• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃壤伯克氏溶磷細(xì)菌的篩選鑒定及溶磷特性

    2019-03-02 02:09:46喬志偉騰飛龍邵曉貴
    關(guān)鍵詞:溶磷氮源碳源

    喬志偉,騰飛龍,邵曉貴

    (1.安順學(xué)院 資源環(huán)境與工程學(xué)院,貴州 安順 561000;2.安順學(xué)院 農(nóng)學(xué)院,貴州 安順 561000)

    磷是作物生長最重要的元素之一[1]?;瘜W(xué)磷肥中能被作物直接吸收的有效磷易與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+等離子結(jié)合,轉(zhuǎn)化為植物不可利用的難溶性磷酸鹽,造成化學(xué)磷肥利用率很低,目前我國農(nóng)田磷肥利用率僅為30%左右[2]。因此,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,為了保證作物生長過程中有充足的磷素供應(yīng),操作人員會施入過量的化學(xué)磷肥,進(jìn)而消耗大量的磷礦石,導(dǎo)致磷礦石面臨著被耗盡的危機(jī)[3];過量的化學(xué)磷肥還會造成磷素在土壤中的累積,對農(nóng)業(yè)環(huán)境和水體富營養(yǎng)化都有直接或間接的影響[4,5]。因此,將土壤中難溶磷酸鹽轉(zhuǎn)化成植物吸收的有效磷成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),利用溶磷細(xì)菌將土壤中難溶態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為有效磷,同時(shí)分泌促進(jìn)作物生長的物質(zhì),對土壤磷素的有效化過程起到積極作用。對于提高化學(xué)磷肥的利用率,增加土壤中有效磷含量,減少磷素累積,增加作物產(chǎn)量等方面都具積極的作用[6~8]。

    黃壤作為我國西南地區(qū)典型的地帶性土壤,集中分布在貴州、四川、重慶等地。其中,以貴州分布最為廣泛,全國25.3%的黃壤集中分布在貴州,其面積分別占貴州國土面積和土壤面積的41.9%和46.4%,是貴州主要的農(nóng)業(yè)土壤類型,在貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用,該區(qū)域化學(xué)磷肥利用率較低[9],且目前關(guān)于貴州黃壤區(qū)土壤溶磷細(xì)菌的研究資料且可利用的菌株資源都不足,本試驗(yàn)通過PVK平板培養(yǎng)法從貴州省安順市各縣區(qū)的黃壤中分離篩選溶磷細(xì)菌,并進(jìn)一步研究其溶磷特性,為該區(qū)域溶磷細(xì)菌的研究提供菌株資源,為溶磷細(xì)菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    1.1.1 土樣采集:

    土樣采自于貴州省安順市各縣區(qū)農(nóng)田作物根際,采樣地種植作物為玉米,蔬菜等,采集表層土壤,土壤質(zhì)地為黃壤,將采集的土樣除去雜草、植物根系等,24 h內(nèi)用于溶磷細(xì)菌的分離和篩選。

    1.1.2 培養(yǎng)基:

    (1)PVK培養(yǎng)基(用于溶磷細(xì)菌的分離篩選): 葡萄糖10 g, Ca2(PO4)35 g, (NH4)2SO40.5 g, NaCl 0.2 g, KCl 0.2 g, MgSO40.1 g, FeSO4·7H2O 0.002 g, MnSO4·4H2O 0.002 g, 0.4%溴酚藍(lán)(pH6.7)10 mL, 酵母浸膏0.5 g,蒸餾水1 000 mL,固體培養(yǎng)基加18~20 g瓊脂,pH自然;(2) NBRIP培養(yǎng)基:葡萄糖10 g, Ca2(PO4)35 g, MgCl25 g, (NH4)2SO40.1 g, KCl 0.2 g, MgSO40.25 g, 蒸餾水1 000 mL,固體培養(yǎng)基20 g瓊脂,pH自然;(3)溶磷細(xì)菌保存與活化培養(yǎng)基:牛肉膏5.0 g, 蛋白胨10.0 g, NaCl 5.0 g,蒸餾水1 000 mL,固體培養(yǎng)基加18~20 g瓊脂,pH調(diào)至7.0。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 溶磷細(xì)菌的分離篩選:

