PACAP作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究進(jìn)展*

陳丹丹 綜述，劉娟娟，李 麗 審校

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)系，山東 煙臺(tái) 264100)

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)是1989年由ARIMURA等從綿羊下丘腦中分離出的一種內(nèi)源性神經(jīng)肽，因其具有刺激大鼠垂體前葉細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的合成而命名。PACAP包括含有38個(gè)氨基酸的PACAP-38和含有27個(gè)氨基酸的PACAP-27。PACAP-38羧基末端(C端)第27位點(diǎn)(Gly28-Lys29-Arg30)酰胺化后形成PACAP-27，二者在氨基末端(N端)保有相同的27位氨基酸序列，都具備激活腺苷酸環(huán)化酶(AC)的作用。其中，人類的PACAP-27與血管活性腸肽(VIP)有68%的氨基酸序列保守性，因此PACAP被認(rèn)為是分泌素/胰高血糖素/生長(zhǎng)激素釋放激素/VIP超家族新的成員。研究表明，VIP和PACAP都是體內(nèi)廣泛分布的肽類激素，在許多不同的器官和組織中充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)，具有多種生物活性[1-2]。

1 PACAP與信號(hào)通路

1.1PACAP及其受體 PACAP和VIP通過在體內(nèi)與細(xì)胞膜上的B家族G蛋白偶聯(lián)受體特異性結(jié)合而發(fā)揮作用。根據(jù)PACAP和VIP 2種結(jié)合位點(diǎn)的特點(diǎn)進(jìn)行分類：Ⅰ型位點(diǎn)與PACAP高度結(jié)合，是VIP的1 000多倍；Ⅱ型位點(diǎn)與VIP及PACAP親和力相當(dāng)。后者又被進(jìn)一步細(xì)分為2類。隨后，克隆出2類3型：與PACAP高度結(jié)合而與VIP親和力低的命名為PAC1受體(PAC1R)；與PACAP/VIP親和力相當(dāng)?shù)拿麨閂PAC1受體(VPAC1R)和VPAC2受體(VPAC2R)。由于PAC1R第1個(gè)或第2個(gè)28氨基酸殘基組成的“hop”和“hip”盒不同，PAC1R又可以分為不同的亞型，其中Null、Hop1和Hop2亞型均參與AC和磷脂酶C(PLC)信號(hào)通路，而hip亞型僅誘導(dǎo)AC激活。VPACR是否存在亞型尚不清楚，主要參與AC信號(hào)通路。PACAP均可與上述受體亞型結(jié)合觸發(fā)不同的信號(hào)通路：PAC1R與G蛋白偶聯(lián)受體α亞單位激動(dòng)型G蛋白(Gs)和PLC型G蛋白(Gq)結(jié)合，介導(dǎo)了AC/PLC/二?；视?DAG)/肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)信號(hào)級(jí)聯(lián)。

1.2PACAP的分布 PACAP及其受體在全身不同的器官中廣泛分布，包括神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位。在神經(jīng)系統(tǒng)，PACAP作為神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)調(diào)質(zhì)或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，在神經(jīng)元發(fā)育、保護(hù)和再生中起重要作用，并且在病理生理?xiàng)l件下可能具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。PACAP不僅直接影響神經(jīng)元功能，還影響許多神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的功能，同時(shí)在神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、肌萎縮側(cè)索硬化、視網(wǎng)膜病變及神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面均參與疾病的發(fā)生發(fā)展，而且PACAP可以通過血腦屏障。在內(nèi)分泌系統(tǒng)，PACAP可影響機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)、晝夜節(jié)律和心臟興奮性等。在生殖系統(tǒng)，參與下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)。PACAP在腫瘤作用方面具有爭(zhēng)議，一方面其在某些情況下促進(jìn)了細(xì)胞增殖；另一方面其通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

1.3PACAP參與的信號(hào)通路

1.3.1PACAP參與cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路的調(diào)節(jié) 活化的PAC1R與Gs結(jié)合，促使腺苷三磷酸(ATP)經(jīng)AC催化后生成cAMP，cAMP作為第二信使進(jìn)一步激活蛋白激酶A(PKA)，PKA是cAMP作用的底物，其由2個(gè)催化亞基和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成，cAMP與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合后釋放催化亞基，催化亞基釋放進(jìn)入細(xì)胞核與環(huán)磷腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)結(jié)合且在絲氨酸133位點(diǎn)(Ser133)磷酸化，磷酸化后的CREB與細(xì)胞核內(nèi)的cAMP反應(yīng)元件(CRE)特異性結(jié)合形成復(fù)合物，激活靶基因的表達(dá)[3]。cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元的再生、修復(fù)，膠質(zhì)細(xì)胞的功能有關(guān)[4]。

