免疫親和柱凈化-高效液相色譜技術(shù)檢測食品中嘔吐毒素的方法優(yōu)化

胡 云，鄒勇平，王 帥，周元元，梁志春，周可欣

（揚(yáng)州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇揚(yáng)州 225000）

嘔吐毒素是鐮刀屬真菌污染玉米、小麥等谷物 后產(chǎn)生的具有一定毒性的真菌毒素[1]，高劑量暴露后會引起拒食、嘔吐和免疫功能抑制等癥狀[2]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)對食品中嘔吐毒素的限量要求有著嚴(yán)格的規(guī)定[3]。食品中嘔吐毒素的檢測方法較多，有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法等，其中液相色譜法因具有操作簡便、定量準(zhǔn)確、效率高等優(yōu)點，是檢驗檢測機(jī)構(gòu)最常用的毒素檢測方法[4]。本實驗對小麥粉、醋和黃酒中嘔吐毒素的凈化方法和液相色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的食品中嘔吐毒素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

小麥粉、醋、黃酒均購于超市；嘔吐毒素免疫親和柱：3 mL/支，美國Romer labs 公司；934-AH玻璃纖維濾紙，英國Whatman 公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈，色譜純，默克；聚乙二醇，化學(xué)純，國藥；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，分析純，國藥；超純水，由Milli-Q 超純水機(jī)制備；嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（197.2 mg·L-1）；溶劑（甲醇），色譜級，安譜。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜儀（配置DAD 檢測器），美國Agilent 公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore公司；S210-K 酸度計，美國METTLER TOLEDO公司；XSR204 電子分析天平，美國METTLER TOLEDO 公司；AH40 全自動均質(zhì)器，睿科集團(tuán)股份公司；Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀，?？萍瘓F(tuán)股份公司；Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀，睿科集團(tuán)股份公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 前處理方法

（1）提取。①小麥粉。稱取小麥粉25 g 于均質(zhì)瓶中，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111——2016）的方法[4]，加入5 g 聚乙二醇和100 mL 水，于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s，立刻轉(zhuǎn)移至離心管中，于6 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)玻纖濾紙過濾后備用。②醋。稱取醋25 g，滴加50%（v/v）氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.0，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111——2016）的方法[4]，加入5 g 聚乙二醇，水定容至100 mL，混勻，全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中，于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s，立刻用玻纖濾紙過濾后備用。③黃酒。稱取黃酒20 g，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》（GB 5009.111——2016）的方法[4]，加入1 g 聚乙二醇，水定容至25 mL，混勻，全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中，于20 000 r·min-1高速均質(zhì)150 s，立刻用玻纖濾紙過濾后備用。

（2）凈化。將冷藏的嘔吐毒素免疫親和柱取出放置至室溫，吸取2.0 mL 備用的濾液，以1.0 mL·min-1的速度通過免疫親和柱，先用5 mL PBS（pH=7.0）淋洗，再用5 mL 水淋洗，淋洗速度2.0 mL·min-1，直至淋洗液全部通過免疫親和柱，吹干柱體至無殘留淋洗液，將1.5 mL 甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次低速洗脫，收集全部洗脫液。

（3）濃縮。將洗脫液置于45 ℃的水浴中，以 0.5 L·min-1的氮氣吹至近干，流動相定容至1.0 mL，濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.3.2 液相色譜條件

色 譜 柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），美國Agilent 公司；流動相：乙腈∶水=10 ∶90；流速：0.8 mL·min-1，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：50 μL；檢測波長：218 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取5 μL、10 μL、25 μL、50 μL、100 μL和250 μL 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于10 mL 容量瓶中，流動相定容至刻度，配制得98.6 ng·mL-1、197.2 ng·mL-1、493.0 ng·mL-1、986.0 ng·mL-1、1 972.0 ng·mL-1和 4 930.0 ng·mL-1的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件和色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)化免疫親和柱的凈化條件

研究嘔吐毒素的甲醇洗脫曲線，用2.0 mL 甲醇洗脫柱載量為1 084.6 ng 的嘔吐毒素，分4 次每次以0.5 mL·min-1的流速向免疫親和柱中注入0.5 mL 甲醇，等待10 s，注入和等待期間不使甲醇流出，然后以0.5 mL·min-1的流速洗脫，待此部分甲醇全部流出后，進(jìn)行下一次洗脫，直至使全部的2.0 mL 甲醇洗脫液流出。此方法的嘔吐毒素洗脫情況見圖1。由圖1 可知，第1 次、第2 次和第3 次的甲醇洗脫液中嘔吐毒素的量分別為29.1 ng、839.0 ng 和201.0 ng，第4 次的甲醇洗脫液中沒有檢測到嘔吐毒素，洗脫液中嘔吐毒素的總量為1 069.1 ng，柱回收達(dá)到98.6%，可見，使用1.5 mL 甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3次洗脫，能得到理想的柱回收效果。

