原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌的抑菌和減毒作用

蘆平，劉歡，肖苗，李瑩玉，趙燕妮

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

副溶血弧菌是具有兩套鞭毛系統(tǒng)的弧狀革蘭氏陰性病原菌，在自然環(huán)境中廣泛分布于河流與?？?，為魚(yú)、蝦的主要致病菌[1]。人如果誤食受副溶血弧菌污染的產(chǎn)品，會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致急性胃腸炎和敗血癥，引起感染者休克甚至死亡。近年來(lái)，由副溶血弧菌引起的相關(guān)病例報(bào)導(dǎo)激增，表明副溶血弧菌已成為一種重要的食源性致病菌。研究發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌具有胞外多糖、胞外蛋白酶、生物被膜、溶血毒素等多種毒力因子，這些毒力因子對(duì)副溶血弧菌在宿主體內(nèi)的定殖和病害的發(fā)生發(fā)揮著重要作用[2-4]。

食物腐敗現(xiàn)象普遍存在，食源性病原菌引起的食物中毒嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)以減少食品安全問(wèn)題的發(fā)生顯得格外重要。防腐劑廣泛應(yīng)用于食品保鮮，按來(lái)源可分為天然食品防腐劑和化學(xué)合成防腐劑，化學(xué)合成防腐劑因易累積、難代謝而具有潛在危害性，因此，來(lái)源安全的天然防腐劑更受消費(fèi)者的關(guān)注和認(rèn)可。植物多酚富含于許多草本植物中，展現(xiàn)出良好的抑菌活性，且具有抗腫瘤、防衰老、降血壓血脂等多種保健功能，在食品、生物與醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景[5,6]。原兒茶酸是植物體內(nèi)重要的酚酸，廣泛存在于茶葉、蔬菜和水果中，也是烏蕨、大血藤等中草藥的有效成分[7,8]。據(jù)報(bào)道，原兒茶酸具有抑菌[9]、抗腫瘤[10]、抗氧化[11,12]的效果。

本實(shí)驗(yàn)選取海產(chǎn)品中常見(jiàn)的副溶血弧菌作為供試菌，探究原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌的抑制作用，通過(guò)測(cè)定原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度、胞內(nèi)核酸和蛋白泄漏量、丙二醛（MDA）含量，同時(shí)通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)變化來(lái)評(píng)估原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌細(xì)胞膜的損傷作用。此外，選取1/4 MIC和1/2 MIC作為亞抑菌濃度，探究低濃度原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌毒力的衰減作用，為原兒茶酸在食品防腐中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

原兒茶酸（≥97%，色譜純），上海源葉生物科技有限公司；NaCl（≥99%，分析純），天津天力化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母粉，英國(guó)Oxoid集團(tuán)；天藍(lán)色皮粉，美國(guó)Sigma公司；瓊脂粉，上海生工股份有限公司；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，南京建成生物研究所；其他所用試劑均為市售分析純。

恒溫?fù)u床，江蘇同君儀器科技有限公司；電子分析天平，瑞士Mettler-Toledo集團(tuán)；高速離心機(jī)、多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific集團(tuán)；超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Quawell公司。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

副溶血弧菌（RIMD 2210633）由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Luria-Bertani broth，LB）（g/L）：蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，氯化鈉10.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將凍存在-80 ℃的菌種劃線至LB平板上培養(yǎng)，然后挑取單菌落接種到含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃恒溫?fù)u床中以轉(zhuǎn)速200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)菌培養(yǎng)液OD600為1.0（約5.0×106CFU/mL），以供后續(xù)使用。

1.3.2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定、亞抑制濃度（SICs）選擇和抑菌圈實(shí)驗(yàn)

采用二倍稀釋法[13]測(cè)定原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌的最小抑菌濃度，MIC定義為完全抑制副溶血弧菌生長(zhǎng)的最低原兒茶酸濃度，并選擇1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC三個(gè)濃度作為原兒茶酸的SICs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)周芳等[14]的方法，采用牛津杯法測(cè)定不同濃度原兒茶酸對(duì)副溶血性弧菌的抑菌活性。在培養(yǎng)皿中放置4個(gè)已滅菌的牛津杯，LB固體培養(yǎng)基滅菌后倒平板，培養(yǎng)基凝固后吸取100 μL菌懸液菌液涂布在平板上，風(fēng)干后取出牛津杯，然后吸取200 μL不同濃度的原兒茶酸溶液分別加入到孔中。將培養(yǎng)皿于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)24 h，以不加原兒茶酸為對(duì)照，測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.3.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

