,胡山等[15]研究溶磷細(xì)菌Y3-35以葡萄糖為碳源,蛋白胨為氮源,溶磷能力最強(qiáng)。衛(wèi)星等[16]發(fā)現(xiàn)一株巨大芽孢桿菌以葡萄糖和硫酸銨為最佳碳氮源,本試驗(yàn)中W4以葡萄糖和硝酸鉀為碳氮源,溶磷能力最強(qiáng)。因此,培養(yǎng)環(huán)境中碳源、氮源的種類和濃度對于菌株的生長和溶磷能力的發(fā)揮具有重要的作用,是溶磷微生物應(yīng)用中要重點(diǎn)考慮和研究的方面。

    本試驗(yàn)中W4經(jīng)鑒定屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp),該菌屬在產(chǎn)脂肪酶[17]、促進(jìn)作物生長[18]、生物防治及土壤修復(fù)[19]等方面都有報(bào)道,通過本試驗(yàn)的研究,以期為黃壤溶磷微生物的研究提供菌株資源和其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

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