原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解及增殖的影響

劉經(jīng)州，楊紅群，馬東旺

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 承德067000； 2.承德市婦幼保健院，河北 承德067000； 3.天津市人民醫(yī)院，天津 300000）

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤類型之一，其發(fā)病率在消化道腫瘤中高居第三位，嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全［1］。盡管手術(shù)輔以化療、免疫治療顯著提高結(jié)腸癌患者生存率，但仍存在嚴(yán)重的不良反應(yīng)和毒副作用。近年來，天然化合物在人類癌癥防治中的作用受到特別關(guān)注。原兒茶酸是一種廣泛存在的天然酚酸，具有抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗纖維化以及心血管和神經(jīng)保護(hù)活性［2?3］。研究顯示，原兒茶酸顯著抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并抑制二乙基亞硝胺／苯巴比妥誘發(fā)的小鼠肝細(xì)胞癌形成［4?5］。但其在結(jié)腸癌中的抗腫瘤機(jī)制并未完全闡明。長非編碼RNA（lncRNAs）是由200多個(gè)核苷酸組成的RNA 轉(zhuǎn)錄本，其通過轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因組印跡等參與調(diào)節(jié)多種人類惡性腫瘤的生理和病理過程，是癌癥治療的潛在靶點(diǎn)［6?7］。研究顯示，lncRNA心肌素基因（MYOSLID）在骨肉瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)增加，干擾MYOSLID可降低細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［8?9］。然而MYOSLID在結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用鮮有研究。糖酵解代謝活躍、過度增殖是腫瘤細(xì)胞的重要特征，本研究擬從糖酵解、增殖角度研究原兒茶酸、MYOSLID在結(jié)腸癌中的抗腫瘤作用，探討其潛在分子機(jī)制，以期為原兒茶酸用于防治結(jié)腸癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織來源 收集2018 年1 月至2019 年1 月于承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織樣本及癌旁組織樣本（距離腫瘤邊緣5 cm 處癌旁黏膜組織）共41 對(duì)，男23例，女18 例，所有患者術(shù)前未接受放療、化療或免疫治療等輔助治療。該研究獲得承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和患者知情同意（2018000421）。

1.2 細(xì)胞 人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。

1.3 藥物和試劑 原兒茶酸（純度≥98%，生產(chǎn)批號(hào)809?201603）購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；小干擾RNA 序列片段（si?RNA）、質(zhì)粒（pcDNA）購于廣州復(fù)能基因有限公司；TRIzol 試劑、乳酸檢測(cè)試劑盒、葡萄糖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK?8）購自北京索萊寶生物科技有限公司；第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；羊抗兔IgG 二抗（7074）、兔源細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）（55506）、p21（2947）、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）（5174）單克隆抗體購于上海賽信通生物試劑有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 SW620 細(xì)胞采用補(bǔ)充10% 胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞70%融合時(shí)，胰酶消化，按照1 ∶3 比例稀釋，將細(xì)胞接種于新的培養(yǎng)瓶中，每2 d 換液1次，取對(duì)數(shù)期SW620 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用原兒茶酸終濃度分別為0、5、10、20 μmol／L 的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞48 h，分別命名為對(duì)照組、原兒茶酸低濃度組、原兒茶酸中濃度組和原兒茶酸高濃度組。為探討原兒茶酸的抗腫瘤作用和MYOSLID關(guān)系，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將si?NC、si?MYOSLID分別轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞，分別命名為si?NC 組、si?MYOSLID組；將pcDNA、pcDNA?MYOSLID 分別轉(zhuǎn)染SW620 細(xì)胞，用原兒茶酸終濃度20 μmol／L 的培養(yǎng)液處理轉(zhuǎn)染成功細(xì)胞48 h，分別命名為原兒茶酸＋pcDNA 組、原兒茶酸＋pcDNA?MYOSLID 組。

2.2 葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平檢測(cè) 采用乳酸檢測(cè)試劑盒、葡萄糖檢測(cè)試劑盒，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，3 000 r／min 離心獲得上清液。按照試劑盒說明書步驟，測(cè)定各組細(xì)胞的乳酸產(chǎn)量以及葡萄糖消耗量。