吸取50 μL活化的細(xì)菌培養(yǎng)液，加入至5 mL含有不同濃度（0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 mg/mL）原兒茶酸的LB液體培養(yǎng)基中，輕微振蕩，置于恒溫?fù)u床中37 ℃以轉(zhuǎn)速200 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。每隔1 h吸取200 μL培養(yǎng)液，以LB液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，測(cè)定OD600值，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 核酸和蛋白質(zhì)含量測(cè)定

根據(jù)Zhou等[15]的方法進(jìn)行修改，測(cè)定泄漏的核酸、蛋白質(zhì)含量。吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h后加入原兒茶酸進(jìn)行處理，孵育3 h后在4 ℃以10000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min，使用超微量分光光度計(jì)分別測(cè)定上清液核酸和蛋白質(zhì)的含量。

1.3.5 丙二醛（MDA）含量測(cè)定

吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h后加入原兒茶酸，處理3 h后，按照細(xì)胞丙二醛測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，對(duì)樣品中的MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考Giuliano[16]的實(shí)驗(yàn)方法加以修改，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6 h后加入原兒茶酸，處理3 h后離心吸取800 μL上清液甲醇氯仿以提取蛋白。離心棄去上清液，加入20 μL上樣緩沖液并沸水浴5 min，根據(jù)電泳樣品制備步驟進(jìn)行蛋白電泳。

1.3.7 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察

場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡對(duì)副溶血弧菌形態(tài)的觀察參照Shi等[17]的方法，具體步驟如下：吸取50 μL菌懸液接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)6 h后加入不同濃度原兒茶酸處理4 h。離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌后重懸在2.5%（V/V）的戊二醛水溶液中固定，于4 ℃靜置過(guò)夜。隨后，用不同濃度的乙醇（30%、50%、70%、90%、100%，V/V）進(jìn)行梯度脫水處理，每次脫水時(shí)間為10 min，將樣品于70 ℃烘干3～4 h至干燥，并裝載在載物臺(tái)，噴金后使用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.8 胞外多糖含量測(cè)定

于培養(yǎng)瓶中加入5 mL LB液體培養(yǎng)基，接種50 μL菌懸液，再加入不同濃度的原兒茶酸，混勻后于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)9 h。吸取1.5 mL菌液，以12000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min，取1 mL上清液加入3倍體積的95%乙醇并于4 ℃靜置過(guò)夜，以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，測(cè)定沉淀物中胞外多糖的含量。

1.3.9 胞外蛋白酶含量測(cè)定

于培養(yǎng)瓶中加入5 mL LB液體培養(yǎng)基，接種50 μL菌懸液，再加入不同濃度的原兒茶酸，混勻，置于恒溫?fù)u床上37 ℃培養(yǎng)9 h，測(cè)定在600 nm處的吸光度，記為OD1。吸取1.5 mL菌液，以10000 r/min轉(zhuǎn)速離心1 min，吸取1 mL上清加入新的培養(yǎng)瓶中，然后再加入1 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）和0.01 g天藍(lán)色皮粉（Hide Powder Azure，HPA，Sigma-Aldrich），于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 h，以轉(zhuǎn)速12000 r/min離心1 min，取上清液于600 nm處測(cè)量吸光度，記為OD2，分別計(jì)算OD2與OD1的比值并進(jìn)行作圖。

1.3.10 生物被膜含量測(cè)定

于培養(yǎng)瓶中加入5 mL LB液體培養(yǎng)基，接種50 μL菌懸液，再加入不同濃度的原兒茶酸，混勻后于37 ℃培養(yǎng)48 h以形成生物被膜。小心倒去培養(yǎng)液，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%（m/V）的結(jié)晶紫染色1 min，洗去多余染液后晾干，再加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%（V/V）的冰乙酸溶解生物被膜，并測(cè)定其在570 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)三次，并使用GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。當(dāng)p<0.05時(shí)表示顯著（圖中以*表示），p<0.01時(shí)表示極顯著（圖中以**表示），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用單因素方差分析（ANOVA）確定。