    稱取10 g采集的新鮮土樣放在盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中,放入幾顆滅菌的小玻璃珠,在150 r·min-1搖床上振蕩30 min,用10倍逐級稀釋法稀釋至10-7,均勻涂布在PVK培養(yǎng)基平板上,倒置于培養(yǎng)箱中,28 ℃培養(yǎng)3~5 d,待菌落長出后觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色的暈圈對菌株進(jìn)行初步的篩選;在NBRIP固體平板培養(yǎng)基上多次劃線純化后,挑選出平板上仍產(chǎn)生透明圈層的菌株,將其保存置于4 ℃冰箱。

    1.2.2 溶磷細(xì)菌溶磷能力的測定:

    將溶磷細(xì)菌活化后將菌液按照1%的接種量接種于滅過菌的NBRIP液體培養(yǎng)基中,28 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng),將培養(yǎng)第7 d的培養(yǎng)液于4 ℃,6 000 r·min-1的條件下離心5~8 min,取上清液1 mL用鉬銻抗比色法測定有效磷含量,每株菌株重復(fù)3次,同時(shí)設(shè)置未接菌的空白對照,菌株溶磷能力即為接菌培養(yǎng)液有效磷含量與空白對照的差值。

    1.2.3 溶磷細(xì)菌菌體生長量(OD600)的測定:

    用移液管取培養(yǎng)好的液體發(fā)酵液5 mL于離心管中,在1 500 r·min-1的條件下離心3 min,在比色管中吸取上清液3 mL,并加入等量的1 mol·L-1的HCl, 以沒有接菌的空白培養(yǎng)液作為參比,在600 nm處比色測定菌液的光密度值,測定值即為OD600。

    1.2.4 溶磷細(xì)菌16sRNA序列的測定:

    采用引物7f (5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’),1 540 r (5’-AGGAGGTGATCCAGC CGCA-3’) 建立擴(kuò)增反應(yīng)體系并測序,將獲得的DNA序列輸入GenBank,用Blast 程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析,利用MEGA4.1的Neighbor-Joining 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

    1.2.5 培養(yǎng)基不同葡萄糖濃度對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中,葡萄糖的加入量分別是1、5、10、15、20 g·L-1,其它成分不變,接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力。

    1.2.6 培養(yǎng)基不同硫酸銨含量對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中,硫酸銨的加入量分別是0.05、0.067、0.1、0.2、1.0 g·L-1,其它成分不變,接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力。

    1.2.7 不同碳源氮源對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中,分別以蔗糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉等質(zhì)量代替葡萄糖為碳源,其它成分不變,接菌培養(yǎng)測定菌株溶磷能力,確定最佳碳源;確定最佳碳源后,以氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉為氮源替換硫酸銨(氮摩爾質(zhì)量相同),接菌培養(yǎng)測定菌株在不同氮源條件下的溶磷能力。

    1.2.8 外加磷源對菌株溶磷能力的影響:

    在NBRIP液體培養(yǎng)基中, 通過外加磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中有效磷的濃度,使其有效磷濃度分別為0、20、40、60、80、100 mg·L-1,接種菌液,研究外加磷源不同濃度對菌株溶磷能力的影響。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    本文數(shù)據(jù)采用方差分析的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法,分析軟件為Excel2003和SASV8.1。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 溶磷細(xì)菌的篩選及溶磷能力

    經(jīng)過初篩和多次劃線純化,最終得到14株溶磷能力大于395 mg·L-1的菌株,14株溶磷細(xì)菌溶磷圈及溶磷能力大小如表1所示,由表1可知14株菌株溶磷圈直徑大小在1.43~2.60 cm之間,菌株溶磷圈直徑(D)與菌落直徑(d)比值介于1.73~3.00;14株菌株溶磷能力在395.30~564.07 mg·L-1,菌株W4的溶磷能力最強(qiáng),為564.07 mg·L-1,顯著高于其它菌株(P<0.05)。14株菌株溶磷能力大小與對應(yīng)菌株溶磷圈直徑(D)、溶磷圈直徑和菌落直徑比值(D/d)之間的線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.1728、0.0028,相關(guān)性不顯著,因此菌落溶磷圈有無及大小僅做為初步篩選溶磷細(xì)菌的方法,不能作為衡量其溶磷能力大小的標(biāo)志。