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè) 采用CCK?8 法。將未轉(zhuǎn)染的SW620細(xì)胞接種96 孔板，貼壁后用含5、10、20 μmol／L 原兒茶酸［8］的培養(yǎng)液（每孔100 μL）孵育48 h；將轉(zhuǎn)染si?NC 或轉(zhuǎn)染si?MYOSLID 的SW620 細(xì)胞接種96 孔板，培養(yǎng)48 h。將轉(zhuǎn)染pcDNA 或pcDNA?MYOSLID 的SW620 細(xì)胞接種96孔板，貼壁后用含20 μmol／L 原兒茶酸的培養(yǎng)液（每孔100 μL）孵育48 h，設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL 的CCK?8 溶液，再培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)量OD。增殖抑制率＝（1－OD實(shí)驗(yàn)組／OD對(duì)照組）×100%。

2.4 細(xì)胞克隆形成能力檢測(cè) 采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。各組取2 mL 細(xì)胞懸液（約5×102個(gè)細(xì)胞）接種到96 孔板中，米字型晃動(dòng)平板使細(xì)胞分散均勻。約培養(yǎng)14 d 時(shí)，用甲醇固定集落，用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)算大于50 個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

2.5 lncRNA MYOSLID 表達(dá)檢測(cè) 采用RT?PCR 法。TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA 后。采用第一鏈cDNA 合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green PCR 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)RT?qPCR。GAPDH 作 為MYOSLID的內(nèi)源 性對(duì)照，MYOSLID表達(dá)水平以2－△△Ct公式計(jì)算。MYOSLID正向5′?AAGAGGGAGTGGGAGTTAGGC?3′，正向 5′?CACTGTGGT GGGATCTGCAAG?3′；GAPDH正向 5′?TGATGACCCTTTT GGCTCCC?3′，反向5′?GAAGCTTGTCATCAA TGGAAAT?3′。

2.6 CyclinD1 和p21 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。

放射免疫測(cè)定（RIPA）緩沖液冰上裂解細(xì)胞30 min，離心收集上清液并測(cè)定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，并恒流轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。4 ℃下用5%脫脂奶粉將膜封閉12 h。棄去封閉液，室溫下加入特異性一抗溶液（1 ∶1 000）孵育膜2 h。隨后將膜與相應(yīng)二抗（1 ∶1 000）室溫下孵育2 h。洗膜后，加入顯影劑暗室反應(yīng)15 min，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Quantity One軟件對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行定量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組差異，采用單因素方差分析和SNK?q 檢驗(yàn)比較多組間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解的影響 與對(duì)照組比較，原兒茶酸低、中、高濃度組SW620 細(xì)胞葡萄糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量降低（P＜0.05），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見表1。

表1 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解的影響（，n＝9）

表1 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解的影響（，n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與原兒茶酸低濃度組比較，＃P＜0.05；與原兒茶酸中濃度組比較，＆P＜0.05。

3.2 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，原兒茶酸低、中、高濃度組SW620 細(xì)胞增殖抑制率、p21 蛋白表達(dá)升高，克隆形成數(shù)、CyclinD1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見表2、圖1。

表2 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響（， n＝9）

表2 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響（， n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與原兒茶酸低濃度組比較，＃P＜0.05；與原兒茶酸中濃度組比較，＆P＜0.05。

圖1 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響

3.3 lncRNAMYOSLID在結(jié)腸癌組織中的表達(dá) lncRNAMYOSLID在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較癌旁組織升高（P＜0.01）。見表3。

表3 lncRNA MYOSLID 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（，n＝3）

表3 lncRNA MYOSLID 在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（，n＝3）

注：與癌旁組織比較，**P＜0.01。

3.4 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞中l(wèi)ncRNAMYOSLID表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，原兒茶酸低、中、高濃度組SW620 細(xì)胞lncRNAMYOSLID的表達(dá)降低（P＜0.05），且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。見表4。

表4 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MYOSLID表達(dá)的影響（， n＝9）

表4 原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MYOSLID表達(dá)的影響（， n＝9）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與原兒茶酸低濃度組比較，＃P＜0.05；與原兒茶酸中濃度組比較，＆P＜0.05。

3.5 干擾lncRNAMYOSLID表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的影響 與si?NC 組比較，si?MYOSLID 組SW620細(xì)胞lncRNAMYOSLID表達(dá)降低，葡糖糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量、克隆形成數(shù)、以及CyclinD1 蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞增殖抑制率、p21 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見表5、圖2。

圖2 干擾lncRNA MYOSLID 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的影響

表5 干擾lncRNA MYOSLID 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的影響（， n＝9）