1.3.2PACAP參與PLC/PIP2/DAG/IP3/PKC信號(hào)通路 PAC1R與Gq蛋白結(jié)合，激活PLC，PLC將細(xì)胞膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)分解為DAG和IP3。IP3動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子(Ca2+)到細(xì)胞質(zhì)中與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，隨后參與靶蛋白磷酸化等一系列反應(yīng),DAG在Ca2+的協(xié)同下激活蛋白激酶C(PKC)，然后通過PKC引起靶基因轉(zhuǎn)錄等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)行細(xì)胞的應(yīng)答[5]。

1.3.3PACAP參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信號(hào)通路 PI3Ks蛋白家族參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K活性的增加常與多種癌癥相關(guān)[6]。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PACAP可能通過PI3K/Akt信號(hào)通路參與施萬(wàn)細(xì)胞髓鞘形成過程[7]。PAC1R與Gq蛋白結(jié)合激活PI3K，后者將質(zhì)膜上的PIP2磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，PIP3作為第二信使與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt結(jié)合，將胞漿中的Akt募集到質(zhì)膜上，3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1(PDK1)和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2(mTOR2)激活A(yù)kt，促使Akt蛋白Thr308位點(diǎn)和Ser473位點(diǎn)磷酸化而致Akt活化[8]?；罨腁kt通過磷酸化作用激活特異性底物，如p27、抗凋亡蛋白Bcl-2等，通過調(diào)控此類底物在胞漿和胞核的定位影響細(xì)胞的增殖周期和腫瘤進(jìn)展[9-10]，或抑制如caspase-9、caspase-3等，抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡。

張力蛋白同源磷酸酶(PTEN)可以通過將膜上的Akt去磷酸化逆轉(zhuǎn)形成PIP2，進(jìn)而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，起到抑制膠質(zhì)瘤進(jìn)展[11]和血管新生的作用。另外，PACAP還通過PAC1受體參與絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MAPK/ERK)信號(hào)通路的激活來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性[12]。

2 PACAP對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的影響

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種。而成人中最常見的神經(jīng)膠質(zhì)瘤是彌漫性膠質(zhì)瘤。彌漫性膠質(zhì)瘤根據(jù)其細(xì)胞類型的不同分為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突-星形膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤等。星形細(xì)胞瘤是起源于星形細(xì)胞的原發(fā)性腫瘤，也是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是成人最常見、最具侵襲性的原發(fā)性腦腫瘤。GBM具有細(xì)胞異質(zhì)性高，呈彌漫性浸潤(rùn)、高度侵入性、異常血管生成等特點(diǎn)[13]。盡管采用包括手術(shù)治療、放療和替莫唑胺在內(nèi)的多模式治療方法，但GBM患者的預(yù)后不良，患者的中位生存期僅為14～17個(gè)月,繼發(fā)性GBM患者的總體5年生存率只有5%[14]。大規(guī)模的基因組研究根據(jù)癌癥基因組圖譜推斷出了GBM多種突變亞型，包括TP53、PTEN、神經(jīng)纖維蛋白-1和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等。PACAP及其相關(guān)受體在人腦膠質(zhì)瘤中的普遍表達(dá)。學(xué)者們通過幾種膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外模型研究了PACAP的功能作用。

2.1PACAP抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、遷移

2.1.1普通條件下PACAP對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的影響 VERTONGEN等[15]率先報(bào)道，PACAP顯著降低了T98G人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。通過PACAP作用于2種人類GBM細(xì)胞系(M059K和M59J細(xì)胞)，證明PACAP通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制了瘤細(xì)胞侵襲、遷移，但是對(duì)細(xì)胞增殖沒有影響[16]。PACAP還可通過阻斷PI3K/Akt和Sonic Hedgehog-GLI1(Shh/GLI1)通路抑制GBM的侵襲[17]。PACAP通過VPAC受體系統(tǒng)影響PI3K/Akt信號(hào)通路，降低M059K、M059J和U87MG的侵襲、遷移[16]。