    表1 14株溶磷細(xì)菌溶磷圈及溶磷能力Table 1 Phosphorus circle and the ability dissolved phosphorus of phosphorus bacteria in tricalcium medium

    注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

    Note:Different small letters show significant difference at the 0.05 level in the same row. The same below.

    2.2 溶磷細(xì)菌W4的16sRNA序列測定

    以W4的總DNA為模板,利用細(xì)菌16S rRNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到擴(kuò)增產(chǎn)物,將W4測序結(jié)果采用BLAST 軟件與Genbank 中的序列比較,W4菌株與Burkholderiasp.(HQ704712.1)及Burkholderiasp.(KX161744.1)的序列同源性均大于99%,鑒定其屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp.),其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

    圖1 溶磷細(xì)菌W4的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of phosphate solubilizing bacteria W4

    2.3 菌株W4溶磷特性的研究

    2.3.1 培養(yǎng)基不同葡萄糖濃度對W4溶磷能力的影響

    培養(yǎng)液中不同葡萄糖濃度下W4的菌體生長量(OD600)及溶磷能力見表2。由表2可知,培養(yǎng)液中葡萄糖濃度分別為1、5、10、15、20 g·L-1時(shí),W4的溶磷能力分別為107.61、419.38、564.07、570.20、580.06 mg·L-1。葡萄糖濃度為1 g·L-1時(shí),菌株溶磷能力最小,培養(yǎng)液中碳源含量不足時(shí)對溶磷細(xì)菌溶磷能力影響較大,當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度從1 g·L-1增加到10 g·L-1時(shí),W4溶磷能力從107.61 mg·L-1顯著增加到564.07 mg·L-1,增加了456.46 mg·L-1,可見當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度小于10 g·L-1時(shí),隨著葡萄糖濃度的增加,W4溶磷能力呈顯著增加的趨勢;當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度從10 g·L-1增加到20 g·L-1時(shí),W4溶磷能力從564.07 mg·L-1增加到580.06 mg·L-1,增加量僅為15.93 mg·L-1,培養(yǎng)液中葡萄糖濃度大于10 g·L-1時(shí),隨著葡萄糖濃度的增加,W4溶磷能力增加不顯著;當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度大于15 g·L-1時(shí),菌體活動產(chǎn)生的葡萄糖酸增加進(jìn)而抑制菌株的生長受到抑制。

    2.3.2 培養(yǎng)基不同硫酸銨濃度對W4溶磷能力的影響

    培養(yǎng)液中不同硫酸銨濃度下W4的菌體生長量(OD600)及溶磷能力見表3。由表3可知,培養(yǎng)液中硫酸銨濃度分別為0.05、0.067、0.10、0.20、1.00 g·L-1時(shí),W4的菌體生長量(OD600)分別為0.23、0.31、0.42、0.55、0.69,溶磷能力分別為604.18、589.81、564.07、532.24、491.33 mg·L-1。當(dāng)培養(yǎng)液中硫酸銨濃度從0.05 g·L-1增加到1.00 g·L-1時(shí),菌株W4 菌體生長量(OD600)從0.23增加到0.69,增加了0.46,呈顯著增加的趨勢,溶磷能力從604.18 mg·L-1降低到到491.33 mg·L-1,減少了112.85 mg·L-1,與表2培養(yǎng)液葡萄糖濃度對菌株生長量和溶磷能力的影響比較,碳源含量對菌株溶磷能力影響較大,氮源含量對菌體生長量影響較大。

    表2不同葡萄糖濃度下菌株W4的OD600與溶磷能力

    Table2 OD600and phosphate solubilizing capacity of W4 under different glucose concentrations