表5 干擾lncRNA MYOSLID 表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的影響（， n＝9）

注：與si?NC 組比較，**P＜0.01。

3.6 lncRNAMYOSLID過表達(dá)逆轉(zhuǎn)原兒茶酸（20 μmol／L）對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的作用與原兒茶酸＋pcDNA 組比較，原兒茶酸＋pcDNA?MYOSLID 組SW620 細(xì)胞lncRNAMYOSLID表達(dá)顯著升高，葡糖糖消耗量、乳酸產(chǎn)生量、克隆形成數(shù)以及CyclinD1 蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞增殖抑制率、p21 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見表6、圖3。

表6 lncRNA MYOSLID 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的作用（， n＝9）

表6 lncRNA MYOSLID 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞糖酵解和增殖的作用（， n＝9）

注：與原兒茶酸＋pcDNA 組比較，**P＜0.01。

圖3 lncRNA MYOSLID 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了原兒茶酸對(duì)結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞增殖的作用

4 討論

原兒茶酸存在于許多水果和蔬菜中，具有多種生物活性。Owumi 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸通過升高大鼠肝臟和腎臟中抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗細(xì)胞凋亡機(jī)制保護(hù)抗癌藥甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝腎毒性。Tsao 等［11］研究表明原兒茶酸以劑量依賴方式抑制肺癌細(xì)胞生長、降低線粒體膜電位和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，原兒茶酸通過抑制核因子κB（NF?κB）激活、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP?2）表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，抑制小鼠中黑色素瘤細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移［12］。以上研究表明，原兒茶酸具有防治人類癌癥的巨大潛力。糖酵解是癌細(xì)胞的重要生化特征之一，糖酵解不僅為腫瘤細(xì)胞提供充足的能量，而且為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供大量的生物合成原料，抑制糖酵解反應(yīng)可抑制結(jié)腸癌進(jìn)程［13］。CyclinD1 是G1到S 周期轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵介質(zhì)，其上調(diào)導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞的快速生長，而p21 則通過抑制G1到S 期轉(zhuǎn)換具有抗增殖作用［14?15］。本研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸以劑量依賴方式抑制葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生，抑制細(xì)胞增殖、克隆形成和CyclinD1 表達(dá)，促進(jìn)p21 表達(dá)。提示，原兒茶酸通過抑制SW620 細(xì)胞增殖和糖酵解反應(yīng)在結(jié)腸癌癌中具有抗腫瘤作用。

lncRNA 參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、周期分布、凋亡、遷移侵襲、糖酵解代謝等多個(gè)生物學(xué)過程，是人類癌癥進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)劑［16?17］。lncRNAMYOSLID在胃癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤大小，腫瘤分期、浸潤深度和生存時(shí)間相關(guān)，干擾MYOSLID表達(dá)可誘導(dǎo)凋亡和生長停滯，抑制裸鼠移植瘤形成［18］。此外，MYOSLID高表達(dá)可預(yù)測(cè)骨肉瘤患者預(yù)后不良，促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移［8］。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中MYOSLID表達(dá)水平顯著升高，轉(zhuǎn)染si?MYOSLID 干擾MYOSLID表達(dá)可降低SW620 細(xì)胞克隆形成能力，降低Cyclin D1 表達(dá)，提高p21 表達(dá)，降低乳酸消耗和葡萄糖產(chǎn)生量，這提示干擾MYOSLID 表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和糖酵解反應(yīng)。原兒茶酸處理后MYOSLID表達(dá)以劑量依賴方式降低，提示原兒茶酸的抗腫瘤作用可能與調(diào)節(jié)MYOSLID表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究證實(shí)，過表達(dá)MYOSLID降低了原兒茶酸對(duì)SW620 細(xì)胞增殖、克隆形成和糖酵解的抑制作用，恢復(fù)細(xì)胞增殖、糖酵解以及Cyclin D1 和p21 表達(dá)。提示，原兒茶酸通過下調(diào)MYOSLID在結(jié)腸中發(fā)揮抗腫瘤作用。

總之，原兒茶酸通過抑制SW620 細(xì)胞增殖和糖酵解反應(yīng)在結(jié)腸癌中具有抗腫瘤作用，其機(jī)制與下調(diào)MYOSLID表達(dá)有關(guān)，為原兒茶酸在結(jié)腸癌防治中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。