2 結(jié)果與討論

2.1 原兒茶酸抑菌活性分析

2.1.1 原兒茶酸的MIC及敏感性分析

當(dāng)原兒茶酸的濃度低于2 mg/mL時(shí)，副溶血弧菌經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)均進(jìn)行了不同程度的增殖，培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁；當(dāng)原兒茶酸的濃度達(dá)到或高于2 mg/mL時(shí)，副溶血弧菌經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)液澄清透亮，與未接種細(xì)菌的空白組基本相同?？梢?jiàn)，原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌的MIC為2 mg/mL。從圖1可知，當(dāng)原兒茶酸濃度為1/4 MIC時(shí)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化；當(dāng)原兒茶酸濃度為1/2 MIC時(shí)，加樣孔周?chē)?xì)菌生長(zhǎng)減少；當(dāng)原兒茶酸濃度達(dá)到MIC時(shí)，抑菌圈直徑為18.37 mm，此時(shí)加樣孔周?chē)匆?jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)。原兒茶酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌的MIC分別為3.0、0.9、1.25 mg/mL[18,19]，對(duì)阪崎腸桿菌ATCC29544、ATCC29004、ATCC12868、12-2的MIC分別為5、5、5和2.5 mg/mL[9]?？梢?jiàn)，原兒茶酸對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌都具有抑菌作用，但對(duì)于不同菌種或同一菌種不同菌株的抑菌活性不盡相同。

2.1.2 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌生長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，對(duì)照組中副溶血弧菌迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至8 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期，生長(zhǎng)趨緩；培養(yǎng)12 h后OD600值為1.06。原兒茶酸的濃度大于或等于2 mg/mL時(shí)，副溶血弧菌在整個(gè)檢測(cè)周期中未見(jiàn)增殖。當(dāng)原兒茶酸的濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，副溶血弧菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間明顯滯后，在整個(gè)生長(zhǎng)周期中的菌體濃度均低于對(duì)照組，9 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)12 h后OD600為0.86；當(dāng)原兒茶酸濃度為0.5、0.25、0.125 mg/mL時(shí)，培養(yǎng)物OD600分別為0.99、0.96、0.99，與對(duì)照組相比不存在顯著差異。進(jìn)一步證明原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌的MIC為2 mg/mL。

2.2 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌細(xì)胞膜的影響

2.2.1 原兒茶酸對(duì)核酸、蛋白質(zhì)泄漏的影響

細(xì)胞膜參與細(xì)菌的能量轉(zhuǎn)換、信號(hào)傳遞和物質(zhì)運(yùn)輸[20]，并能有效防止核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子從胞內(nèi)泄漏至胞外。從圖3a可知，沒(méi)有添加原兒茶酸的副溶血弧菌在培養(yǎng)3 h后的胞外核酸量與0 h基本相同，而經(jīng)不同濃度原兒茶酸處理的副溶血弧菌胞外核酸量則顯著上升，且隨著濃度的增加而增高，在經(jīng)過(guò)MIC濃度的原兒茶酸處理3 h后，細(xì)菌培養(yǎng)液上清中的核酸含量達(dá)到2187.28 ng/mL，為對(duì)照組的2.65倍。同樣地，原兒茶酸處理后副溶血弧菌胞外總蛋白的含量隨其添加量的增加而升高，當(dāng)用MIC濃度原兒茶酸處理3 h后，胞外總蛋白含量達(dá)到34.28 mg/mL，為對(duì)照組的1.94倍（圖3b）。此外，利用SDS-PAGE對(duì)不同濃度原兒茶酸處理后的細(xì)菌胞外總蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3c所示，處理組和對(duì)照組均出現(xiàn)明顯的條帶，與對(duì)照組相比，當(dāng)原兒茶酸濃度增大時(shí)，分子量在10、25、33、40 ku附近的蛋白質(zhì)條帶變化不明顯，說(shuō)明原兒茶酸對(duì)小分子量蛋白質(zhì)泄漏的影響不大，但當(dāng)原兒茶酸的濃度增加到1/2 MIC和MIC時(shí)，蛋白條帶顏色加深，尤其是分子量在95～180 ku范圍附近的條帶，表明大分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯的泄漏。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是具有選擇透過(guò)性的細(xì)胞膜在原兒茶酸作用后發(fā)生了破損，失去了原有的選擇透過(guò)性，使得除了菌體正常外泌的蛋白外，胞內(nèi)的大量蛋白外泄。賈振宇等[9]報(bào)道原兒茶酸可降低阪崎腸桿菌細(xì)胞膜的完整性和通透性，從而起抑制其生長(zhǎng)。朱金帥等[19]發(fā)現(xiàn)MIC濃度下的沒(méi)食子酸可以顯著提高腐敗希瓦氏菌胞外核酸和總蛋白的含量。