    不同葡萄糖濃度/g·L-1Different glucose concentrationOD600溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability10.36±0.01b107.61±7.21c50.40±0.01a419.38±4.10b100.36±0.02b564.07±10.31a150.35±0.01b570.20±7.68a200.29±0.02c580.06±7.21a

    表3不同硫酸銨濃度下菌株W4 OD600和溶磷能力

    Table3 OD600and phosphate solubilizing capacity of W4 under different ammonium sulphate concentrations

    不同硫酸銨濃度/g·L-1Different ammonium sulphate concentrationOD600溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability0.05023±0.01e604.18±10.79a0.0670.31±0.01d589.81±22.45ab0.100.42±0.02c564.07±10.31b0.200.55±0.02b532.24±18.08c1.000.69±0.03a491.33±9.35d

    2.3.3 不同碳氮源對W4溶磷能力的影響

    培養(yǎng)液中不同碳氮源對W4溶磷能力的影響見表4。由表4可知,W4對不同碳源的利用能力為葡萄糖>甘露醇>蔗糖>麥芽糖>淀粉,以葡萄糖為碳源,溶磷能力最強(qiáng),為564.07 mg·L-1,顯著高于其它碳源,以淀粉為碳源,溶磷能力最低,為59.41 mg·L-1,W4對單糖利用效果最好,多糖最差;

    以葡萄糖為碳源,選擇硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀作為不同氮源,W4在以硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鈉、硝酸鉀為氮源的條件下,溶磷能力分別為564.07、579.33、605.97、611.96、640.10 mg·L-1;W4以硝態(tài)氮為氮源溶磷能力顯著高于銨態(tài)氮。

    表4 不同碳氮源菌株W4 的溶磷能力Table 4 Phosphate solubilizing capacity of strain W4 with different carbon and nitrogen sources

    2.3.4 外加磷源濃度對W4溶磷能力的影響

    外加磷源濃度對W4溶磷能力的影響見表5。由表5可知,隨著培養(yǎng)液中外加磷源濃度的增加,W4的溶磷能力呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,外加磷源濃度從0 mg·L-1增加到100 mg·L-1,W4的溶磷能力從564.07 mg·L-1下降到493.43 mg·L-1,培養(yǎng)環(huán)境中有效磷濃度對菌株溶磷能力也有一定的限制作用。

    表5外加磷源濃度菌株W4溶磷能力

    Table5 Phosphate solubilizing capacity of strain W4 with different added phosphorus concentration

    不同磷源濃度/mg·L-1Different added phosphorus concentration溶磷能力/mg·L-1Dissolving phosphorus ability0564.07±10.31a20558.68±15.27ab40547.90±5.49b60523.06±21.46bc80510.19±7.74c100493.43±11.25c

    3 討論與結(jié)論

    溶磷微生物最明顯的標(biāo)志是可以在PVK固體培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生溶磷圈,這也是目前篩選溶磷微生物最常用的方法之一,但是在試驗(yàn)篩選過程中,由于在平板上長出的菌落較多且相互之間的競爭關(guān)系,大多數(shù)菌株的溶磷能力受到抑制,并不是所有的菌株都會出現(xiàn)溶磷圈,且溶磷圈大小與溶磷能力之間是否存在相關(guān)性還有待研究,Nautial[10]、馮哲葉[11]、馬驄毓[12]等研究表明,溶磷圈的大小不能代表其溶磷能力的大小,本試驗(yàn)中14株菌株溶磷能力與溶磷圈大小之間的關(guān)系并不顯著,因此溶磷圈僅是作為識別溶磷微生物的標(biāo)志之一,在篩選溶磷能力強(qiáng)的微生物時(shí),必須對其溶磷能力進(jìn)行培養(yǎng)測定。