圖1 甲醇低流速分次洗脫時嘔吐毒素的分布情況

將12.4 ng、19.7 ng、25.0 ng、49.3 ng、 98.6 ng、197.2 ng、256.4 ng、295.8 ng、493.0 ng、754.3 ng、1 005.7 ng、1 104.3 ng、1 202.9 ng、 1 301.5 ng、1 672.3 ng、1893.1 ng、1 991.7 ng、2 090.3 ng、2 253.0 ng、2 353.0 ng、2 504.0 ng、 2 997.4 ng、4 003.2 ng 和5 008.9 ng 的嘔吐毒素分別加載到免疫親和柱，考察柱回收率，結(jié)果見圖2。當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在12.4 ～2 504.0 ng 時，柱回收率在82.6%～103.2%，柱效較高，當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在2 997.4 ng 時，柱回收率在78.3%，柱效開始降低，當(dāng)嘔吐毒素的載柱量在5 008.9 ng 時，柱回收率已持續(xù)降低至52.9%。由于嘔吐毒素在自然界中的污染率較高，含量也高，高濃度的嘔吐毒素應(yīng)在載柱前進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

圖2 嘔吐毒素免疫親和柱柱效（12.4 ～5 008.9 ng）

2.1.2 優(yōu)化色譜條件

以甲醇∶水=20 ∶80 的流動相進(jìn)行分析，免疫親和柱凈化后的嘔吐毒素在色譜分離的過程中仍存在雜質(zhì)峰的干擾，改用乙腈∶水=10 ∶90 的流動相進(jìn)行分析，色譜基線更平穩(wěn)，嘔吐毒素色譜峰的峰型得到了改善，與雜質(zhì)峰能實現(xiàn)有效分離，與TAN等[5]的實驗結(jié)果一致，因此，實驗選擇以乙腈∶水=10 ∶90 的流動相分析嘔吐毒素。

2.2 方法的線性范圍與檢出限、定量限

嘔 吐 毒 素 在98.6 ～4 930.0 ng·mL-1的 濃 度 范圍內(nèi)，校正曲線y=0.063 35x-0.815 90，相關(guān)系數(shù)為0.999 921。用實驗方法檢測小麥粉、醋和黃酒中的嘔吐毒素，檢出限分別為1.2 μg·kg-1、1.2 μg·kg-1和4.2 μg·kg-1，定 量 限 分 別 為4 μg·kg-1、4 μg·kg-1和14 μg·kg-1，低于國家標(biāo)準(zhǔn)中50 ～100 μg·kg-1的檢出限，100 ～200 μg·kg-1的定量限，說明實驗采用的方法具有較高的檢測靈敏度。

2.3 方法的加標(biāo)回收率與精密度

以標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的定量限、標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間點和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的最高殘留限量（標(biāo)準(zhǔn)沒有規(guī)定的，則選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度較高的點）進(jìn)行3 水平的加標(biāo)回收試驗[3-4,6]，每個水平重復(fù)6 次，計算平均加標(biāo)回收率和實驗室內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果見表1。小麥粉、醋、黃酒中嘔吐毒素的3 水平加標(biāo)平均回收率在84.3%～104.7%，實驗室內(nèi)變異系數(shù)在0.3%～5.5%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗方法確認(rèn)的技術(shù)要求[6]。其中，小麥粉的嘔吐毒素3 水平加標(biāo)平均回收率較低，變異系數(shù)較高，主要是因為小麥粉為固體粉末狀，嘔吐毒素在其中分布的均勻度不及醋和黃酒。3 種食品中均檢出了嘔吐毒素，小麥粉中的嘔吐毒素源自小麥在生長期受到的鐮刀屬真菌的污染，黃酒和醋中的嘔吐毒素源自生產(chǎn)原料中含有受鐮刀屬真菌污染的麥麩[7]，由于國家標(biāo)準(zhǔn)并未對黃酒和醋中的嘔吐毒素規(guī)定限量要求，因此，有必要對市場上的醋和黃酒進(jìn)行嘔吐毒素的風(fēng)險監(jiān)測和分析評估。

表1 樣品中嘔吐毒素的加標(biāo)回收率及實驗室內(nèi)變異系數(shù)

2.4 方法的準(zhǔn)確度

對嘔吐毒素特性值為1 303 μg·kg-1，特性值區(qū)間為1 043 ～1 563 μg·kg-1的小麥粉質(zhì)控樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果為1 320 μg·kg-1，說明本試驗采用的檢測方法準(zhǔn)確度高，適用于食品中嘔吐毒素的檢測。

3 結(jié)論

實驗優(yōu)化了食品中嘔吐毒素的免疫親和柱的凈化方法和色譜分離方法，方法靈敏度高，檢出限和定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法，定量結(jié)果準(zhǔn)確。實驗使用了自動化程度高的均質(zhì)器、固相萃取儀和平行濃縮儀，在提高工作效率的同時，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性也得到了提升。綜上，本方法適用于食品中嘔吐毒素含量的檢測。嘔吐毒素主要存在于谷物和谷物產(chǎn)品中[8]，但是，以被嘔吐毒素污染的谷物為原料的發(fā)酵產(chǎn)品（如啤酒）的安全性也受到了越來越多的關(guān)注[9]，因此，鑒于我國國家標(biāo)準(zhǔn)目前沒有對這類食品中的嘔吐毒素規(guī)定限量要求，今后對這類食品中嘔吐毒素的污染水平有必要進(jìn)行風(fēng)險監(jiān)測和安全性 評估。