2.2.2 原兒茶酸對(duì)丙二醛含量的影響

丙二醛是細(xì)胞膜脂質(zhì)代謝的特征終產(chǎn)物之一，可作為脂質(zhì)過(guò)氧化評(píng)價(jià)的重要參考指標(biāo)。如圖4所示，沒(méi)有添加原兒茶酸的副溶血弧菌在培養(yǎng)3 h后的丙二醛含量較0 h略有上升，在經(jīng)1/4 MIC原兒茶酸處理后，丙二醛的含量為對(duì)照組的1.59倍；而經(jīng)不同濃度原兒茶酸處理的副溶血弧菌胞外核酸量則顯著上升，且隨著濃度的增加而增高，當(dāng)濃度達(dá)到1/2 MIC時(shí)，副溶血弧菌培養(yǎng)液上清中的丙二醛含量顯著上升，為對(duì)照組的3.80倍；在原兒茶酸濃度達(dá)到MIC時(shí)，丙二醛含量達(dá)到1.40 nmol/mL，為對(duì)照組丙二醛含量的10.05倍。原兒茶酸能夠攻擊細(xì)胞膜上游離的自由電子，破壞氧自由基反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)活性氧（ROS）產(chǎn)生，形成氧自由基連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，產(chǎn)生過(guò)量丙二醛[21]?？梢?jiàn)，原兒茶酸可引起副溶血弧菌細(xì)胞膜的氧化損傷，且損傷程度隨著原兒茶酸濃度的增加而增強(qiáng)。

2.2.3 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌形態(tài)的影響

如圖5所示，未經(jīng)原兒茶酸處理的副溶血弧菌形態(tài)飽滿，表面光滑。經(jīng)1/4 MIC濃度的原兒茶酸處理后副溶血弧菌菌體未見(jiàn)明顯變化，依舊能維持正常形態(tài)。經(jīng)1/2 MIC濃度的原兒茶酸濃度處理后，部分菌體開(kāi)始發(fā)生皺縮，表面變得粗糙。在MIC濃度原兒茶酸處理后，副溶血弧菌出現(xiàn)集聚，菌體發(fā)生嚴(yán)重內(nèi)陷，已不能維持細(xì)菌正常的形態(tài)。在2 MIC濃度原兒茶酸處理后，副溶血弧菌嚴(yán)重干癟并且發(fā)生破裂，失去原本的形態(tài)，可見(jiàn)原兒茶酸主要通過(guò)影響細(xì)胞膜的完整性破壞副溶血弧菌的正常細(xì)菌形態(tài)。

目前，植物多酚的抑菌機(jī)制主要有：一是破壞細(xì)胞壁的完整性和細(xì)胞膜的通透性，影響細(xì)胞的正常形態(tài)；二是通過(guò)去極化或超極化方式，影響細(xì)胞膜電位；三是影響細(xì)菌的能量代謝；四是抑制生物大分子的合成[22]。然而，由于植物多酚成分復(fù)雜且受試菌不盡相同，我們難以從某一方面深入闡明植物多酚的抑菌機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸能夠使細(xì)胞壁凹陷、坍塌，影響細(xì)胞膜的完整性和通透性，進(jìn)而破壞細(xì)胞的正常形態(tài)，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子的泄漏。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)，原兒茶酸能直接作用于DNA，抑制基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯，干擾核酸和蛋白質(zhì)正常代謝[23,24]，但原兒茶酸是否會(huì)對(duì)副溶血弧菌基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生影響，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌毒力衰減作用