    培養(yǎng)液中葡萄糖濃度或者硫酸銨濃度不同時(shí),培養(yǎng)基中的碳氮比不同,對菌株生長量及溶磷能力影響不同。試驗(yàn)研究表明W4培養(yǎng)液中氮源增加,菌體大量生長,氮源對菌體的生長有決定作用;培養(yǎng)液中碳源缺乏時(shí),溶磷能力急劇下降,碳源對菌株溶磷能力起決定性作用,但是培養(yǎng)液中碳源濃度過高時(shí),溶磷能力增加不明顯,菌體卻大量減少,對菌體生長起到限制作用,這是因?yàn)槿芰孜⑸锟梢苑纸馓荚串a(chǎn)酸溶解難溶態(tài)磷酸鹽,碳源濃度過多導(dǎo)致產(chǎn)酸增加,對菌株生長不利[13]。培養(yǎng)基中碳源和氮源的種類和含量通過影響產(chǎn)生有機(jī)酸的種類和濃度進(jìn)而影響其溶磷能力[14],不同菌株對碳源和氮源的利用率不盡相同,胡山等[15]研究溶磷細(xì)菌Y3-35以葡萄糖為碳源,蛋白胨為氮源,溶磷能力最強(qiáng)。衛(wèi)星等[16]發(fā)現(xiàn)一株巨大芽孢桿菌以葡萄糖和硫酸銨為最佳碳氮源,本試驗(yàn)中W4以葡萄糖和硝酸鉀為碳氮源,溶磷能力最強(qiáng)。因此,培養(yǎng)環(huán)境中碳源、氮源的種類和濃度對于菌株的生長和溶磷能力的發(fā)揮具有重要的作用,是溶磷微生物應(yīng)用中要重點(diǎn)考慮和研究的方面。

