高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定復(fù)方赤紅顆粒中沒(méi)食子酸和原兒茶酸含量*

鄭小麗，胡曉波，鄭志昌，李 明，楊繼紅，廖尚高

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550001；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001）

復(fù)方赤紅顆粒為貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院名中醫(yī)王光義教授的經(jīng)驗(yàn)方，該方由赤芍、川續(xù)斷、伸筋草、雞血藤、紅花、路路通、牛膝、獨(dú)活、杜仲、防風(fēng)、川芎、秦艽、細(xì)辛和沒(méi)藥經(jīng)現(xiàn)代工藝制備而成，有活血化瘀、舒筋活絡(luò)、抗炎止痛等功效［1-3］，臨床多用于治療風(fēng)濕痹癥、關(guān)節(jié)疼痛、手腳冰冷等癥，療效較好。為進(jìn)一步保證制劑質(zhì)量穩(wěn)定、使用安全性及臨床療效，本研究中參考文獻(xiàn)［4 - 5］，選擇制劑中沒(méi)食子酸和原兒茶酸為定量指標(biāo)成分，并采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定兩者含量，旨在為該制劑的質(zhì)量控制提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；SPD-10A型紫外檢測(cè)器、WML-2006C-4型威瑪龍色譜數(shù)據(jù)工作站、TG332A 型分析天平（精度為0.01 mg），均購(gòu)于島津儀器（蘇州）有限公司；LIBROR AEL - 160 型電子分析天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，精度為0.1 mg）；HS10260D 型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復(fù)方赤紅顆粒（貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，批號(hào)分別為20210301，20210302，20210303，規(guī)格為每袋10 g）；沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)為110831 - 201906，含量91.5%），原兒茶酸對(duì)照品（批號(hào)為110809-201906，含量97.7%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Elite Supersil ODS - B C18柱（250 mm ×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-1%醋酸溶液（8∶92，V/V）；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：取干燥至恒重的原兒茶酸對(duì)照品10 mg，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL，取1 mL，用甲醇定容至100 mL，得溶液Ⅰ。取干燥至恒重的沒(méi)食子酸對(duì)照品10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加溶液Ⅰ溶解并定容，即得。

供試品溶液：取樣品細(xì)粉0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入2%醋酸溶液0.5 mL，再加入乙酸乙酯20 mL，超聲（功率260 W，頻率40 kHz）20 min，濾過(guò)，揮干乙酸乙酯，殘?jiān)? mL甲醇溶解，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

空白對(duì)照溶液：按供試品溶液制備方法制備不加樣品的空白對(duì)照溶液［6-12］。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定?？瞻讓?duì)照溶液色譜圖中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)保留時(shí)間處無(wú)干擾峰，表明專屬性良好。詳見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.Gallic acid 2.Protocatechuic acid A.Mixed reference solution B.Test solution C.Blank reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密量取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為50，100，200，400，800，1 600μg/mL 的沒(méi)食子酸系列對(duì)照品溶液；精密量取原兒茶酸對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為2.625，5.250，10.500，21.000，42.000，84.000 μg/ mL的原兒茶酸系列對(duì)照品溶液；均按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y沒(méi)=24 154X沒(méi)- 453 988（R2= 0.999 8，n= 6）和Y原=38 964X原-12 458（R2=0.999 9，n=6）。結(jié)果表明，沒(méi)食子酸和原兒茶酸質(zhì)量濃度分別在50～1 600μg/mL 和2.625～84.000μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸和原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.79%和1.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品（批號(hào)為20210301）溶液適量，分別于0，1，2，3，4，5 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果沒(méi)食子酸和原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.35%和1.42%（n= 6），表明供試品溶液室溫下放置5 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20210301）適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果沒(méi)食子酸和原兒茶酸平均含量分別為0.936 8 mg/g和0.043 3 mg/g，RSD分別為0.95%和1.52%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為20210301）適量，共9份，每份約0.25 g，精密稱定，分別置100 mL容量瓶?jī)?nèi)，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（含沒(méi)食子酸234.2μg/mL、原兒茶酸10.82 μg/ mL）0.8，1.0，1.2 mL，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，平行2份，每份約0.5 g，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品中沒(méi)食子酸和原兒茶酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of the content determination of gallic acid and protocatechuic acid in samples（mg/g，n=2）

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分選擇

復(fù)方赤紅顆粒由多味中藥材組方，成分復(fù)雜，目前尚無(wú)統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。沒(méi)食子酸和原兒茶酸具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，是治療風(fēng)濕痹癥的有效成分［13-14］，其含量直接影響該制劑的療效，故本研究中確定沒(méi)食子酸和原兒茶酸為該制劑的含量測(cè)定指標(biāo)成分。

3.2 提取溶劑選擇

使用不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇及乙酸乙酯等為提取溶劑，進(jìn)行篩選和優(yōu)化。結(jié)果顯示，以2%醋酸溶液+乙酸乙酯為提取溶劑時(shí)，沒(méi)食子酸和原兒茶酸的提取率均較高，故選擇其為提取溶劑。

3.3 超聲時(shí)間選擇

保持提取溶劑不變，考察不同超聲時(shí)間（10，20，30，40，50，60 min）對(duì)結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，超聲20 min和30 min 的提取率和提取效率基本一致，且均高于40，50，60 min時(shí)，從提高工作效率及節(jié)約能源方面考慮，確定超聲時(shí)間為20 min。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC 法專屬性好，分離度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于同時(shí)測(cè)定復(fù)方赤紅顆粒中沒(méi)食子酸和原兒茶酸的含量，并為下一步更有效地控制該制劑的質(zhì)量提供參考。