2.1.2乏氧微環(huán)境下PACAP對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的影響 GBM由浸潤(rùn)細(xì)胞、基質(zhì)、血管、細(xì)胞因子和周圍基質(zhì)組成的異質(zhì)性腫塊，腫瘤快速增長(zhǎng)造成的乏氧微環(huán)境是包括GBM在內(nèi)的各種實(shí)體瘤的共同特征。GBM和其他實(shí)體瘤一樣，含有與組織壞死和異常新生血管形成相關(guān)的廣泛缺氧區(qū)域。乏氧微環(huán)境還驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中低氧誘導(dǎo)因子(HIF)的轉(zhuǎn)錄，HIF是由HIF-1α和HIF-1β構(gòu)成的異二聚體。正常情況下，HIF-1α可在脯氨酸和E3泛素-蛋白連接酶的作用下降解。但是，在氧缺乏的環(huán)境下，HIF-1α的降解被抑制，導(dǎo)致其與HIF-1β形成異二聚體，后者通過與多種基因啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件(HREs)結(jié)合，促進(jìn)靶基因如血管內(nèi)皮源性生長(zhǎng)因子(VEGF)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]。VEGF一直被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤血管生成最重要的生長(zhǎng)因子,介導(dǎo)了新生血管的形成。HIF-1α與VEGF協(xié)同促進(jìn)腫瘤血管的新生[19]。mTOR是PI3K/Akt信號(hào)通路的下游底物之一，PI3K/Akt/mTOR通路通過調(diào)控單核巨噬細(xì)胞的活動(dòng)介導(dǎo)血管新生，mTOR也可以促進(jìn)VEGF的分泌表達(dá)[19-20]。因此，膠質(zhì)瘤中形成的乏氧微環(huán)境導(dǎo)致HIF-1α、VEGF、mTOR的增加，三者相互作用促進(jìn)了膠質(zhì)瘤中血管的新生和增加，也與腫瘤細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)侵襲密切相關(guān)。PI3K/Akt可負(fù)性調(diào)節(jié)血管生成素2(Ang2)，促進(jìn)血管生成[21]。乏氧微環(huán)境和HIF的激活誘導(dǎo)實(shí)體瘤核心區(qū)EGFR過度表達(dá)。

表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是1962年COHEN發(fā)現(xiàn)的可以與EGFR結(jié)合并激活后者。EGFR是跨膜受體酪氨酸激酶ERBB家族的一員，其由3部分組成，包括位于胞外的配體結(jié)合域、膜上的跨膜域和胞內(nèi)酪氨酸激酶域。EGFR通過與細(xì)胞外配體結(jié)合被激活，隨后出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化。EGF/EGFR信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和遷移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[22-23]，與PACAP及膠質(zhì)瘤密切相關(guān)的，如EGFR/PI3K/Akt信號(hào)通路和EGFR/Ras/Raf/MAPK信號(hào)通路。有報(bào)道指出，GBM中經(jīng)常觀察到EGFR擴(kuò)增，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)在數(shù)個(gè)GBM樣本中由于EGFR的高表達(dá)，導(dǎo)致PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活而影響細(xì)胞功能，包括增殖、侵襲、血管生成和抗凋亡。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Akt的激活被證實(shí)可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、血管生成和遷移[24]。因此，EGF與EGFR表達(dá)水平的異常被認(rèn)為與GBM發(fā)展過程密切相關(guān)。腫瘤乏氧微環(huán)境的作用不僅促進(jìn)血管生成，同時(shí)還促進(jìn)腫瘤上皮細(xì)胞向更惡性的間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變即上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[25]。EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵過程。研究發(fā)現(xiàn)，在乏氧環(huán)境中，PACAP可以通過抑制PI3Ks-Akt和MAPK/ERK信號(hào)通路降低Ser473位點(diǎn)的磷酸化，降低乏氧環(huán)境中U87MG細(xì)胞中HIF-1α、HIF-2α和EGFR的表達(dá)來(lái)對(duì)抗缺氧介導(dǎo)的GBM細(xì)胞遷移[26]。