    本試驗(yàn)中W4經(jīng)鑒定屬于伯克氏菌屬(Burkholderiasp),該菌屬在產(chǎn)脂肪酶[17]、促進(jìn)作物生長[18]、生物防治及土壤修復(fù)[19]等方面都有報(bào)道,通過本試驗(yàn)的研究,以期為黃壤溶磷微生物的研究提供菌株資源和其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    溶磷氮源碳源
    緩釋碳源促進(jìn)生物反硝化脫氮技術(shù)研究進(jìn)展
    不同碳源對銅溜槽用鋁碳質(zhì)涂抹料性能的影響
    昆鋼科技(2021年6期)2021-03-09 06:10:20
    溶磷細(xì)菌篩選及對復(fù)墾土壤磷素有效性的評價(jià)
    煙草根際溶磷解鉀細(xì)菌的篩選鑒定及對煙草的促生作用
    溶磷放線菌研究進(jìn)展*
    廣州化工(2016年8期)2016-09-02 00:48:01
    土壤溶磷微生物及其對植物促生作用研究進(jìn)展
    無機(jī)氮源對紅曲霉調(diào)控初探
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:11
    四甘醇作碳源合成Li3V2(PO4)3正極材料及其電化學(xué)性能
    中藥渣生產(chǎn)蛋白飼料的氮源優(yōu)化研究
    中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:03
    響應(yīng)面分析法和氮源改進(jìn)優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝
    色网站视频免费| 中文天堂在线官网| 精品一区二区三区人妻视频| av免费观看日本| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久99热这里只频精品6学生| 成人性生交大片免费视频hd| 国产 一区 欧美 日韩| 国产午夜精品论理片| 大话2 男鬼变身卡| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲综合精品二区| 天堂影院成人在线观看| 大陆偷拍与自拍| 午夜福利在线在线| or卡值多少钱| 麻豆乱淫一区二区| 国产色婷婷99| 国产黄片美女视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 青春草亚洲视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| av卡一久久| a级毛色黄片| 国产 一区 欧美 日韩| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 热99在线观看视频| 青春草亚洲视频在线观看| 水蜜桃什么品种好| 国产淫语在线视频| ponron亚洲| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | av黄色大香蕉| 在线a可以看的网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 高清av免费在线| videossex国产| 久久精品久久久久久久性| 国产在视频线在精品| 免费看光身美女| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇的逼好多水| 国产亚洲av嫩草精品影院| 18禁动态无遮挡网站| 免费看不卡的av| 在线天堂最新版资源| eeuss影院久久| 亚洲最大成人av| 一级毛片我不卡| 中文字幕亚洲精品专区| 高清视频免费观看一区二区 | 又爽又黄无遮挡网站| 赤兔流量卡办理| 国产免费一级a男人的天堂| 97超视频在线观看视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 天堂网av新在线| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲自偷自拍三级| 人妻少妇偷人精品九色| 看黄色毛片网站| 中文天堂在线官网| 青春草亚洲视频在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产精品人妻久久久久久| ponron亚洲| 九色成人免费人妻av| 国产亚洲精品久久久com| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品第二区| 久久人人爽人人片av| 99热全是精品| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日本一二三区视频观看| 国产淫片久久久久久久久| 乱系列少妇在线播放| 免费看av在线观看网站| 亚洲天堂国产精品一区在线| 午夜久久久久精精品| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 在线播放无遮挡| 波野结衣二区三区在线| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久国产一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 日韩一区二区三区影片| 少妇的逼水好多| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人福利小说| 97精品久久久久久久久久精品| 成年女人在线观看亚洲视频 | 亚洲av成人精品一二三区| 天天躁日日操中文字幕| 精品久久久久久久久久久久久| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品无大码| 一级毛片久久久久久久久女| 成人鲁丝片一二三区免费| 尾随美女入室| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩一区二区三区影片| 伦理电影大哥的女人| 最新中文字幕久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费黄网站久久成人精品| 伦理电影大哥的女人| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产成人a∨麻豆精品| 成年av动漫网址| 精品酒店卫生间| 亚洲国产精品sss在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久精品久久久久久久性| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲欧洲国产日韩| 欧美成人一区二区免费高清观看| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美日韩综合久久久久久| 国产av在哪里看| 久久久久久国产a免费观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 少妇的逼水好多| 国产黄频视频在线观看| 观看美女的网站| 免费看日本二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 免费大片黄手机在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲人成网站高清观看| 午夜日本视频在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久久久久久大尺度免费视频| 中文字幕制服av| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲18禁久久av| 老司机影院成人| 赤兔流量卡办理| 日本黄大片高清| 九色成人免费人妻av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 内射极品少妇av片p| 男人舔奶头视频| av在线天堂中文字幕| 日韩av在线大香蕉| 久热久热在线精品观看| 国产精品.