2.3.1 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌胞外多糖合成的影響

胞外多糖是細(xì)菌生物被膜的重要組分，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)。從圖6可以看出，副溶血弧菌胞外多糖產(chǎn)量隨著原兒茶酸濃度的增加而減少。當(dāng)原兒茶酸濃度分別達(dá)到1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時(shí)，其對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的抑制率分別為22.30%、40.57%和52.85%，與對(duì)照組相比，均存在顯著差異性，說(shuō)明原兒茶酸能夠降低副溶血弧菌胞外多糖的含量。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，植物精油（如檸檬醛）通過(guò)抑制相關(guān)調(diào)控基因VPA1406的表達(dá)降低副溶血弧菌胞外多糖的合成，在檸檬醛濃度為1/2 MIC時(shí)VPA1406的表達(dá)下調(diào)了7.80倍[25]。

2.3.2 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌胞外蛋白酶的影響

堿性絲氨酸蛋白酶是副溶血弧菌胞外蛋白酶的主要成分，也是副溶血弧菌在感染、侵襲宿主過(guò)程中發(fā)揮重要作用的外毒素之一。由圖7可知，在沒(méi)有添加原兒茶酸的對(duì)照組中，上清液與底物反應(yīng)后形成明顯的藍(lán)色，即副溶血弧菌可產(chǎn)生大量的胞外堿性絲氨酸蛋白酶。當(dāng)原兒茶酸濃度分別為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時(shí)，對(duì)胞外蛋白酶的抑制率分別為14.85%、19.79%和28.38%，與對(duì)照組相比均存在顯著性差異。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)香草酸可通過(guò)抑制群體感應(yīng)中樞元件LuxR的表達(dá)而抑制堿性絲氨酸蛋白酶合成[26]。副溶血弧菌胞外蛋白酶以及其他毒力因子受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的緊密調(diào)控，而許多植物提取物中的酚類(lèi)物質(zhì)都證明具有抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用，如干擾信號(hào)分子的合成或抑制群體感應(yīng)元件的表達(dá)[27]。后期可深入研究原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的作用。

2.3.3 原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌生物被膜形成的影響

生物被膜是由細(xì)菌及其分泌的胞外多糖、蛋白、核酸等共同組成的具有一定三維結(jié)構(gòu)的復(fù)合物，有助于包裹在其中的細(xì)菌抵抗抑菌劑的抑制作用，提高細(xì)菌的環(huán)境耐受性[28]。由圖8可知，在沒(méi)有添加原兒茶酸的對(duì)照組中，副溶血弧菌可以形成一圈明顯的生物被膜，而在添加了原兒茶酸后，其被膜量明顯減少。當(dāng)原兒茶酸濃度為1/8 MIC、1/4 MIC和1/2 MIC時(shí)，其對(duì)副溶血弧菌生物被膜的抑制率分別為22.37%、26.04%和34.69%，與對(duì)照組相比均存在顯著性差異?？梢?jiàn)，原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌生物被膜的形成具有明顯的抑制作用，且隨濃度的增加而增強(qiáng)。生物被膜的形成一般需要經(jīng)過(guò)5個(gè)階段：第一階段是微生物在基質(zhì)表面建立可逆的吸附作用；第二階段是微生物分泌聚合物使其牢固黏附于基質(zhì)表面；第三階段是細(xì)菌在基質(zhì)表面生長(zhǎng)，形成不成熟的被膜；第四階段是細(xì)菌持續(xù)生長(zhǎng)形成具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的成熟生物被膜；第五階段是三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，沿四周不斷延展形成新的生物被膜[29]。Bernal-Mercado等[30]報(bào)道兒茶素、原兒茶酸和香草酸的混合物可以有效地阻止大腸桿菌細(xì)胞在基質(zhì)表面的吸附，清除不成熟的被膜。原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌生物被膜的抑制作用主要在哪個(gè)階段進(jìn)行以及對(duì)成熟的生物被膜是否具有清除作用尚不明確，也未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，后續(xù)可以考慮設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更為深入的探究。

3 結(jié)論

原兒茶酸對(duì)副溶血弧菌具有一定的抑菌活性和減毒作用，其最小抑菌濃度為2 mg/mL，且主要作用于細(xì)胞膜。原兒茶酸能促使細(xì)胞膜發(fā)生凹陷、坍塌，影響細(xì)胞膜的完整性和通透性，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)泄漏至胞外，破壞細(xì)胞正常形態(tài)，并引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖受阻，最終導(dǎo)致其凋亡。在亞抑菌濃度下，原兒茶酸能明顯抑制副溶血弧菌胞外多糖、胞外蛋白酶和生物被膜的合成，具有良好的毒力衰減作用。