研究證明，PACAP可以調(diào)控低氧環(huán)境中的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中VEGF及其受體的表達(dá)[27]。PACAP也可通過PI3K/Akt和MAPK/ERK途徑抑制來(lái)降低乏氧環(huán)境中U87MG細(xì)胞中VEGF的表達(dá)和分泌，進(jìn)而減少新血管的形成。同時(shí)，降低了EMT標(biāo)志物的表達(dá)：波形蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9，恢復(fù)了閉鎖小帶蛋白1(ZO-1)的表達(dá)水平，抑制了腫瘤細(xì)胞的EMT過程[28]，降低了GBM侵襲性。

2.1.3能量缺乏(CR)微環(huán)境中PACAP對(duì)膠質(zhì)瘤的影響 不僅乏氧微環(huán)境的改變會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的生物活性，與營(yíng)養(yǎng)不良無(wú)關(guān)的CR也可以廣泛有效地預(yù)防癌癥[29]。血清剝奪實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CR能降低細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞自噬和DNA修復(fù)過程，還可以降低細(xì)胞微環(huán)境中激素的合成代謝、生長(zhǎng)因子和活性氧等多種致癌物質(zhì)的水平，通過干擾腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，降低細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[30]。

神經(jīng)膠質(zhì)源性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中高表達(dá)的巢蛋白(nestin)。GMB中的nestin表達(dá)通常高于侵襲性較小的膠質(zhì)瘤，表明nestin的表達(dá)與腫瘤惡性度之間存在相關(guān)性。因此，可以通過檢測(cè)nestin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)水平的增加來(lái)判斷腫瘤的預(yù)后。另一方面，GFAP表達(dá)的降低與膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和惡性程度成反比，此現(xiàn)象在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中比在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中更為突出。血清剝奪實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，CR通過顯著降低細(xì)胞周期蛋白D1和Bcl-2的水平，增加p53和裂解的caspase-3的表達(dá)而抑制細(xì)胞增殖，而給予PACAP可以通過激活PAC1/VPACR介導(dǎo)的過程，進(jìn)一步降低CR環(huán)境中nestin的表達(dá)，增加細(xì)胞的凋亡和GFAP的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度，降低腫瘤細(xì)胞增殖的作用[31]。

2.2PACAP促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖 研究證明，在小鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，PACAP通過PAC1R，提高了瘤細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的能力[32]。PACAP-27在1 pmol/L至10 nmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有顯著促增殖能力，且伴劑量依賴性[33]。PACAP-38顯著上調(diào)人多形性惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)mRNA的表達(dá)，使得CREB磷酸化轉(zhuǎn)錄機(jī)制的激活及隨后新的BDNF-轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，于PACAP-38處理72 h后，觀察到T98G細(xì)胞釋放BDNF[34]，BDNF作為細(xì)胞因子，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用。出現(xiàn)相反的結(jié)果可能是由于細(xì)胞系的來(lái)源，PACAP作用的時(shí)間、濃度及腫瘤微環(huán)境之間的相互影響所致。

3 小 結(jié)

PACAP是在體內(nèi)分布廣泛的一種內(nèi)源性神經(jīng)肽，具有調(diào)控包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)生理功能的特點(diǎn)。PACAP可以通過包括cAMP/PKA/CREB、PI3K/Akt等多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移。膠質(zhì)瘤組織的腫瘤細(xì)胞來(lái)源不明確，細(xì)胞組成復(fù)雜，加之各種細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的信息交流共同構(gòu)成膠質(zhì)瘤微環(huán)境。PACAP在不同的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮的作用各不相同。在乏氧和CR的微環(huán)境中具有抑制細(xì)胞增殖遷徙的作用，這一發(fā)現(xiàn)有望成為抑制膠質(zhì)瘤惡性增殖、侵襲遷移和血管新生的潛在靶點(diǎn)。但是，這一發(fā)現(xiàn)還停留在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段，未來(lái)有望通過體內(nèi)試驗(yàn)驗(yàn)證PACAP的作用，以更好地評(píng)估其對(duì)膠質(zhì)瘤的作用效果?？傊?，從分子信號(hào)通路出發(fā)，通過體內(nèi)、體外研究深入探索PACAP在腫瘤微環(huán)境的相關(guān)分子機(jī)制，為治療膠質(zhì)瘤提供新的方向，為人類腫瘤的治療提供新的曙光。