久久久| 久久久久久伊人网av| 男人和女人高潮做爰伦理| 成人一区二区视频在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 午夜免费激情av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 只有这里有精品99| 色播亚洲综合网| 国产在视频线在精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 欧美一级a爱片免费观看看| av在线蜜桃| 久久久精品欧美日韩精品| 男人狂女人下面高潮的视频| 女人久久www免费人成看片| 热99在线观看视频| 亚洲成人久久爱视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 97热精品久久久久久| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 超碰97精品在线观看| 老司机影院毛片| 天堂√8在线中文| 久久99热6这里只有精品| 亚洲色图av天堂| 精品一区二区免费观看| 一级毛片我不卡| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品,欧美精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久99热这里只频精品6学生| 天堂影院成人在线观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品久久视频播放| 18+在线观看网站| 免费观看a级毛片全部| 好男人视频免费观看在线| 国产精品蜜桃在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 国产精品人妻久久久久久| 大香蕉久久网| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 床上黄色一级片| 人妻少妇偷人精品九色| 国产色爽女视频免费观看| 久久久精品免费免费高清| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美最新免费一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产精品一区二区三区四区久久| 春色校园在线视频观看| 中文字幕av在线有码专区| 美女主播在线视频| 99久久精品国产国产毛片| 免费看不卡的av| 国产一区二区在线观看日韩| 男女视频在线观看网站免费| 联通29元200g的流量卡| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 在线免费十八禁| 亚洲最大成人中文| 日韩av免费高清视频| 97精品久久久久久久久久精品| 黄色一级大片看看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 天堂影院成人在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品人妻熟女av久视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久久久久久久久久丰满| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | videos熟女内射| 日韩av不卡免费在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲,欧美,日韩| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产精品国产三级国产专区5o| 黄色日韩在线| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲国产精品国产精品| 哪个播放器可以免费观看大片| 插阴视频在线观看视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app| 全区人妻精品视频| 午夜亚洲福利在线播放| 午夜久久久久精精品| av在线观看视频网站免费| 亚洲精品国产av成人精品| 高清视频免费观看一区二区 | 久久久久久久久中文| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产成人aa在线观看| 黄色日韩在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 一级爰片在线观看| av国产免费在线观看| 一本一本综合久久| 国产成人精品福利久久| 成人特级av手机在线观看| 伊人久久国产一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 久久久欧美国产精品| 又大又黄又爽视频免费| 韩国av在线不卡| h日本视频在线播放| 欧美精品国产亚洲| 国产91av在线免费观看| 只有这里有精品99| 国产精品熟女久久久久浪| 人人妻人人看人人澡| 亚洲真实伦在线观看| 在线播放无遮挡| 亚洲熟女精品中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 永久网站在线| 在线观看免费高清a一片| 欧美高清成人免费视频www| 美女国产视频在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 又爽又黄无遮挡网站| 我的老师免费观看完整版| 免费观看性生交大片5| 成人一区二区视频在线观看| 国产 亚洲一区二区三区 | 麻豆乱淫一区二区| 国产永久视频网站| 亚洲va在线va天堂va国产| 免费看不卡的av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久99热6这里只有精品| 麻豆久久精品国产亚洲av| 91久久精品国产一区二区成人| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av男天堂| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲最大成人中文| 日本免费a在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产成人91sexporn| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产有黄有色有爽视频| 欧美zozozo另类| 国产成人午夜福利电影在线观看| xxx大片免费视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av国产av综合av卡| 午夜爱爱视频在线播放| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 精品不卡国产一区二区三区| 一个人观看的视频www高清免费观看| 联通29元200g的流量卡| 国产成人精品婷婷| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲伊人久久精品综合| 日本三级黄在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 97精品久久久久久久久久精品| 大话2 男鬼变身卡| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 午夜亚洲福利在线播放| 特级一级黄色大片| 听说在线观看完整版免费高清| 成人欧美大片| 亚洲av福利一区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 91av网一区二区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩欧美 国产精品| 最后的刺客免费高清国语| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲伊人久久精品综合| 成年人午夜在线观看视频 | 特级一级黄色大片| eeuss影院久久| 国模一区二区三区四区视频| 成年女人在线观看亚洲视频 | 少妇被粗大猛烈的视频| 好男人在线观看高清免费视频| 日韩成人伦理影院| 26uuu在线亚洲综合色| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 午夜老司机福利剧场| 秋霞伦理黄片| 亚洲欧洲国产日韩| 大片免费播放器 马上看| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲怡红院男人天堂| 婷婷色av中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 亚洲国产色片| 国产有黄有色有爽视频| 一本久久精品| 欧美最新免费一区二区三区| 久久97久久精品| 久久久久久久久久成人| av一本久久久久| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 日韩欧美一区视频在线观看 | 免费观看精品视频网站| 久久人人爽人人爽人人片va| 十八禁国产超污无遮挡网站| 日韩欧美三级三区| 国产在视频线在精品| 亚洲欧洲国产日韩| 丝瓜视频免费看黄片| 看非洲黑人一级黄片| 午夜福利成人在线免费观看| 少妇丰满av| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 日韩中字成人| 午夜精品国产一区二区电影 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 两个人的视频大全免费| 亚洲成人久久爱视频| 久久热精品热| 三级国产精品片| 国产黄频视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| 只有这里有精品99| 亚洲精品456在线播放app| 日本色播在线视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品国产三级普通话版| 日本三级黄在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲精品456在线播放app| 日韩欧美精品v在线| 91精品国产九色| 亚洲精品日韩av片在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 国产精品久久久久久精品电影| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲天堂国产精品一区在线| 高清av免费在线| 人人妻人人看人人澡| 国产精品女同一区二区软件| 久久鲁丝午夜福利片| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美区成人在线视频| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲av在线观看美女高潮| 搡女人真爽免费视频火全软件| av线在线观看网站| 亚州av有码| 日韩欧美国产在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩av不卡免费在线播放| 青春草国产在线视频| 日本午夜av视频| 中文字幕制服av| 久久久久久久久大av| 国产乱人偷精品视频| 精品国产三级普通话版| 免费少妇av软件| a级毛片免费高清观看在线播放| 色5月婷婷丁香| 一二三四中文在线观看免费高清| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 精品久久久噜噜| 欧美另类一区| 欧美激情国产日韩精品一区| 午夜福利视频精品| 国产有黄有色有爽视频| 51国产日韩欧美| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美 日韩 精品 国产| 热99在线观看视频| 国产色婷婷99| 国产精品女同一区二区软件| 夫妻性生交免费视频一级片| 简卡轻食公司| 国产 一区精品| 成年av动漫网址| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲精品一二三| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国内精品一区二区在线观看| 高清欧美精品videossex| 永久网站在线| 久久久久精品性色| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 尾随美女入室| 免费观看无遮挡的男女| 国产av码专区亚洲av| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日本午夜av视频| 午夜亚洲福利在线播放| 成年女人在线观看亚洲视频 | 特级一级黄色大片| 日韩欧美精品免费久久| 日韩av免费高清视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 哪个播放器可以免费观看大片| av女优亚洲男人天堂| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 乱系列少妇在线播放| av在线观看视频网站免费| 最近的中文字幕免费完整| 婷婷色综合大香蕉| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 色吧在线观看| 午夜久久久久精精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男女视频在线观看网站免费| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 成人午夜高清在线视频| 在线天堂最新版资源| 午夜免费激情av| 久久久午夜欧美精品| 韩国av在线不卡| 久久这里只有精品中国| 国产欧美日韩精品一区二区| 久久久久久国产a免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产探花极品一区二区| 99久久中文字幕三级久久日本| 如何舔出高潮| 国产永久视频网站| 在线 av 中文字幕| 国产伦理片在线播放av一区| 精品久久久久久久久av| 18禁动态无遮挡网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产高清国产精品国产三级 | 日韩一区二区视频免费看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲精品自拍成人| 日韩一区二区三区影片| 街头女战士在线观看网站| 51国产日韩欧美| 搡女人真爽免费视频火全软件| 99热这里只有精品一区| 久久久国产一区二区| a级一级毛片免费在线观看| 国产免费视频播放在线视频 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 99久久人妻综合| 最新中文字幕久久久久| 日韩欧美一区视频在线观看 | 青春草国产在线视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 91精品国产九色| 美女主播在线视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 午夜激情欧美在线| 免费av不卡在线播放| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲18禁久久av| 亚洲国产成人一精品久久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久久欧美国产精品| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久精品一区二区三区| 欧美精品一区二区大全| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 三级经典国产精品| or卡值多少钱| 尾随美女入室| 日韩三级伦理在线观看| 久热久热在线精品观看| 国产男女超爽视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 日本熟妇午夜| 国产精品爽爽va在线观看网站| 看黄色毛片网站| 国产男人的电影天堂91| 国产69精品久久久久777片| 老司机影院毛片| 欧美性感艳星| 国产色婷婷99| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 日韩一本色道免费dvd| 51国产日韩欧美| 国产有黄有色有爽视频| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲色图av天堂| 丰满乱子伦码专区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品伦人一区二区| 免费观看av网站的网址| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲欧美成人精品一区二区| 99九九线精品视频在线观看视频| 精品久久久噜噜| 亚洲伊人久久精品综合| 国产综合懂色| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在现免费观看毛片| 亚洲成人av在线免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 色视频www国产| 少妇人妻一区二区三区视频| 老司机影院成人| 国产69精品久久久久777片| 永久网站在线| 一区二区三区四区激情视频| 黄色一级大片看看| 搡老乐熟女国产| 日韩电影二区| 中国国产av一级| 成人欧美大片| or卡值多少钱| 亚洲三级黄色毛片| 美女国产视频在线观看| 天堂网av新在线| av免费在线看不卡| 特大巨黑吊av在线直播|